專利名稱：一種檢測利瑪原甲藻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體為檢測利瑪原甲藻的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)階段，我國對有害藻類的認(rèn)識多側(cè)重在浮游藻類，而對底棲藻類的研究工作還處于起始階段，這就使得在過去的近岸海域生態(tài)調(diào)查時(shí)對底棲藻類鮮有記錄。但是，隨著我國有毒有害赤潮頻發(fā)，使得水產(chǎn)品品質(zhì)受到損害，食品安全問題成為人們首要關(guān)心的問題。 由于便于培養(yǎng)及所分泌的毒素易制作成標(biāo)準(zhǔn)品，產(chǎn)毒底棲甲藻利瑪原甲藻成為研究人員研究產(chǎn)毒藻類的重點(diǎn)內(nèi)容。利瑪原甲藻常附生于大型海藻、海草、底層沉積物表面，以及珊瑚礁或紅樹林區(qū)域的浮砂碎石上，有著不同于浮游藻類的生態(tài)習(xí)性。它呈世界性分布，在我國南海海域也有報(bào)道。王朝暉等曾于1997年秋至1998年春對廣東沿海多次赤潮進(jìn)行研究時(shí)，在珠海附近的米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)赤潮發(fā)生區(qū)域的底層水樣中檢測出大量利瑪原甲藻，濃度約為800Cells/L。利瑪原甲藻能夠產(chǎn)生包括OA(Okadaic Acid) 和 DTX-I (Dinophysistoxin-I)等在內(nèi)的多種腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)。腹瀉性貝類毒素一般以貝類作為載體，被濾食后在貝類體內(nèi)富集， 再通過食物鏈傳遞被人類或動物吸收，直接威脅到人類及動物的健康，甚至生命。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它能致使腸黏膜損傷，在一定程度上促進(jìn)腫瘤并發(fā)。腹瀉性貝類毒素同西加魚毒(Ciguatera Fish Poisoning，CFP)、神經(jīng)毒性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning,NSP)等一樣，屬于聚酮類化合物。這類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，構(gòu)型變化較多，主要由聚酮合酶(Polyketide Synthetase,PKS)催化形成。研究發(fā)現(xiàn)聚酮合酶以三種基本類型出現(xiàn)，而第一類型(Type I )為多功能酶，由單一蛋白基團(tuán)及其周圍功能區(qū)域構(gòu)成，是目前研究最為深入的類型。但它是否存在于甲藻中還有爭議，但依據(jù)對聚酮合酶基因的研究來看， 其在一些產(chǎn)DSP毒素的甲藻中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)在甲藻體外共生菌體內(nèi)不存在。本發(fā)明是在此基礎(chǔ)上，篩選利瑪原甲藻中存在的聚酮合酶基因，克隆及測序后，設(shè)計(jì)特異引物及探針，并連同針對其rDNA ITS(ITSl-5. 8S rRNA_ITS2)序列設(shè)計(jì)的特異引物和探針，初步建立雙TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法檢測利瑪原甲藻。TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR技術(shù)相比存在許多優(yōu)勢，它無需借助凝膠電泳或銀染獲取檢測結(jié)果， 可直接通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)探測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的變化得以知曉檢測結(jié)果；而且， 它較雙鏈DNA內(nèi)嵌染料(如STOR green)定量PCR技術(shù)無法區(qū)分特異性和非特異性產(chǎn)物而言，TaqMan探針具有很高的特異性、信噪比，且可以進(jìn)行多重檢測。正是因?yàn)橐陨咸攸c(diǎn)，它已被研究人員用于部分有害藻類的檢測中。本發(fā)明也是借助該技術(shù)，期望以此可以提高對產(chǎn)毒底棲甲藻的實(shí)際檢測效率和精度，有助于進(jìn)一步實(shí)施在海洋環(huán)境中的檢測，也為建立早期赤潮預(yù)警機(jī)制提供必要支持
