本發(fā)明涉及植物乳桿菌CH126及其在制備降糖功能性食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是一種常見的慢性代謝性疾病，常伴有動(dòng)脈粥樣硬化、腎病、神經(jīng)病變，視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。2型糖尿病患者自身不能有效利用胰島素或形成胰島素耐受，導(dǎo)致胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用率降低，進(jìn)而引起體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝系亂。臨床上抗糖尿病的藥物有促進(jìn)胰島素分泌劑、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等，長期服用會(huì)引起視覺異常、胃腸道功能障礙、肝腎功能受損等嚴(yán)重的副作用。因此，尋找安全、可靠、無副作用的降血糖方法，更有現(xiàn)實(shí)意義。益生菌是對宿主健康有促進(jìn)作用的活的微生態(tài)制劑。益生菌已廣泛應(yīng)用于食品、功能食品、藥品等領(lǐng)域。益生菌在改善腸道、提高免疫力、緩解過敏反應(yīng)、調(diào)節(jié)血脂代謝、調(diào)節(jié)血壓等方面發(fā)揮重要作用。乳酸菌是一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢微生物種類，是功能性益生菌的重要來源。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供植物乳桿菌CH126及其在制備降糖功能性食品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CH126，已于2016年11月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCNO.13228。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CH126CGMCCNO.13228，簡稱植物乳桿菌CH126。本發(fā)明還保護(hù)植物乳桿菌CH126在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。所述食品具體可為功能性食品，例如功能性酸奶、功能性菌劑等。所述產(chǎn)品的功能為如下(a1)至(a31)中的至少一項(xiàng)：(a1)降血糖和/或降血脂；(a2)降低血清中的血糖含量；(a3)降低血清中的血脂含量；(a4)降低血清中的總膽固醇含量；(a5)降低血清中的甘油三酯含量；(a6)降低空腹血糖值；(a7)增高抗氧化能力；(a8)增高血清中的超氧化物歧化酶的含量和/或活性；(a9)增高血清中的過氧化氫酶的含量和/或活性；(a10)增高血清中的谷胱甘肽過氧化物酶的含量和/或活性；(a11)降低血清中的丙二醛的含量和/或活性；(a12)改善脂類代謝紊亂；(a13)降低血清中的D-乳酸含量；(a14)降低血清中的游離脂肪酸含量；(a15)降低血清中的內(nèi)毒素含量；(a16)治療和/或預(yù)防糖尿??；(a17)降低糖尿病患者血清中的血糖含量；(a18)降低糖尿病患者血清中的血脂含量；(a19)降低糖尿病患者血清中的總膽固醇含量；(a20)降低糖尿病患者血清中的甘油三酯含量；(a21)降低糖尿病患者的空腹血糖值；(a22)升高糖尿病患者血清中的胰島素含量；(a23)增高糖尿病患者血清中的超氧化物歧化酶的含量和/或活性；(a24)增高糖尿病患者血清中的過氧化氫酶的含量和/或活性；(a25)增高糖尿病患者血清中的谷胱甘肽過氧化物酶的含量和/或活性；(a26)降低糖尿病患者血清中的丙二醛的含量和/或活性；(a27)改善糖尿病患者的脂類代謝紊亂；(a28)降低糖尿病患者血清中的D-乳酸含量；(a29)降低糖尿病患者血清中的游離脂肪酸含量；(a30)降低糖尿病患者血清中的內(nèi)毒素含量；(a31)改善糖尿病患者的高血脂癥狀。本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌CH126。本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為植物乳桿菌CH126的發(fā)酵物或植物乳桿菌CH126的發(fā)酵物的提取物。所述產(chǎn)品為食品、保健品或藥品。所述食品具體可為功能性食品，例如功能性酸奶、功能性菌劑等。所述產(chǎn)品的功能為如下(a1)至(a31)中的至少一項(xiàng)：(a1)降血糖和/或降血脂；(a2)降低血清中的血糖含量；(a3)降低血清中的血脂含量；(a4)降低血清中的總膽固醇含量；(a5)降低血清中的甘油三酯含量；(a6)降低空腹血糖值；(a7)增高抗氧化能力；(a8)增高血清中的超氧化物歧化酶的含量和/或活性；(a9)增高血清中的過氧化氫酶的含量和/或活性；(a10)增高血清中的谷胱甘肽過氧化物酶的含量和/或活性；(a11)降低血清中的丙二醛的含量和/或活性；(a12)改善脂類代謝紊亂；(a13)降低血清中的D-乳酸含量；(a14)降低血清中的游離脂肪酸含量；(a15)降低血清中的內(nèi)毒素含量；(a16)治療和/或預(yù)防糖尿??