本發(fā)明涉及表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌，還涉及利用重組枯草芽孢桿菌來生產(chǎn)金屬硫蛋白的方法。

背景技術(shù)：

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的、高度可誘導(dǎo)性的內(nèi)源金屬結(jié)合蛋白，具有維持生物體內(nèi)必須金屬含量動態(tài)平衡、重金屬解毒、清除自由基，改善機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力等多種作用，且與動物機(jī)體的生長發(fā)育及部分疾病的發(fā)病機(jī)理有著密切的關(guān)系。因此，金屬硫蛋白在醫(yī)學(xué)、化妝品、保健食品添加劑、環(huán)保等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

目前，國內(nèi)市場上常見的金屬硫蛋白多數(shù)是從兔肝臟中提純，由于金屬硫蛋白原料需求特別，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)量極低且提純步驟繁復(fù)的缺點(diǎn)，因此尚無有效的方法能大量生產(chǎn)金屬硫蛋白，致使金屬硫蛋白原料來源已成為制約該領(lǐng)域發(fā)展的瓶頸之一。濾食性海洋貝類對重金屬有較強(qiáng)的敏感性及生物累積能力，貝類重要的抗逆基因金屬硫蛋白基因?qū)χ亟饘倬哂休^強(qiáng)的可誘導(dǎo)性、易選擇性和高水平表達(dá)的特點(diǎn)，在金屬誘導(dǎo)下，雙殼類海洋動物體內(nèi)金屬硫蛋白含量會顯著增加，并隨著金屬暴露時間和金屬濃度變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，但貝類金屬硫蛋白的誘導(dǎo)效果仍然存在一定的局限性，難以成為金屬硫蛋白產(chǎn)品批量生產(chǎn)途徑。

目前已有利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，使用大腸桿菌作為以重組技術(shù)工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細(xì)胞來生產(chǎn)金屬硫蛋白的文獻(xiàn)報導(dǎo)。但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺少真核生物的蛋白翻譯后加工和修飾的功能，表達(dá)的蛋白大部分以包涵體形式存在，需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性，并且背景雜蛋白較多。另外，目前分子克隆的載體系統(tǒng)大多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的選擇標(biāo)記，而抗性基因容易向環(huán)境中漂移擴(kuò)散，對環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)造成破壞，且不能直接用于人和動物，否則對生物體易造成不可估量的危害。

益生菌表達(dá)系統(tǒng)是最簡單和最可靠的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，相對于動物源金屬硫蛋白具有生產(chǎn)周期短、提取率高、價格低廉及高安全性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已應(yīng)用于許多重組蛋白的表達(dá)，作為人的功能性食品、動物飼料添加劑等，是美國食品藥物管理局(FDA)和中國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的無致病性的安全菌株，也是分泌表達(dá)外源基因的良好受體菌，現(xiàn)已越來越多的受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。但迄今仍未見采用益生菌來表達(dá)金屬硫蛋白的相關(guān)報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種表達(dá)金屬硫蛋白的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該枯草芽孢桿菌含有金屬硫蛋白的融合表達(dá)載體，該融合表達(dá)載體攜帶金屬硫蛋白的編碼核酸分子，能夠可誘導(dǎo)地表達(dá)該金屬硫蛋白。

在一個實(shí)施方案中，該金屬硫蛋白為褶牡蠣金屬硫蛋白。在另一實(shí)施方案中，該金屬硫蛋白包含或具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一個實(shí)施方案中，該金屬硫蛋白編碼核酸分子包含或具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在一個實(shí)施方案中，該融合表達(dá)載體構(gòu)建自PHT43-SUMO。

在一個實(shí)施方案中，該枯草芽孢桿菌為蛋白酶缺陷的。在一個具體實(shí)施方案中，該枯草芽孢桿菌為WB800N。

本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)金屬硫蛋白的方法。該方法包括以下步驟：(a)構(gòu)建金屬硫蛋白的融合表達(dá)載體；(b)用該融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌；以及(c)培養(yǎng)該枯草芽孢桿菌，并加入誘導(dǎo)劑，以獲得包含表達(dá)的金屬硫蛋白的培養(yǎng)物。

