專利名稱：鑒別和定量口蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的一種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體是ー種鑒別和定量ロ蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的檢測方法。
背景技術(shù)：
ロ蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由ロ蹄疫病毒(FMDV)引起的一種嚴重危害偶蹄動物的疫病，被OIE列為A類傳染病之首。ロ蹄疫病毒培養(yǎng)物中可以分離出不同密度的粒子，主要有四種:完全病毒(146S)、空衣殼(75S)、12S蛋白質(zhì)亞單位(12S)、病毒感染相關(guān)成分(VIA抗原4.5S)。在動物免疫中，刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞有關(guān)的主要是完全病毒顆粒146S抗原,該抗原含有ロ蹄疫病毒所有的中和位點，是ロ蹄疫病毒的有效抗原成分,能刺激機體產(chǎn)生堅強的體液免疫和細胞免疫。ロ蹄疫疫苗中146S抗原的含量直接決定了疫苗的質(zhì)量，因此在國外ロ蹄疫疫苗生產(chǎn)廠家中，ロ蹄疫146S抗原的檢測是重要的一個環(huán)節(jié)，這些廠家一般通過層析的方法提純ロ蹄疫病毒，并使用超速離心對146S抗原進行定量，根據(jù)定量的結(jié)果對病毒液稀釋后做成146S的抗原含量為1 U g/mL 10 ii g/mL成品疫苗，該疫苗可產(chǎn)生良好的免疫效果。用蔗糖密度梯度離心測量法 對146S抗原定量是ー種標準的方法，但是操作較為復(fù)雜，儀器設(shè)備要求較高，不能進行批量的抗原檢測，此外，還可以用蛋白層析分析法、熒光定量PCR和間接夾心Elisa等進行疫苗中抗原含量的定量。自PCR技術(shù)問世以來，國內(nèi)外的研究者開始用該方法來檢測動物不同組織中的FMDV,使檢測的過程大大縮短，準確性進ー步提高。Taqman探針熒光PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)在原理上較SYBR GREEN I更為嚴格，所得數(shù)據(jù)更為準確。國內(nèi)外已經(jīng)有使用熒光RT-PCR檢測FMDV的報道，該技術(shù)以其特異性強、靈敏度高、速度快等優(yōu)點在FMDV定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前FMDV快速檢測的主要方法。由于ロ蹄疫0型、亞洲1型ニ價滅活疫苗以及0型、亞洲I和A型三價滅活苗含有不同型的ロ蹄疫抗原，而蔗糖密度梯度離心測量法只能定量疫苗中各血清型146S抗原的總體含量，而不能很好的將0型、亞洲I型和A型抗原的含量相區(qū)分，為了進一步明確成品疫苗中各型抗原的實際含量情況，需要在現(xiàn)有工作的基礎(chǔ)上，建立一種破乳后水相抗原分型定量的方法，從而完善ロ蹄疫雙價以及多價成品疫苗效力評價標準。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鑒別和定量ロ蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的一種方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)不足，實現(xiàn)破乳后水相抗原分型定量，從而完善ロ蹄疫雙價以及多價成品疫苗效力評價標準。本發(fā)明提供的鑒別和定量ロ蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的ー種方法，通過樣品處理提取疫苗破乳后水相中口蹄疫病毒RNA，應(yīng)用熒光定量PCR檢測方法來擴增樣品中不同血清型的口蹄疫病毒RNA，進行鑒別和定量檢測,其中，O型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO:1 3所示，AsiaI型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQID NO:4 6所示，A型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO:7 9所示。優(yōu)選地，所有探針5’端標記的熒光基團都為FAM，3’端淬滅基團都為TAMAR。優(yōu)選地，以所述口蹄疫病毒RNA為模版，在3個PCR反應(yīng)管中分別加入不同型特異性弓I物和探針，進行RT-PCR擴增?？梢允褂肨AKARA公司的一步法RT-PCR試劑盒進行擴增；提取所述口蹄疫病毒RNA可以包括以下步驟:(I)取100體積份ISA206佐劑乳化的口蹄疫疫苗，放入分液漏斗中，加入10 12體積份分析純正戊醇，充分振蕩I分鐘以上混勻；(2)將分液漏斗放入4° C冰箱，靜置30分鐘以上，可見油、水分離；分離出下層水相，其中含有口蹄疫抗原；(3)取水相，使用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取RNA。優(yōu)選地，所述實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，每條特異性引物和特異性探針終濃度為0.2 μ mol/μ L ；優(yōu)選地，O型和A型口蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄10min，94°C預(yù)變性 2min，94°C變性 5s，55°C退火 30s，40 個循環(huán)。優(yōu)選地，AasiI型口蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄IOmin，94°C預(yù)變性 2min，94°C變性 5s，65°C退火 30s，40 個循環(huán)。優(yōu)選地，進行熒光定量PCR時設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照為定量標準質(zhì)粒，陰性對照為滅菌水，若CT值小于35.0，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結(jié)果；若CT值在35.0 40.0之間，則判定為可疑結(jié)果，重復(fù)檢測一次，若仍在此范圍內(nèi)，則判定為陰性，若無擴增信號，則判定為陰性結(jié)果。優(yōu)選的計算公式如下:O 型定量 PCR 計算公式為:γ=ιο(-3.24χ+44.82)；A 型定量 PCR 計算公式為:γ=10(_3 82χ+53_3 .