；(a17)降低糖尿病患者血清中的血糖含量；(a18)降低糖尿病患者血清中的血脂含量；(a19)降低糖尿病患者血清中的總膽固醇含量；(a20)降低糖尿病患者血清中的甘油三酯含量；(a21)降低糖尿病患者的空腹血糖值；(a22)升高糖尿病患者血清中的胰島素含量；(a23)增高糖尿病患者血清中的超氧化物歧化酶的含量和/或活性；(a24)增高糖尿病患者血清中的過氧化氫酶的含量和/或活性；(a25)增高糖尿病患者血清中的谷胱甘肽過氧化物酶的含量和/或活性；(a26)降低糖尿病患者血清中的丙二醛的含量和/或活性；(a27)改善糖尿病患者的脂類代謝紊亂；(a28)降低糖尿病患者血清中的D-乳酸含量；(a29)降低糖尿病患者血清中的游離脂肪酸含量；(a30)降低糖尿病患者血清中的內(nèi)毒素含量；(a31)改善糖尿病患者的高血脂癥狀。以上任一所述糖尿病具體可為2型糖尿病。本發(fā)明的乳桿菌是從眾多傳統(tǒng)發(fā)酵食品來源乳酸菌中篩選獲得的一株降血糖功能的益生菌新菌株，其不僅具有很強(qiáng)的降低空腹血糖、降血脂作用，還具有良好的耐受性、良好的疏水性和自凝聚能力、對不同抗生素具有不同的敏感性，安全，且無毒、副作用，可用廣泛用于食品、保健食品和醫(yī)藥健康領(lǐng)域。附圖說明圖1為血清中胰島素的檢測結(jié)果具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。如無特殊說明，實(shí)施例中的PBS緩沖液均為pH7、0.1M的PBS緩沖液。固體BCP培養(yǎng)基：含酵母膏2.5g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖5g/L、溴甲酚紫0.04g/L、瓊脂15g/L，余量為水；如無特殊說明，pH＝7.0。液體BCP培養(yǎng)基與固體BCP培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于不加入瓊脂。固體MRS培養(yǎng)基：含蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、KH2PO42g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸鈉5g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、MnSO4·4H2O0.05g/L、吐溫-801mL/L、瓊脂15g/L、葡萄糖20g/L，余量為水；如無特殊說明，pH＝6.6。液體MRS培養(yǎng)基與固體MRS培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于不加入瓊脂。基礎(chǔ)飼料：長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。高脂飼料(％代表g/100g)：基礎(chǔ)飼料75％，豬油10％，蛋黃粉10％，膽固醇(食品級(jí)，鄭州蒼宇化工產(chǎn)品有限公司)5％。C57BL/6J小鼠：長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004。采用上海朗頓小鼠總膽固醇酶聯(lián)免疫試劑盒(BPE20095)檢測血清中的總膽固醇(TotalCholesterol，TC)含量。采用上海朗頓小鼠甘油三酯酶聯(lián)免疫試劑盒(BPE20754)檢測血清中的甘油三酯(Triglyceride，TG)含量。采用上海朗頓小鼠高密度脂蛋白膽固醇酶聯(lián)免疫試劑盒(BPE20192)檢測血清中的高密度脂蛋白膽固醇(HighDensityLipoprotein，HDL-C)含量。采用上海朗頓小鼠低密度脂蛋白膽固醇酶聯(lián)免疫試劑盒(BPE20100)檢測血清中的低密度脂蛋白膽固醇(LowDensityLipoprotein，LDL-C)含量。采用上海朗頓小鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒(BPE20353)檢測血清中的胰島素(Insulin，INS)含量。采用上海朗頓小鼠谷胱甘肽過氧化物酶免疫試劑盒(BPE20748)檢測血清中谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-Px)的含量。采用上海朗頓小鼠氧化物歧化酶免疫試劑盒(BPE20348)檢測血清中超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)的含量。采用上海朗頓小鼠過氧化氫酶免疫試劑盒(BPE20880)檢測血清中過氧化氫酶(Catalase，CAT)的含量。采用上海朗頓小鼠丙二醛免疫試劑盒(BPE20347)檢測血清中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。采用上海朗頓小鼠游離脂肪酸免疫試劑盒(BPE20248)檢測血清中游離脂肪酸(Freefatacid，F(xiàn)FA)的含量。采用上海朗頓小鼠內(nèi)毒素免疫試劑盒(BPE20316)檢測血清中內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)的含量。