在一個實(shí)施方案中，將包含表達(dá)的金屬硫蛋白的培養(yǎng)物就此使用，作為功能性食品或者飼料添加劑。

在一個實(shí)施方案中，該方法還包括步驟(d)：從所述培養(yǎng)物中純化該金屬硫蛋白。

在一個實(shí)施方案中，步驟(a)所用的融合表達(dá)載體為PHT43-SUMO。相應(yīng)地，在一個實(shí)施方案中，該方法還包括采用SUMO蛋白酶處理表達(dá)的金屬硫蛋白。

在一個實(shí)施方案中，該方法步驟(c)中所用的誘導(dǎo)劑為IPTG、葡萄糖和重金屬鹽。在一個具體實(shí)施方案中，該金屬鹽選自ZnSO₄、Na₂SeO₃、CdCl₂或它們的組合。

本發(fā)明公開的金屬硫蛋白誘導(dǎo)提取方法，克服了傳統(tǒng)金屬硫蛋白制備方法的不足，避免了大量動物資源的浪費(fèi)，改變了以往以兔肝等動物肝臟為原料制備金屬硫蛋白時大量的有機(jī)溶劑乙醇及氯仿的使用，以及避免細(xì)菌源內(nèi)毒素污染，不僅降低了因添加這些試劑引起安全性的影響，而且降低了對于試劑后續(xù)的去除工藝，降低了生產(chǎn)成本，提高了蛋白產(chǎn)量。本發(fā)明還可通過發(fā)酵條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，不斷提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1顯示了褶牡蠣金屬硫蛋白基因cDNA核苷酸序列及氨基酸序列。前后方框內(nèi)分別為起始密碼子和終止密碼子；*表示終止密碼子；下劃線標(biāo)出的是多聚腺苷酸加尾信號位點(diǎn)。

圖2顯示了褶牡蠣金屬硫蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

圖3顯示了融合表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT的構(gòu)建。

圖4顯示了本發(fā)明生產(chǎn)方法發(fā)酵液中金屬硫蛋白的SDS-PAGE電泳檢測。M：虹彩蛋白Marker；未轉(zhuǎn)化(陰性對照)；紅色箭頭指向目的蛋白。

具體實(shí)施方式

除非另有說明，本文中所用的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。

本文中所用的“載體”是指基因重組技術(shù)中將核酸片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的能自我復(fù)制的核酸分子，有時也稱為“克隆載體”，包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體等。本文中所用的“表達(dá)載體”是指在上述載體基礎(chǔ)上增加了表達(dá)元件，從而能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的載體，這些表達(dá)元件例如包括啟動子、終止子、調(diào)控序列等。

本文中采用的pHT43載體是一種枯草芽孢桿菌表達(dá)載體，其可引導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白到培養(yǎng)基。這個載體基于強(qiáng)σA-依賴性啟動子的枯草桿菌groE操縱子，通過添加lac操縱子改造成為一種高效可控的(IPTG誘導(dǎo)的)啟動子。該表達(dá)載體包含：Pgrac:Pgrac啟動子(包含groE啟動子；lacO操縱子和gsiB SD序列)，CoIE1ori:CoIE1起始子，AmpR:青霉素抗性基因，LacI:lacI基因(lac抑制子)，CmR:氯霉素抗性基因，多克隆位點(diǎn)(BamH I,Xba I,Aat II,SmaI)。

本文中所用的“融合表達(dá)載體”是指能夠?qū)?biāo)簽蛋白和目的蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)的表達(dá)載體，其中標(biāo)簽蛋白可有助于目的蛋白的檢測和純化，促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)、溶解和折疊等。常用的標(biāo)簽蛋白有熒光蛋白(如GFP)、熒光素酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶、His6、SUMO等。

SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-likemodifier)，作為促溶解度標(biāo)簽蛋白的一種，SUMO是泛素(ubiquitin)類多肽鏈超家族的重要成員之一。SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，不但可以進(jìn)一步提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。SUMO蛋白水解酶能識別完整的SUMO標(biāo)簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO后，經(jīng)過純化，去除標(biāo)簽蛋白部分，就得到全長目的蛋白。

以下進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

1.褶牡蠣金屬硫蛋白編碼序列(Op-MT)的克隆以及融合表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT的構(gòu)建。

運(yùn)用TRIzol試劑盒(Invitrogen,USA)提取褶牡蠣內(nèi)臟團(tuán)總RNA，采用TaKaRa Prime-Script TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。為得到褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA全序列，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA的5′和3′末端。根據(jù)NCBI基因庫中褶牡蠣相似物種的金屬硫蛋白保守片段序列設(shè)計5′和3′端特異性引物，5′和3′末端擴(kuò)增分別使用TaKaRa 3’-Full RACE Core SetVer.3.0和5’-Full RACE Kit(TaKaRa,Japan)。其中3′RACE中PCR擴(kuò)增引物為3’RACE Outer Primer和(TGGACC GGATGTAAT GTG GT)，5’RACE中PCR擴(kuò)增引物為5’RACE Outer Primer和(TTG GGT CCT TTG TTA CAC GC)。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃5min；94℃30s，58℃30s，30個循環(huán)，72℃1min；72℃延伸10min。

經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后，用TaKaRa Purification Kit(TaKaRa,Japan)回收PCR產(chǎn)物目的片段，連入克隆載體pMD19-T(TaKaRa,Japan)，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，進(jìn)行序列測定。對3’和5’測序結(jié)果進(jìn)行拼接和重疊序列的去除，最終獲得褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA全基因序列Op-MT(圖1)。

用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT(圖3)。

采用上述方案后，本發(fā)明獲得了褶牡蠣金屬硫蛋白基因(Op-MT)的全長cDNA序列。該序列全長500bp，由長54bp的5’UTR，122bp的3’UTR和324bp的開放閱讀框組成，共編碼107個氨基酸(圖1)。該蛋白序列中半胱氨酸含量豐富(28％)，不含芳香族氨基酸，富含金屬硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys結(jié)構(gòu)，存在軟體動物等無脊椎動物金屬硫蛋白特征序列(圖2)，是金屬硫蛋白家族成員。

2.表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建和篩選。

以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌，命名為B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。

3.生產(chǎn)金屬硫蛋白的方法。

將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取一環(huán)活化的菌種，接入裝有活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h。取活化的菌種，接入裝有LB培養(yǎng)基或自制培養(yǎng)基的三角燒瓶或發(fā)酵罐中，接種量為1％～10％，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為5.0～9.0，37℃，在搖床或發(fā)酵罐中進(jìn)行培育，搖床轉(zhuǎn)速150r/min～250r/min，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.1～1:0.5，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min～250r/min。在培育24h，OD₆₀₀為1.0～4.0的菌液中加入10μM～2000μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，50μM～1000μM的ZnSO₄、Na₂SeO₃或CdCl₂，溫度37℃，設(shè)定誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速為150r/min～250r/min，或發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.5～1:1.0，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min～250r/min，誘導(dǎo)時間為24h～72h。為減少生產(chǎn)成本，發(fā)酵培養(yǎng)基可自配，分別用2％甘油，或2％麥芽糖，或2％蔗糖代替LB培養(yǎng)基中的碳源；用1.5％牛肉浸出粉，或1.5％酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨，或1.5％酵母浸出物+胰蛋白胨+尿素代替LB培養(yǎng)基中的氮源；自制培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽為1％硫酸鎂，或1％磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉，或1％氯化鈉。

可通過加熱從發(fā)酵液去除部分雜蛋白，加熱溫度為60℃，時間控制在30～60分鐘。發(fā)酵液經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