AsiaI 型定量 PCR 計算公式為:Υ=10(_3.94χ+54.26)；Y:樣品中抗原拷貝數(shù)X:樣品擴增CT值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:與蔗糖密度梯度離心測量法相比，本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、特異性好、可以分別準確定量樣品中不同型的抗原等特點；本發(fā)明的方法可以同時進行大量樣品的檢測，具有高通量性；與蔗糖密度梯度離心測量法相比，本發(fā)明的方法無需大型貴重的離心設(shè)備，節(jié)省了人力和物力；本檢測方法具有檢測范圍廣的特點，在100 IOltl拷貝范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測范圍可以達到10個數(shù)量級。


圖10型熒光定量PCR標準 曲線；圖2AsiaI型熒光定量PCR標準曲線；
圖3A型熒光定量PCR標準曲線；圖40型熒光定量PCR特異性分析；圖5AsiaI型熒光定量PCR特異性分析；圖6A型熒光定量PCR特異性分析。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的具體實施方式
做進一步說明。其中一種實施方式包括如下步驟:步驟一，檢索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息學(xué)的方法，經(jīng)過比對分析，分別找到O型、亞洲I和A型的特異性保守區(qū)，以保守區(qū)為靶目標，用引物設(shè)計軟件PrimerExpress2.0,設(shè)計不同型的特異性引物和探針,擴增基因片段；步驟二，利用步驟一所得基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒；步驟三，疫苗樣品處理和提取樣品的RNA ；步驟四，按照常規(guī)熒光定量PCR檢測方法檢測疫苗樣品中的抗原含量。步驟一和步驟四中，擴增時所使用的引物和探針為:(I) O型口蹄疫病毒引物和探針

上游引物(SEQID NO:1):5，-AACCCTCGGACGAACATGAC-3，下游引物(SEQID NO:2):5，-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3，探針(SEQID NO:3):FAM_5，-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3，-TAMAR(2) AsiaI型口蹄疫病毒引物和探針上游引物(SEQID NO:4):5’ -CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’下游引物(SEQIDNO:5):5’ -AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’探針(SEQID NO:6):FAM_5，-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3，-TAMAR(3) A型口蹄疫病毒引物和探針上游引物(SEQID NO:7):5，-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3，下游引物(SEQID NO:8):5’ -AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’探針(SEQID NO:9):FAM_5，-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3，-TAMAR步驟二中,所述重組質(zhì)粒使用的載體是pGEM-Teasy。步驟三中，所述的RNA提取方法是使用Invitrogen公司的TRIzol試劑提取，操作步驟按試劑盒說明書進行。步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，O型和A型口蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄lOmin，94°C預(yù)變性2min，94°C變性5s，55°C退火30s，40個循環(huán)；AsiaI型口蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄10min，94°C預(yù)變性2min，94°C變性5s，65°C退火30s，40個循環(huán)。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一,設(shè)計引物和Taqman探針
檢索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息學(xué)的方法，經(jīng)過比對分析，分別找到O型、亞洲I和A型的特異性保守區(qū)，以保守區(qū)為靶目標，用引物設(shè)計軟件PrimerExpress2.0,設(shè)計不同型的特異性引物和探針；探針5'端突光報告基團是FAM, 3'端的熒光淬滅基團為TAMRA。序列如下:(I) O型口蹄疫病毒引物和探針上游引物(SEQID NO:1):5’ -AACCCTCGGACGAACATGAC-3’下游引物(SEQID NO:2):5，-CGATGTTGGCGTACACCTTGAT-3，探針(SEQID NO:3):FAM_5，-TACGACCAGTACAAGGTWCACAA-3，-TAMAR(2) AsiaI型口蹄疫病毒引物和探針上游引物(SEQID NO:4):5’ -CTGCCCACTTCCTTCAACTACG-3’

下游引物(SEQIDNO:5):5’ -AGTATGTTTCCGCACGCTTCA-3’探針(SEQID NO:6):FAM-5，-TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCT-3' -TAMAR(3) A型口蹄疫病毒引物和探針上游引物(SEQID NO:7):5，-CTTCAACTACGGCGCGATTC-3，下游引物(SEQID NO:8):5，-AGAGCTCGGCACGCTTCATG-3’探針(SEQID NO:9):FAM-5’-GCCACGGAGATCCAAGAGCTCCTC-3' -TAMAR步驟二，定量標準質(zhì)粒的構(gòu)建與制備定量標準質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的口蹄疫病毒RNA (O型、A型和AsiaI型三種血清型)為模板，分別應(yīng)用O型、A型和AsiaI型特異性引物和TAKARA公司的一步法RT-PCR試劑盒進行擴增，RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，每條特異性引物終濃度為0.2 μ mol/L,模板4 μ L ;反應(yīng)條件為420C，lOmin, 94°C 2min,94°C 5s, 55°C 30s, 40 個循環(huán)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取 20 μ LPCR 產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過膠回收純化目的片段，然后將目的片段與pGEM-Teasy載體連接，將其轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，進行測序驗證。