采用上海朗頓小鼠D-乳酸免疫試劑盒(BPE20072)檢測血清中D-乳酸(D-Lactate)的含量。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Sc52，已于2015年06月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCNO.11027。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Sc52CGMCCNO.11027，簡稱植物乳桿菌Sc52。實(shí)施例1、植物乳桿菌菌株的分離、鑒定和保藏一、植物乳桿菌菌株的分離樣本取材：傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸辣蘿卜。經(jīng)BCP培養(yǎng)基平板反復(fù)劃線培養(yǎng)，挑取產(chǎn)黃圈的單菌落接種于固體MRS培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)固體MRS培養(yǎng)基平板反復(fù)劃線培養(yǎng)純化，得到多株純培養(yǎng)菌種。純培養(yǎng)的菌種接種到液體MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后加入20％甘油，-80℃冰箱保存。從純培養(yǎng)的菌種中篩選出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)陰性、吲哚反應(yīng)陰性、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)陰性、明膠液化試驗(yàn)陰性、水解淀粉試驗(yàn)陰性和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性的若干菌株。將其中1株菌株命名為CH126。二、菌株的鑒定CH126的生理生化鑒定結(jié)果：革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性，聯(lián)苯胺試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)陽性；不水解淀粉，不液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不運(yùn)動(dòng)的桿菌；在15℃和45℃能夠生長，最適生長溫度37～42℃；適宜pH為5.0～7.0；耐受6.5％NaCl；CH126在液體MRS培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，久置菌體呈白色沉淀。CH126的API50CH(法國梅里埃公司)鑒定結(jié)果：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、苦杏仁苷、熊果苷、N-乙酰-葡萄糖胺、七葉醇、柳醇、纖維二糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉籽糖、牻牛兒糖、葡萄糖酸鹽；不能利用阿東醇、阿拉伯糖、糖原、衛(wèi)矛醇、麥芽糖、肌醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、α-甲基-D-甘露糖苷、淀粉、鼠李糖、木糖醇、D-松二糖、D-塔格糖、D-米蘇糖、葡萄糖酸鹽、D-阿拉伯糖醇、巖糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽、5-酮基-葡萄糖酸鹽。16SrDNA序列同源性分析：提取基因組DNA，采用16sF和16sR組成的引物對(16sF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；16sR：5＇-AGAAAGGAGGTGATCCAGC-3＇)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，16srDNA序列如序列表的序列1所示。將16srDNA序列通過BLAST程序在GenBank庫中進(jìn)行同源性比對分析，與LactobacillusplantarumstrainRI-113(GenBank:CP017406.1)同源性達(dá)到98％。根據(jù)以上鑒定結(jié)果，菌株CH126屬于植物乳桿菌。三、菌株的保藏植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CH126，已于2016年11月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCNO.13228。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CH126CGMCCNO.13228，簡稱植物乳桿菌CH126。實(shí)施例2、植物乳桿菌CH126的功能特性菌落計(jì)數(shù)的方法，完成培養(yǎng)后，倍比稀釋并涂布于固體MRS培養(yǎng)基平板，37℃靜置培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。