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種檢測利瑪原甲藻的方法，實(shí)現(xiàn)定量檢測。技術(shù)方案為針對利瑪原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物和I1aqMan探針，利用實(shí)時(shí)(real-time)PCR方法熒光定量檢測。一種檢測利瑪原甲藻的方法，步驟包括(1)用CTAB改良法提取待測水樣中的利瑪原甲藻的基因組DNA ；(2)用特異性引物和特異性探針，擴(kuò)增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測方法，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測水樣中瑪原甲藻含量；rDNA ITS基因序列的特異性引物為上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；艮口 SEQ ID No. 1 禾口 No. 2 ；PKS基因序列的特異性引物為上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；艮口 SEQ ID No. 3 禾口 No. 4 ；rDNA ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；艮口 SEQ ID No. 5 ；PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac ；艮口 SEQ ID No. 6。步驟⑵中PCR擴(kuò)增的條件為94 96 °C條件下，預(yù)變性1. 5 2. 5min ；循環(huán)溫度，94. 5 95. 50C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec，35 40 次循環(huán)。優(yōu)選的，PKS基因序列的TaqMan探針5’端使用報(bào)告染料FAM標(biāo)記；ITS基因序列的I1aqMan探針5’端使用報(bào)告染料HEX標(biāo)記；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探針 3’端用報(bào)告染料TAMRA標(biāo)記。具體的，步驟O)中可以用單重?zé)晒舛縋CR檢測方法或者雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法。雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法是將PKS基因序列的特異性引物及TaqMan探針、ITS基因序列的特異性引物及TaqMan探針同時(shí)用于擴(kuò)增和檢測模板DNA。單重?zé)晒舛縋CR檢測方法是將PKS基因序列的特異性引物及TaqMan探針、ITS基因序列的特異性引物及TaqMan 探針分別用于擴(kuò)增和檢測模板DNA。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定構(gòu)建方法包括以下步驟以對應(yīng)不同濃度利瑪原甲藻的利瑪原甲藻基因組DNA為模板，分別加入相應(yīng)基因序列的特異性引物和TaqMan探針擴(kuò)增。本發(fā)明可用于底棲甲藻利瑪原甲藻的定量及赤潮快速預(yù)警等領(lǐng)域，克服現(xiàn)有技術(shù)中使用單一分子指標(biāo)時(shí)帶來的檢測誤差，通過雙基因同時(shí)檢測以提高準(zhǔn)確率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果采用TaqMan探針進(jìn)行熒光定量 PCR檢測，針對rDNAITS序列設(shè)計(jì)的探針P-ITS的5’端使用報(bào)告染料FAM標(biāo)記，針對PKS基因設(shè)計(jì)的探針P-PKS的5’端使用報(bào)告染料HEX標(biāo)記，這兩個(gè)TaqMan探針的3’端都以報(bào)告染料TAMRA標(biāo)記。較雙鏈DNA內(nèi)嵌染料(如STORgreen)法無法區(qū)分特異性和非特異性產(chǎn)物而言，TaqMan探針具有很高的特異性、信噪比，且可以進(jìn)行多重檢測；以多個(gè)基因作為分子指標(biāo)，提高了檢測精度，操作簡便，易于掌握，可快速檢測出水體中的利瑪原甲藻。并且， rDNA ITS和PKS探針同時(shí)檢測水環(huán)境中的利瑪原甲藻時(shí)，最低可檢測到1個(gè)藻細(xì)胞，當(dāng)它們分別進(jìn)行檢測時(shí)，最低可檢測到0. 1個(gè)藻細(xì)胞。


圖1為rDNA ITS和PKS基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測圖譜(A和B分別為rDNA ITS和PKS基因常規(guī)PCR擴(kuò)增的檢測結(jié)果；C為實(shí)施例2特異引物擴(kuò)增PKS基因和rDNA ITS 的檢測結(jié)果)圖2為TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線以DNA模板對應(yīng)的藻細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR擴(kuò)增曲線對應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo)，ITS標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y =-3. 085x+36. 84，R2 = 0. 996 ；PKS 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = -3. 075x+33. 59，R2 = 0. 