定量標準質(zhì)粒的制備定量重組標準質(zhì)粒用堿裂解法進行提純，根據(jù)紫外分光光度計測定0D260和0D280值計算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)?？截悢?shù)。質(zhì)粒濃度(μg/ μ L) =0D260 X 稀釋倍數(shù) X 50/1000 ；質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度X6.02X 1023mol/1000M, M:代表質(zhì)粒分子量；步驟三，疫苗樣品的處理以及病毒RNA的提取疫苗樣品破乳處理:取100ml ISA206佐劑乳化的商品?？谔阋?O型、A型和AsiaI型)三價疫苗，放入250ml分液漏斗中，加入10 12ml分析純正戊醇，充分振蕩I分鐘以上混勻；將分液漏斗放入4° C冰箱，靜置30分鐘以上，可見油、水分離；分離出下層水相約34ml，其中含有口蹄疫抗原。抗原水相中口蹄疫病毒RNA的提取:取200 μ L抗原水相，使用Invitrogen公司的TRIzol試劑提取RNA，操作步驟按試劑盒說明書進行；步驟四，熒光定量PCR方法的建立和優(yōu)化( I)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對反應(yīng)體系中不同的引物濃度、Taqman探針濃度、反應(yīng)條件中不同的退火溫度等試驗結(jié)果進行比較，最后選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、擴增效率接近于I的最佳反應(yīng)體系。O型口蹄疫病毒定量PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為:反應(yīng)條件采用一步法，42°C反轉(zhuǎn)錄10min，94°C預(yù)變性2min，94°C變性5s，55°C退火30s，40個循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后確定的25 μ L最佳反應(yīng)體系為:

權(quán)利要求
1.別和定量ロ蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的ー種方法，其特征在于，通過樣品處理提取疫苗破乳后水相中ロ蹄疫病毒RNA，應(yīng)用熒光定量PCR檢測方法來擴增樣品中不同血清型的ロ蹄疫病毒RNA，進行鑒別和定量檢測，其中，O型ロ蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO:r3所示，AsiaI型ロ蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQID NO:4 6所示，A型ロ蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID N0:7 9所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所有探針5’端標記的熒光基團都為FAM，3’端淬滅基團都為TAMAR。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，實時熒光定量PCR檢測方法為:以所述ロ蹄疫病毒RNA為模版，在3個PCR反應(yīng)管中分別加入不同型特異性引物和探針，進行RT-PCR擴增。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，使用TAKARA公司的ー步法RT-PCR試劑盒進行擴増。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，提取所述ロ蹄疫病毒RNA包括以下步驟: (1)取100體積份ISA206佐劑乳化的ロ蹄疫疫苗，放入分液漏斗中，加入10 12體積份分析純正戊醇，充分振蕩I分鐘以上混勻； (2)將分液漏斗放入4°C冰箱，靜置30分鐘以上，可見油、水分離；分離出下層水相，其中含有ロ蹄疫抗原； (3)取水相，使用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 u L，每條特異性引物和特異性探針終濃度為0.2 u mol/uし
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:0型和A型ロ蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄lOmin，94°C預(yù)變性2min，94°C變性5s，55°C退火30s，40個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于=AasiI型ロ蹄疫病毒實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為，42°C反轉(zhuǎn)錄lOmin，94°C預(yù)變性2min，94°C變性5s，65°C退火30s，40個循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:進行熒光定量PCR時設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照為定量標準質(zhì)粒，陰性對照為滅菌水，若CT值小于35.0，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結(jié)果；若CT值在35.0 40.0之間，則判定為可疑結(jié)果，重復(fù)檢測一次，若仍在此范圍內(nèi)，則判定為陰性，若無擴增信號，則判定為陰性結(jié)果。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 0型定量PCR計算公式為:Y=10h_24x+44 82)； A型定量PCR計算公式為:y=10(_3 82x+53_35)； AsiaI型定量PCR計算公式為:y=10卜3 94x+54_26)； Y:樣品中抗原拷貝數(shù)X:樣品擴增CT值。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒別和定量口蹄疫雙價苗以及多價苗中抗原的血清型的一種方法，通過樣品處理提取疫苗破乳后水相中口蹄疫病毒RNA，應(yīng)用熒光定量PCR檢測方法來擴增樣品中不同血清型的口蹄疫病毒RNA，進行鑒別和定量檢測，其中，O型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO1~3所示，AsiaI型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO4~6所示，A型口蹄疫病毒引物和探針的序列分別如SEQ ID NO7~9所示。本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、特異性好、可以分別準確定量樣品中不同型的抗原等特點；具有檢測范圍廣的特點，在100～1010拷貝范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測范圍可以達到10個數(shù)量級。
文檔編號C12Q1/68GK103088157SQ20131001082
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者張翀宇, 郭偉, 劉國英, 范秀麗, 張貴剛, 趙麗霞 申請人:金宇保靈生物藥品有限公司