專利名稱：一種通過染色體加倍誘變和篩選小球藻高產新種質的方法
技術領域：
本項發(fā)明涉及一種通過染色體加倍誘變和篩選小球藻高產新種質的方法，適用于淡水養(yǎng)殖池塘水質凈化和漁業(yè)增產。
背景技術：
池塘集約化養(yǎng)殖模式下，大量投喂配合飼料，其中的氮磷僅有9. 1%和17. 4%被魚類同化，殘留飼料和魚類排泄物形成水體污染物，危害水生動物生長發(fā)育，誘發(fā)多種疫病，造成水產品質量下降。如何凈化和回用養(yǎng)殖廢水已成為制約漁業(yè)經濟發(fā)展的技術瓶頸。利用小球藻等微藻處理水產養(yǎng)殖廢水，一方面可以凈化污水，另一方面可以獲得有價值的藻類，促進養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。蛋白核小球藻pyrenoidosa )粉粗蛋白含量63%，不僅是一種高效的污水處理物種，也是一種優(yōu)良的生物餌料資源。Domenico等利用小球藻在光暗循環(huán)為14 10的條件下處理模擬氨氮廢水，發(fā)現(xiàn)氮的去除過程主要發(fā)生在有光的時段。小球藻去除水體污染物效果的好壞取決于其光合活性，并受控于氮、磷初始濃度、水溫、光強、進水負荷、停留時間等一系列基本參數(shù)。雖然小球藻在處理水產養(yǎng)殖廢水中顯示了其優(yōu)越性并取得了很大進展，但仍然存在一些問題有待解決。其中，選育和改良具有高效凈化能力、營養(yǎng)價值高的新型小球藻藻種是重要的研發(fā)方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種淡水小球藻誘變培育方法，該方法可有效地誘變培育出水質凈化能力強的小球藻高產優(yōu)勢藻株。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種淡水小球藻誘變培育方法包括以下步驟
(O前培養(yǎng)吸取Irnl液體 原藻種接種到含30ml HB-4液體培養(yǎng)基的三角瓶中進行誘
變前的活化培養(yǎng)，無菌操作，于27°C ±1 V、光照強度30001UX、光照周期為12h 12h條件下光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。(2 )誘變處理在HB-4培養(yǎng)液中添加不同濃度秋水仙堿，制成O. 01%、O. 02%、
O.03%、O. 04%、O. 05%、O. 06% 6個濃度梯度的小球藻誘變培養(yǎng)液，接種原藻種后于溫度27°C ±1 °C、140r/min、光照強度30001ux、光照周期12h 12h條件下，分別培養(yǎng)6 h、12h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h 進行誘變處理。(3)初篩和恢復培養(yǎng)每一時間水平誘變結束后，離心分離經誘變的藻細胞，接種到HB-4液體培養(yǎng)基，于27°C ±1 °C、140 170r/min、光照強度30001ux，光照周期為12h 12h、通氣條件下進行恢復培養(yǎng)，每隔6h測定OD53tlnm值，以OD53tlnm峰值出現(xiàn)最早和峰值最大的實驗組為優(yōu)勢突變組。(4)復篩和純化培養(yǎng)運用涂布平板法，將將初篩獲得的小球藻轉接到HB-5固體分離培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，挑選色澤濃綠、半徑大的藻株群落，獲得優(yōu)勢突變型小球藻純藻株，轉接到試管內HB-4固體斜面培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。(5)性能檢測經分離篩選的藻株進行下面各項指標的檢測①小球藻核及葉綠體DNA含量檢測；
②小球藻葉綠素含量檢測；
③小球藻穩(wěn)定期藻細胞濃度測定；
④小球藻胞內可溶性蛋白質含量鑒定；
⑤小球藻水質凈化效能鑒定。


以上給出了本發(fā)明的一種通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，下面以具體實施方式
并結合附圖對本發(fā)明作詳細描述。圖1小球藻核及葉綠體DNA的流式細胞儀測定結果。
具體實施例方式(I)前培養(yǎng)吸取Iml液體原藻種接種到含30ml HB-4 (配方見表I和表3)液體培養(yǎng)基的三角瓶中進行誘變前的活化培養(yǎng)，無菌操作，于27°C ±1 °C、光照強度30001UX、光照周期為12h 12h條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。表1HB-4 配方