本發(fā)明的重組工程菌對重金屬鎘耐受力增強(qiáng)，成功表達(dá)出金屬硫蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白SUMO-Op-MT分子量約23kD(圖4)。

以下通過具體實(shí)施案例對本發(fā)明進(jìn)行闡釋，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施案例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。

實(shí)施例1：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取一環(huán)活化的菌種，接入裝有活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h。取活化的菌種，接入裝有5升LB培養(yǎng)基三角燒瓶中，接種量為4％，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為7.0，37℃，在搖床進(jìn)行培育，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。在培育24h，OD₆₀₀為4.0的菌液中加入1000μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，50μM CdCl₂，溫度37℃，設(shè)定誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，誘導(dǎo)時間48h后，60℃加熱30分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

實(shí)施例2：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取活化的菌種，分別接入裝有1升活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h制備種子液。按8％接種量將種子液接入已滅菌裝有自制培養(yǎng)基的100升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基碳源為2％蔗糖，氮源為1.5％酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2:2:1)，添加1％硫酸鎂，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為5.0，37℃發(fā)酵24h，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)220r/min。當(dāng)發(fā)酵液OD₆₀₀為4.0時，加入800μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，700μM ZnSO₄，溫度37℃，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:1.0，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，誘導(dǎo)72h后，60℃加熱60分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

實(shí)施例3：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取一環(huán)活化的菌種，接入裝有活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h。取活化的菌種，接入裝有5升LB培養(yǎng)基三角燒瓶中，接種量為2％，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為9.0，37℃，在搖床進(jìn)行培育，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。在培育24h，OD₆₀₀為2.0的菌液中加入100μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，100μM Na₂SeO₃，溫度37℃，設(shè)定誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，誘導(dǎo)時間72h后，60℃加熱30分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

實(shí)施例4：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取活化的菌種，分別接入裝有1升活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h制備種子液。按10％接種量將種子液接入已滅菌裝有自制培養(yǎng)基的100升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基碳源為2％甘油，氮源為1.5％酵母浸出物+胰蛋白胨+尿素(2：2：1)，添加1％磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉(1：1)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為9.0，37℃發(fā)酵24h，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.5，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min。當(dāng)發(fā)酵液OD₆₀₀為4.0時，加入1500μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，1000μM ZnSO₄，溫度37℃，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.8，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，誘導(dǎo)48h后，60℃加熱60分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

實(shí)施例5：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取活化的菌種，分別接入裝有1升活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h制備種子液。按4％接種量將種子液接入已滅菌裝有LB培養(yǎng)基的100升發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為6.0，37℃發(fā)酵24h，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:0.5，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min。當(dāng)發(fā)酵液OD₆₀₀為4.0時，加入1000μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，700μM Na₂SeO₃，溫度37℃，發(fā)酵罐壓力0～0.02Mpa，通氣比例為1:1.0，攪拌轉(zhuǎn)速220r/min，誘導(dǎo)72h后，60℃加熱60分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得MT產(chǎn)品。

實(shí)施例6：

根據(jù)本發(fā)明褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，用限制性內(nèi)切酶BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和PHT43-SUMO表達(dá)載體，后用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PHT43-SUMO-Op-MT。以枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800N為表達(dá)宿主，用電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化分泌表達(dá)載體PHT43-SUMO-Op-MT，在含有10μg/mL氯霉素和50μg/mL新霉素的LB平板上篩選，得到高效表達(dá)金屬硫蛋白的重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800N/PHT43-SUMO-Op-MT，-80℃冷凍保存。將保存的重組枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，備用。取一環(huán)活化的菌種，接入裝有活化培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃，200r/min培養(yǎng)20h。取活化的菌種，接入裝有5升自制培養(yǎng)基三角燒瓶中，培養(yǎng)基碳源為2％麥芽糖，氮源為1.5％牛肉浸出粉，添加1％氯化鈉，接種量為1％，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為8.0，37℃，在搖床進(jìn)行培育，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。在培育OD₆₀₀為2.0的菌液中加入700μM的IPTG誘導(dǎo)劑，2％葡萄糖，500μM CdCl₂，溫度37℃，設(shè)定誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速為250r/min，誘導(dǎo)時間72h后，60℃加熱30分鐘，經(jīng)150μm篩網(wǎng)粗濾后，直接經(jīng)過0.5um的陶瓷膜或平板膜進(jìn)行過濾澄清，再經(jīng)截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜進(jìn)行多級分離分離提純及濃縮，經(jīng)冷凍干燥獲得金屬硫蛋白產(chǎn)品。