998。圖3為雙重PCR測試中rDNA ITS基因的擴(kuò)增曲線。圖中顯示模板DNA按1 1 1 IO4等五個(gè)稀釋梯度的擴(kuò)增曲線，1 IO5稀釋組未獲得擴(kuò)增結(jié)果。圖4為雙重PCR測試中I3KS基因的擴(kuò)增曲線。圖中顯示模板DNA按1 1 1 IO3 等五個(gè)稀釋梯度的擴(kuò)增曲線，1 IO4和1 IO5兩個(gè)稀釋組未獲得擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利瑪原甲藻DNA提取從培養(yǎng)瓶中取出適量利瑪原甲藻藻液，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。離心收集2ml對數(shù)期藻液，采用CTAB改良法提取DNA 加入0. 7ml CTAB提取液，于65°C條件下溫育一小時(shí)，后加入0. 4ml酚氯仿 異戊醇(PCI，24 24 1)試劑抽提兩次，再加入0.32ml的異丙醇使之沉淀，并用0.5ml 70%乙醇洗滌后，晾干，加入40 μ L超純水，于_20°C環(huán)境中儲存。CTAB提取液的組分包括 3% (w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，1% (W/V)Sark0Syl(肌氨酰)，20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl，0. Imol/L Tris-HCl pH 8. 0,1 % (ν/ν) β-mercaptoethano ( β -巰基乙醇)。實(shí)施例2引物及I1aqMan探針的設(shè)計(jì)根據(jù)測序獲取的rDNAITS和基因信息(常規(guī)的擴(kuò)增引物序列見表1，序列電泳圖見圖I-A和B)，篩選引物并擴(kuò)增利瑪原甲藻的rDNA ITS和PKS基因，得到604bp和678bp 的序列，經(jīng)過克隆后測序獲取基因信息。表1本實(shí)驗(yàn)中用于常規(guī)PCR擴(kuò)增ITS和PKS基因所用引物一覽

權(quán)利要求
1.一種檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用CTAB改良法提取待測水樣中的瑪原甲藻的基因組DNA；(2)用特異性引物和特異性探針，擴(kuò)增利瑪原甲藻的ITS和PKS序列中的至少一種，采用熒光定量PCR檢測方法，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待測水樣中瑪原甲藻含量；ITS基因序列的特異性引物為上游cttggaatggcgcaacaagc，下游 aaaccacaagacacgatgaaacg ；PKS基因序列的特異性引物為上游atccccagcaacgattattaatgg，下游 tgcgtgaaagcgaagagtcc ；ITS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列ccaaacctgccaccgttcctcgct ；PKS基因序列的TaqMan探針包括以下核苷酸序列cggctcgctccaacgcttcccaac0
2.權(quán)利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟( 中94 96°C條件下， 預(yù)變性 1. 5 2. 5min ；循環(huán)溫度，94. 5 95. 5°C IOsec,59. 8 60. 5°C 30sec,35 40 次循環(huán)。
3.權(quán)利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟O)中PKS基因序列的 TaqMan探針5’端使用報(bào)告染料FAM標(biāo)記；ITS基因序列的TaqMan探針5’端使用報(bào)告染料 HEX標(biāo)記；PKS基因序列和ITS基因序列的TaqMan探針3’端用報(bào)告染料TAMRA標(biāo)記。
4.權(quán)利要求1所述檢測利瑪原甲藻的方法，其特征在于，步驟(2)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定構(gòu)建方法包括以下步驟以對應(yīng)不同濃度利瑪原甲藻的利瑪原甲藻基因組DNA為模板，分別加入相應(yīng)的基因序列的特異性引物和TaqMan探針擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，公開一種檢測利瑪原甲藻的方法。具體為，針對利瑪原甲藻的聚酮合酶基因PKS及rDNA ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，利用實(shí)時(shí)(real-time)PCR方法熒光定量檢測。本方法可用于底棲甲藻利瑪原甲藻的定量及赤潮快速預(yù)警等領(lǐng)域，提高了檢測精度，操作簡便，易于掌握，可快速檢測出水體中的利瑪原甲藻。
文檔編號G01N21/64GK102433390SQ20121000513
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者何培民, 唐晨, 董麗, 賈睿, 饒濤 申請人:上海海洋大學(xué)