一、耐酸能力和耐膽鹽能力1、耐酸能力植物乳桿菌CH126或植物乳桿菌Sc52接種于不同pH的液體MRS培養(yǎng)基(用1mol/L鹽酸調(diào)pH分別為2.0、3.0或6.6)中，37℃靜置培養(yǎng)1h或3h，然后通過菌落計(jì)數(shù)計(jì)算菌濃度(用Log10CFU/mL表示)。每種pH設(shè)置3個(gè)平行處理，每個(gè)稀釋度再次設(shè)置3個(gè)平行處理，結(jié)果取平均值。結(jié)果見表1。植物乳桿菌CH126：pH6.6條件下菌株生長良好，隨著時(shí)間的延長活菌數(shù)呈上升趨勢；pH2.0條件下培養(yǎng)3h后未檢測到活菌；pH3.0條件下，菌株表現(xiàn)出了一定的耐酸性，培養(yǎng)3h后存活率仍在61.5％；結(jié)果表明，植物乳桿菌CH126有較強(qiáng)的酸耐受能力。植物乳桿菌Sc52：pH3.0條件下，培養(yǎng)3h后存活率為57.0％。表1植物乳桿菌CH126在液體培養(yǎng)體系中的菌濃度(Log10CFU/mL)2、耐膽鹽能力植物乳桿菌CH126或植物乳桿菌Sc52接種于含不同濃度牛膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基(牛膽鹽的質(zhì)量百分含量分別為0.3％、0.5％或1.0％)，37℃靜置培養(yǎng)4h，然后通過菌落計(jì)數(shù)計(jì)算菌濃度(用Log10CFU/mL表示)。每種牛膽鹽濃度設(shè)置3個(gè)平行處理，每個(gè)稀釋度再次設(shè)置3個(gè)平行處理，結(jié)果取平均值。結(jié)果見表2。植物乳桿菌CH126：在0.3％膽鹽濃度下菌株存活率為52％，在0.5％膽鹽濃度下菌株存活率為46％，在1％膽鹽濃度下菌株存活率為32％；結(jié)果表明，植物乳桿菌CH126有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力。植物乳桿菌Sc52：在0.3％膽鹽濃度下菌株存活率為49％，在0.5％膽鹽濃度下菌株存活率為42％，在1％膽鹽濃度下菌株存活率為25％。表2植物乳桿菌CH126在液體培養(yǎng)體系中的菌濃度(Log10CFU/mL)初始菌濃度0.3％牛膽鹽0.5％牛膽鹽1.0％牛膽鹽植物乳桿菌CH1268.14±0.164.25±0.043.75±0.172.61±0.18植物乳桿菌Sc528.16±0.314.00±0.153.41±0.132.07±0.09二、植物乳桿菌CH126的疏水性和自凝聚能力測定細(xì)菌表面疏水作用與自凝聚能力是菌體細(xì)胞粘附到生物和非生物表面的重要因素之一。采用細(xì)菌黏著物質(zhì)法(bacterialadhesionsubstance，BATS)測定植物乳桿菌CH126的疏水性。自凝率由菌株表面疏水性引起，同時(shí)與其粘附能力密切相關(guān)，高自凝率的菌株一般具有較高的粘附能力。1、疏水性將植物乳桿菌CH126的菌體用生理鹽水洗滌2次，然后用0.1mol/LKNO3水溶液懸浮菌體，得到菌濃度為1×108CFU/mL的菌液，600nm波長處測定菌液的光密度值A(chǔ)0。將3mL菌液與1mL有機(jī)溶劑(二甲苯、氯仿或乙酸乙酯)混勻，然后室溫靜置30min，收集水相，600nm波長處測定水相的光密度值A(chǔ)1。計(jì)算疏水性(BATS)。疏水性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：BATS>50％為高疏水性，BATS在20％-50％為中度疏水，BATS<20％為非疏水。進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，借故偶取平均值。結(jié)果見表3。植物乳桿菌CH126在二甲苯、乙酸乙酯和氯仿中表現(xiàn)出非疏水能力。表3植物乳桿菌CH126的疏水性(％)二甲苯乙酸乙酯氯仿17.0±0.905.0±0.2418.7±1.522、自凝聚能力將植物乳桿菌CH126的菌體用生理鹽水洗滌2次，然后用生理鹽水懸浮菌體，得到初始菌液，600nm波長處測定初始菌液的光密度值A(chǔ)0為1.0。將初始菌液室溫靜置1h后取1mL上層液相，600nm波長處測定菌液的光密度值，為A1。將初始菌液室溫靜置24h后取1mL上層液相，600nm波長處測定菌液的光密度值，為A2。將初始菌液室溫靜置48h后取1mL上層液相，600nm波長處測定菌液的光密度值，為A3。計(jì)算自凝率(菌株自凝聚百分比)。進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，借故偶取平均值。結(jié)果見表4。隨著時(shí)間的增加，植物乳桿菌CH126自凝率升高，48h后上層液相呈澄清狀態(tài)，自凝率達(dá)到84.2％。