專利名稱：一種簡易、快速、靈敏的東海原甲藻現(xiàn)場檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種簡易、快速、靈敏的東海原甲藻現(xiàn)場檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻類(主要原因種)、原生動物和細(xì)菌的過度繁殖或聚集造成海水變色的現(xiàn)象。近年來，由于人類活動的加劇，海洋日趨富營養(yǎng)化，導(dǎo)致赤潮頻發(fā)，并已成為一種全球性的生態(tài)災(zāi)害，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、捕撈業(yè)和濱海旅游業(yè)造成了巨大損失，同時也給海洋生態(tài)環(huán)境帶來負(fù)面影響，甚至直接威脅人類健康。有害赤潮在我國呈現(xiàn)出爆發(fā)次數(shù)增多、面積擴大、持續(xù)時間延長和危害加劇的趨勢。如在2004年我國爆發(fā)赤潮的次數(shù)就達120次，特別是1998— 2000年連續(xù)3年我國的東海就曾發(fā)生過由東海原甲藻引起的面積達上千平方公里的特大赤潮，為世界罕見，因此，赤潮引起了公眾和政府的高度重視。對赤潮原因種(包括東海原甲藻)進行正確鑒定是研究、認(rèn)識和防治其引起的赤潮的前提和基礎(chǔ)，同時更應(yīng)建立簡單、快速和特異性強的檢測方法，監(jiān)測赤潮高發(fā)區(qū)的水環(huán)境，對可能爆發(fā)的有害赤潮進行預(yù)警，特別是指導(dǎo)漁業(yè)生產(chǎn)者及時采取應(yīng)對措施，以減少經(jīng)濟損失。當(dāng)前，對自然水樣中的赤潮藻(包括東海原甲藻)的檢測的傳統(tǒng)方法，主要是以其分類學(xué)特征為基礎(chǔ)，借助光鏡和電鏡對其細(xì)胞形態(tài)特征進行觀察，并最終對其進行鑒定。最近，分子生物學(xué)技術(shù)為赤潮藻的鑒定提供了新思路。赤潮藻的分子檢測技術(shù)以藻細(xì)胞的基因組核糖體DNA (rDNA)為靶目標(biāo)，其主要原因是藻類基因相對恒定，不會像其表觀形態(tài)特征隨環(huán)境條件的不同而發(fā)生變化。因此，其可克服形態(tài)學(xué)鑒定法的缺點，具有特異性強，檢測迅速的特點。近年來，出現(xiàn)了大量有關(guān)赤潮藻分子檢測方法，包括DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)>隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD) (random amplified polymorphic DNA)、全細(xì)胞突光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、實時突光定量PCR和三明治雜交(sandwich hybridization, SHA)等。而建立的東海原甲藻的分子檢測技術(shù)主要包括基于核酸熒光探針和熒光抗體探針的FISH、實進定量PCR及SHA等?？梢?，當(dāng)前還沒有一項赤潮藻的現(xiàn)場檢測技術(shù)，也沒有赤潮藻的便攜式檢測試劑盒的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供一種能快速現(xiàn)場檢測自然水樣中東海原甲藻的便攜式試劑盒，該檢測試劑盒主要是基于核酸(rRNA)的反轉(zhuǎn)錄及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)原理制成。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種簡易、快速、靈敏的東海原甲藻現(xiàn)場檢測試劑盒，由以下試劑組成⑴試劑A為自然樣品核酸粗提試劑，其組成為2% (m/v) CTAB, 0. 5% (ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNase Inhibitor ；(2)試劑B為反轉(zhuǎn)錄特異性引物溶液，其濃度為10 ymol/L ;核酸序列為5’-CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)試劑 C 為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 I，其組成為142.86 mM Tris-HCl; 214.29 mM KCl;8. 57 mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)試劑 D 為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 II，其組成為20 U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)試劑E為核酸擴增反應(yīng)液I，組成為(5.1)內(nèi)部引物濃度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG-3’，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物濃度0. 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5，-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) O. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M 甜菜堿;(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4) 2S04, 2. 17 mM MgSO4, 0. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)試劑 F 為核酸擴增反應(yīng)液 II,即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase largefragment ； (7)試劑 G 為顯色液 GeneFinder ；(8)對照(8.1)陽性對照檢測樣品東海原甲藻的總RNA ；(8. 2)陰性對照檢測樣品赤潮異灣藻的總RNA。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明存在以下有益效果(I)無需特殊的設(shè)備，可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測現(xiàn)有的分子檢測方法必須借助特別的實驗儀器，如DNA測序需要PCR儀和測序儀，限制性片段長度多態(tài)性和隨機擴增多態(tài)性DNA需要DNA電泳儀，全細(xì)胞熒光原位雜交需要熒光顯微鏡，實時熒光定量PCR需要熒光定量PCR儀，三明治雜交需要酶標(biāo)儀等，這就使得這些檢測方法必須在實驗室才能完成，無法對自然水體中的赤潮藻進行現(xiàn)場檢測；而本檢測試劑盒只需要簡易的設(shè)備，適宜用于現(xiàn)場檢測。(2)檢測方法簡單現(xiàn)有分子技術(shù)檢測操作復(fù)雜，對檢測人員的技術(shù)要求高，本操作試劑盒只需按說明書操作即可，適宜于推廣應(yīng)用。(3)檢測靈敏度高在進行核酸擴增(環(huán)介等溫擴增)之前，多了一步核酸的反轉(zhuǎn)錄步驟，因此其檢測靈敏度較其它分子檢測方法靈敏度高。