權利要求
1.一種通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，包括以下步驟(1)前培養(yǎng)對液體原藻種進行誘變前的活化適應培養(yǎng)；(2)誘變處理配制小球藻誘變劑梯度濃度培養(yǎng)液，培養(yǎng)不同時間進行誘變處理；(3)初篩和恢復培養(yǎng)每一時間水平誘變處理結束后，在培養(yǎng)液中進行恢復培養(yǎng)，分別篩選小球藻濃度峰值出現(xiàn)時間最早和峰值最大的實驗組；(4)優(yōu)勢突變型小球藻純藻株的篩選和純化培養(yǎng)運用涂布平板法，將初篩獲得的小球藻轉接到固體分離培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，篩選優(yōu)勢突變藻株并進行連續(xù)多代的純化培養(yǎng)；(5 )對分離的優(yōu)勢突變小球藻株進行生理性能檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，其特征在于，其中步驟(I)所述的前培養(yǎng)條件是原藻種于27 °C±1 °C、光照強度30001ux、光照周期12h 12h條件下液體培養(yǎng)至穩(wěn)定期。
3.根據(jù)權利要求1所述的通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，其特征在于，其中步驟(2)所述的誘變處理方法是在HB-4培養(yǎng)液中添加不同濃度秋水仙堿，制成O. 01%,O. 02%,O. 03%,O. 04%,O. 05%,O. 06% 6個濃度梯度的小球藻誘變培養(yǎng)液，接種原藻種后于溫度27 °C ±1 °C、140r/min、光照強度30001ux、光照周期12h 12h條件下，分別培養(yǎng) 6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h。
4.根據(jù)權利要求1所述的通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，其特征在于，其中步驟(3)所述的初篩和恢復培養(yǎng)方法是誘變后的藻細胞接種到HB-4液體培養(yǎng)基于27°C±1 °C、140 170r/min、光照強度30001ux、光照周期為12h 12h、通氣條件下恢復培養(yǎng)，以OD53tol峰值出現(xiàn)最早和峰值最大的實驗組為優(yōu)勢突變組。
5.根據(jù)權利要求1所述的通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，其特征在于，其中步驟(4)所述的優(yōu)勢突變型小球藻純藻株的篩選和純化培養(yǎng)方法為在HB-5固體分離培養(yǎng)基上，挑選色澤濃綠、半徑大的藻株群落，轉接到試管內HB-4固體斜面培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。
6.根據(jù)權利要求1所述的通過染色體加倍誘變和篩選創(chuàng)造小球藻高產新種質的方法，其特征在于，其中步驟(5)所述的優(yōu)勢突變小球藻株生理性能檢測是按下列指標進行①小球藻核及葉綠體DNA含量檢測；②小球藻葉綠素含量檢測；③小球藻穩(wěn)定期藻細胞濃度測定；④小球藻胞內可溶性蛋白質含量鑒定；⑤小球藻水質凈化效能鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通過染色體加倍誘變和篩選小球藻高產新種質的方法，主要步驟包括對液體原藻種進行誘變前的活化培養(yǎng)，配制小球藻誘變劑梯度濃度培養(yǎng)液進行誘變處理，對誘變處理后的小球藻在培養(yǎng)液中進行恢復培養(yǎng)和初篩，然后將初篩獲得的小球藻轉接到固體分離培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，篩選優(yōu)勢突變藻株并進行連續(xù)多代的純化培養(yǎng)，檢測其生長性能。本發(fā)明篩選的小球藻優(yōu)勢突變藻株發(fā)酵培養(yǎng)液應用于淡水養(yǎng)殖水體，可提高水質凈化效果，并能提高濾食性魚類及魚苗的產量。
文檔編號C12N1/12GK103060308SQ20131001111
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權日2013年1月14日
發(fā)明者蔣立科, 盧文軒, 楊坤 申請人:安徽省農業(yè)科學院水產研究所, 合肥匯科農業(yè)科技開發(fā)有限公司, 盧文軒