本發(fā)明公開的金屬硫蛋白誘導(dǎo)提取工藝，選擇安全性高的食品級微生物-益生菌(枯草芽孢桿菌)作為表達(dá)宿主，針對海洋貝類金屬硫蛋白基因，通過構(gòu)建金屬硫蛋白枯草菌種表達(dá)載體，獲得益生菌重組菌株；然后通過多金屬多途徑聯(lián)合誘導(dǎo)重組菌株，獲得金屬硫蛋白高效表達(dá)最佳途徑。克服了傳統(tǒng)金屬硫蛋白制備方法的不足，避免了大量動物資源的浪費(fèi)，改變了以往以兔肝等動物肝臟為原料制備金屬硫蛋白時大量的有機(jī)溶劑乙醇及氯仿的使用，且表達(dá)過程不分泌內(nèi)毒素，無需進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，可直接作為食品添加劑。不僅降低了因添加這些試劑引起安全性的影響，而且降低了對于試劑后續(xù)的去除工藝，降低了生產(chǎn)成本，提高了蛋白產(chǎn)量。重組海洋源金屬硫蛋白-益生菌菌株所表現(xiàn)出的高安全性，使海洋源金屬硫蛋白在開發(fā)天然、高效海洋源重金屬生物解毒劑工業(yè)化生產(chǎn)具有極大的生產(chǎn)實(shí)際潛能。

需要說明的是上述實(shí)施案例僅僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施案例，并沒有來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上所作出的等同替換或替代均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 國家海洋局第三海洋研究所

<120> 表達(dá)金屬硫蛋白的枯草芽孢桿菌和生產(chǎn)金屬硫蛋白的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 褶牡蠣(Ostrea plicatula)

<400> 1

Met Ser Asp Pro Cys Asn Cys Ser Glu Thr Gly Thr Cys Val Cys Ser

1 5 10 15

Asp Ser Cys Pro Ala Thr Gly Cys Lys Cys Gly Pro Gly Cys Lys Cys

20 25 30

Gly Asp Gly Cys Lys Cys Ser Gly Cys Lys Val Lys Cys Tyr Cys Ser

35 40 45

Gly Ser Cys Gly Cys Gly Lys Gly Cys Thr Gly Pro Glu Asn Cys Lys

50 55 60

Cys Ala Asn Asp Ser Gly Cys Val Cys Lys Val Lys Cys Asn Cys Ser

65 70 75 80

Gly Ser Cys Gly Cys Gly Lys Gly Cys Thr Gly Pro Glu Asn Cys Lys

85 90 95

Cys Ala Asn Asp Ser Gly Cys Val Cys Lys Lys

100 105

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctgatc catgtaactg cagtgagact ggaacatgtg tctgctctga ttcgtgtcca 60

gcaacaggat gtaaatgtgg acccggatgt aaatgtggtg acgggtgtaa atgttcaggc 120

tgcaaagtca agtgttactg cagcggatct tgtggttgtg gtaaaggatg cacgggaccg 180

gaaaactgca aatgcgcaaa cgattccgga tgtgtctgca aagtcaagtg taactgcagc 240

ggatcttgtg gttgtggtaa aggatgcacg ggaccggaaa actgcaaatg cgcaaacgat 300

tccggatgtg tctgtaagaa atga 324