表4植物乳桿菌CH126的自凝率(％)1h24h48h2.5±0.475.3±0.5784.2±1.00三、抗生素敏感性試驗(yàn)1、用雙蒸水作為溶劑，將抗生素配制成濃度為5120μg/mL的母液，用0.22μm濾膜過濾除菌，然后用無菌水進(jìn)行逐級(jí)稀釋，得到如下各種抗生素溶液：濃度為0.016μg/mL、μg/mL0.032μg/mL、0.064μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL或8μg/mL的紅霉素溶液；濃度為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL或256μg/mL的硫酸鏈霉素溶液；濃度為0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL或256μg/mL的慶大霉素溶液；濃度為2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL或1024μg/mL的硫酸卡那霉素溶液；濃度為0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL或64μg/mL的鹽酸四環(huán)素溶液；濃度為0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL或128μg/mL的萬古霉素溶液；濃度為0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL或128μg/mL的氯霉素溶液；濃度為0.032μg/mL、0.063μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL或16μg/mL的氨芐青霉素鈉溶液；濃度為0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL或64μg/mL的利福平溶液；濃度為0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL或128μg/mL的甲氧芐胺嘧啶溶液。2、植物乳桿菌CH126用液體MRS培養(yǎng)基稀釋1000倍，得到菌濃度為1×108CFU/mL的菌液。3、取96孔板，試驗(yàn)孔每孔加入70μL步驟2制備的菌液和70μL步驟1制備的抗生素溶液，陽性對照孔每孔加入70μL步驟2制備的菌液和70μL無菌水，陰性對照孔每孔加入70μL液體MRS培養(yǎng)基和70μL無菌水，37℃靜置培養(yǎng)16h，然后觀察96孔板中菌株的生長情況，明顯無菌株生長的孔所對應(yīng)的抗生素濃度即該抗生素對菌株的最小抑制濃度。每種抗生素的每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)平行處理。結(jié)果見表5。植物乳桿菌CH126對氯霉素、利福平、青霉素比較敏感，對萬古霉素、卡那霉素表現(xiàn)出強(qiáng)耐藥性。表5植物乳桿菌CH126對不同抗生素的最低抑菌濃度(μg/mL)四、對α-葡萄糖苷酶抑制性試驗(yàn)1、取植物乳桿菌CH126菌體，用PBS緩沖液(pH6.8、0.1mol/L)懸浮，得到菌濃度為1×109CFU/mL的菌液。2、取50μL步驟1制備的菌液，加入100μLPBS緩沖液(pH6.8、0.1mol/L)，再加入100μL20mmol/L的對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷水溶液(PNPG溶液)，混勻后37℃孵化10min，然后加入60μL20U/mLα-葡萄糖苷酶水溶液，然后37℃孵化20min，然后加入100μL1mol/LNa2CO3水溶液終止反應(yīng)，于405nm處測光密度值。式中：A為樣品組含有菌液以及α-葡萄糖苷酶水溶液；B為樣品組含有菌液不含α-葡萄糖苷酶水溶液(用等體積PBS緩沖液代替)；C為空白對照組不含有菌液(用等體積PBS緩沖液代替)含α-葡萄糖苷酶水溶液；D為空白對照組不含有菌液(用等體積PBS緩沖液代替)也不含有α-葡萄糖苷酶水溶液(用等體積PBS緩沖液代替)。植物乳桿菌CH126對α-葡萄糖苷酶抑制率見表6。植物乳桿菌CH126對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出一定的抑制作用，可以改善葡萄糖的代謝。表6植物乳桿菌CH126對α-葡萄糖苷酶抑制率菌株抑制率CH12629.35±2.16％實(shí)施例3、植物乳桿菌CH126對血糖的調(diào)節(jié)作用一、分組處理方式80只雄性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分成4組，每組20只，分組處理如下：空白對照組：從試驗(yàn)開始至結(jié)束均采用普通飼料飼喂；第9周，小鼠空腹12小時(shí)后一次性腹腔注射生理鹽水30mg/kg；第10周至第13周進(jìn)行給藥，給藥劑量為“每千克體重每次給予12mL無菌PBS緩沖液”；模型組：第1周至8周用高脂飼料飼喂，第9周至試驗(yàn)結(jié)束用普通飼料飼喂；第9周，小鼠空腹12小時(shí)后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg；第10周至第13周進(jìn)行給藥；給藥劑量為“每千克體重每次給予12mL無菌PBS緩沖液”；陽性對照組：第1周至8周用高脂飼料飼喂，第9周至試驗(yàn)結(jié)束用普通飼料飼喂；第9周，小鼠空腹12小時(shí)后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg；第10周至第13周進(jìn)行給藥；給藥劑量為“每千克體重每次給予12mL二甲雙胍溶液(12mL二甲雙胍溶液中含有120mg二甲雙胍；二甲雙胍溶液的溶劑為PBS緩沖液)”；CH126組：第1周至8周用高脂飼料飼喂，第9周至試驗(yàn)結(jié)束用普通飼料飼喂；第9周，小鼠空腹12小時(shí)后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg；第10周至第13周進(jìn)行給藥；給藥劑量為“每千克體重每次給予12mL菌液(菌液的制備方法：用PBS緩沖液懸浮植物乳桿菌CH126，得到植物乳桿菌CH126濃度為1.0×109CFU/mL的菌液)”。