圖1為本發(fā)明試劑盒的檢測效果圖，注PC，陽性對照；NC，陰性對照，1—10，陽性結(jié)果。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。1.試劑盒組成(I)試劑A為自然樣品核酸粗提試劑，其組成為2% (m/v) CTAB, 0.5% (v/V) β -mercaptoethanol,1. 4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNaseInhibitor ；(2)試劑B為反轉(zhuǎn)錄特異性引物溶液，其濃度為10 ymol/L;核酸序列為5’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)試劑 C 為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 I，其組成為142.86 mM Tris-HCl; 214.29 mM KCl;8. 57 mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)試劑 D 為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 II，其組成為20 U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)試劑E為核酸擴增反應(yīng)液I，組成為(5.1)內(nèi)部引物濃度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG-3’，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物濃度0· 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5’-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) O. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M 甜菜堿；(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4) 2S04, 2. 17 mM MgSO4, 0. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)試劑 F 為核酸擴增反應(yīng)液 II,即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase largefragment ；(7)試劑 G 為顯色液 GeneFinder ；(8)對照(8.1)陽性對照檢測樣品東海原甲藻的總RNA ；(8. 2)陰性對照檢測樣品赤潮異灣藻的總RNA。2、本檢測試劑盒的使用操作步驟(I)水樣的采集及藻細(xì)胞的過濾采集自然水樣，混勻，用5 mL—次性滅菌針頭吸取檢測樣品，將濾膜(孔徑0.45 μ m，直徑13 mm)安置于過濾器上，手推過濾；(2)洗膜及膜的簡切處理用針頭吸取去離子水，將含有藻細(xì)胞的濾膜洗滌2次，將濾膜從過濾器取下，用滅菌的剪刀將其剪成碎屑，并用鑷子將膜碎屑放入1. 5 mL離心管中；(3) RNA粗提液的制備用槍頭吸取50 - 100 μ L試劑A加入到離心管中，短暫離心后，于渦旋振蕩器上劇烈 振蕩至少5 min，并經(jīng)短暫離心，上清液即為RNA粗提液；(4)反轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板(對照實驗從此步做)吸取(4)制備的RNA粗提液(陽性對照和陰性對照模板)5 μ L到200 μ L離心管中，并加入I μ L試劑B，短暫離心混勻，水浴鍋70°c溫育10 min后，立即冰浴至少2 min ;在上述反應(yīng)液中加入3. 5 μ L試劑C和
0.5 “1^試劑0，短暫離心后，置于421反應(yīng)1 h，再經(jīng)70°C變性15 min后，立刻冰浴，制得cDNA模板；(5)核酸擴增反應(yīng)在200 μ L離心管中分別加入23 μ L試劑Ε、1 μ L平共處(5)制備的cDNA模板和I 4 1^試劑？，離心混勻，在651反應(yīng)I h，并80°C處理10 min結(jié)束反(6)顯色反應(yīng)在上述反應(yīng)管中加入O. 4 μ L試劑G，振蕩混勻，肉眼觀察結(jié)果。(7)結(jié)果判讀(參照圖1):參照陰性和陽性對照結(jié)果進行檢測樣品的叛讀，其中陽性對照反應(yīng)液呈綠色(PC)、陰性對照反應(yīng)液呈橙黃色(NC)，如果測試反應(yīng)管顯綠色(同陽性對照)則表明水樣中有東海原甲藻的存在，如果測試反應(yīng)管管呈橙黃色(同陰性對照)，則表明水樣中無東海原甲藻的存在。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬 于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種簡易、快速、靈敏的東海原甲藻現(xiàn)場檢測試劑盒，其特征在于，由以下試劑組成(1)試劑A為自然樣品核酸粗提試劑，其組成為2% (m/v) CTAB, 0.5% (v/V) β -mercaptoethanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNaseInhibitor ；(2)試劑B為反轉(zhuǎn)錄特異性引物溶液，其濃度為10ymol/L;核酸序列為5’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)試劑C為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液I，其組成為142.86mM Tris-HCl, 214.29 mM KCl; 8.57mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)試劑D為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液II，其組成為20U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)試劑E為核酸擴增反應(yīng)液I，組成為(5.1)內(nèi)部引物濃度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG -3，，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物濃度0. 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5，-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) 0. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M舌甘菜堿；(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4)2S04, 2. 17 mM MgSO4, O. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)試劑F 為核酸擴增反應(yīng)液 II，即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase large fragment ；(7)試劑G為顯色液GeneFinder ；(8)對照:(8.1)陽性對照檢測樣品東海原甲藻的總RNA ；(8. 2)陰性對照檢測樣品赤潮異灣藻的總RNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡易、快速、靈敏的東海原甲藻現(xiàn)場檢測試劑盒。所述的試劑盒由自然樣品核酸粗提試劑、反轉(zhuǎn)錄特異性引物溶液、反轉(zhuǎn)錄溶液、核酸擴增反應(yīng)液、核酸擴增引物及顯色液等組成。該檢測試劑盒的檢測原理是以藻細(xì)胞的rRNA為靶序列，通過核酸的反轉(zhuǎn)錄制備模板，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增靶序列。試劑盒的檢測過程只需簡易的設(shè)備，檢測快速，檢測結(jié)果可通過肉眼直接進行判斷，且具有較高的靈敏度，可用于日常水環(huán)境的現(xiàn)場檢測，對東海原甲藻赤潮的預(yù)警有一定的實用價值。
文檔編號C12Q1/04GK103060454SQ20131001093
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者陳國福, 張春云 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)