給藥方式為：灌胃給藥，一天一次。第1周至8周即試驗(yàn)第1-56天，第10周至13周即試驗(yàn)第64-91天，以此類推。腹腔注射鏈脲佐菌素或生理鹽水在試驗(yàn)第57天進(jìn)行。二、判斷建立糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)第9周(試驗(yàn)第63天)，尾靜脈采血測定小鼠空腹血糖值(FBG)。滿足如下標(biāo)準(zhǔn)的小鼠即為2型糖尿病模型小鼠：連續(xù)兩次測定FBG≥11.1mmol/L。結(jié)果表明，試驗(yàn)第57天，模型組、陽性對照組和CH126組各個(gè)小鼠均為2型糖尿病模型小鼠，空白對照組各個(gè)小鼠均為空腹血糖正常的小鼠。三、血糖檢測分別于第10周、第11周、第12周、第13周和第14周，尾靜脈采血測定小鼠空腹血糖值(每天檢測，計(jì)算該周的平均值)。空腹血糖值結(jié)果見表7。與模型組相比，CH126組小鼠空腹血糖值呈下降趨勢。CH126組小鼠空腹血糖值在第12周、第13周、第14周顯著下降，第14周時(shí)血糖值降到12.35mmol/L，與模型組小鼠相比均有極顯著差異(P＜0.01)。結(jié)果表明，植物乳桿菌CH126對2型糖尿病的高血糖癥有治療作用，能顯著降低空腹血糖值。表7植物乳桿菌CH126對2型糖尿病小鼠空腹血糖的影響注：與模型組比較，*有顯著性差異(P＜0.05)，**有極顯著性差異(P＜0.01)。四、血清中相關(guān)指標(biāo)的檢測試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(試驗(yàn)第100天)，取各組小鼠，摘眼球取血，室溫凝固60min后3000r/min離心15min，收集上清(血清)。檢測血清中的總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛、游離脂肪酸、內(nèi)毒素、D-乳酸的含量。血清中血脂相關(guān)因子的檢測結(jié)果見表8。模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均明顯高于空白對照組，HDL-C含量明顯低于空白對照組，這是由于糖尿病引起小鼠體內(nèi)代謝紊亂。與模型組相比，CH126組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量下降。結(jié)果表明，植物乳桿菌CH126能明顯改善2型糖尿病的高血脂癥狀。表8植物乳桿菌CH126對2型糖尿病小鼠血脂的影響注：與模型組比較，*有顯著性差異(P＜0.05)，**有極顯著性差異(P＜0.01)。血清中胰島素的檢測結(jié)果見圖1。高糖環(huán)境抑制葡萄糖刺激胰島素分泌功能，導(dǎo)致血清胰島素含量下降，灌胃植物乳桿菌CH126能有效緩解體內(nèi)代謝紊亂，控制血糖，改善胰島功能，提高血清胰島素含量(P＜0.05)。血清中抗氧化相關(guān)因子的檢測結(jié)果見表9。2型糖尿病引起的過氧化損傷導(dǎo)致模型組小鼠血清中抗氧化活力下降，小鼠灌服植物乳桿菌CH1264周后小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力均明顯提高，CH126組血清中SOD、CAT分別提高到56.48U/mL、23.89U/mL，與模型組相比差異極顯著(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)CH126組血清中GSH-Px水平提高到91.24nmol/mL(P<0.05)；血清中MDA含量均顯著降低。結(jié)果表明植物乳桿菌CH126能顯著提高小鼠血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，抑制丙二醛活力，表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力。表9植物乳桿菌CH126對2型糖尿病小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響注：與模型組比較，*有顯著性差異(P＜0.05)，**有極顯著性差異(P＜0.01)。血清中D-乳酸、游離脂肪酸、內(nèi)毒素的檢測結(jié)果見表10。2型糖尿病引起的機(jī)體葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致大量的D-乳酸、游離脂肪酸、內(nèi)毒素進(jìn)入血液，影響正常的生理代謝。植物乳桿菌CH126的攝入可以不同程度的改善血清中D-乳酸、游離脂肪酸、內(nèi)毒素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后CH126組小鼠血清中D-乳酸、游離脂肪酸含量明顯下降到2.27μmol/mL、689.27μg/L，內(nèi)毒素含量降低到71.34EU/L(P<0.05)。結(jié)果表明，植物乳桿菌CH126可能通過調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，抑制D-乳酸、游離脂肪酸、內(nèi)毒素大量進(jìn)入血液。表10植物乳桿菌CH126對2型糖尿病D-乳酸、游離脂肪酸、內(nèi)毒素含量的影響組別D-Lactate(μmol/mL)FFA(μg/L)ET(EU/L)空白對照組1.96±0.23567.14±6.4859.47±4.92模型組3.05±0.47722.48±5.3482.16±5.84二甲雙胍組2.11±0.26*665.38±4.6764.55±7.69**CH126組2.27±0.38689.27±4.5971.34±6.60*SEQUENCELISTING<110>吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>植物乳桿菌CH126及其在制備降糖功能性食品中的應(yīng)用<130>GNCYX170653<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1504<212>DNA<213>植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）<400>1cgatctcgctcttgttacgacttcaccctaatcatctgtcccaccttaggcggctggttc60ctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgt120gtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccg180acttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagc240ttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggt300cataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtc360tcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcggca420cttaaccccacactctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccccctgtatccatgt480ccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttc540ttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcc600tttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcag660cactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccag720ggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagac780agccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggag840ttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagc900cgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatcc960ggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggcttt1020ctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactcctcagatatgttcttctttaacaac1080agagttttacggagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcg1140tccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcc1200caatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttacc1260ccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccgaagccatctttca1320agctcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtttccaggtgttatc1380ccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccactcactcaaatgta1440aatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgcatgtattaggcagg1500gccg1504當(dāng)前第1頁1 2 3