本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種能夠顯著緩解便秘的兩歧雙歧桿菌及其用途。

背景技術(shù)：

雙歧桿菌是人體必需營養(yǎng)源，可自身合成多種消化酶和B族維生素，如維生素B1、B2、B6、B12、葉酸、煙酸等多種維生素，幫助機(jī)體消化一些依靠本身酶系不能消化的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)雙歧桿菌也能合成、吸收和利用多種B族維生素，并能以氨為氮源，在腸道內(nèi)合成氨基酸和尿素，降低血氨濃度，提高機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的蓄積。另外，雙歧桿菌通過代謝產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH和Eh(氧化還原電位)后，有利于鈣、鐵、鋅、鎂等礦物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)生長。近年來，雙歧桿菌以其特殊的生理活性和營養(yǎng)功能而成為益生菌的主要來源，正日益引起人們的重視。

便秘(constipation)是臨床常見的多種疾病的一個(gè)癥狀，主要是指排便次數(shù)減少、頻率低，在不使用瀉劑的情況下，每3-4天或更長的時(shí)間排便1次，每周排便次數(shù)少于3次，糞便量減少、糞便干結(jié)、排便費(fèi)力、排便不盡，排便同時(shí)并伴有腹痛、腹脹等。便秘在人群中的患病率高達(dá)27％，但只有一小部分便秘者會(huì)就診。便秘可以影響各年齡段的人。女性多于男性，老年多于青、壯年，而且隨著年齡的增加，便秘也會(huì)逐漸加重，是誘發(fā)中老年男性高血脂、心腦血管疾病、動(dòng)脈硬化、腫瘤等疾病及其并發(fā)癥的罪魁禍?zhǔn)祝瑥亩鴮?dǎo)致老人心腦血管病變死亡率急劇增加，出現(xiàn)痔瘡、肛裂等問題，令人痛苦不堪。

另外長期便秘，大量便渣會(huì)滯留在腸道內(nèi)發(fā)酵、腐爛，大量毒素和有害菌被腸道反復(fù)吸收，通過血液循環(huán)到達(dá)人體各部位，成為女性健康和美麗的罪魁禍?zhǔn)?。便秘還會(huì)使小孩胃腸道菌群失衡，導(dǎo)致精力不集中、思維遲鈍、營養(yǎng)不良、心情急躁、消瘦、免疫力下降、易感冒、生長遲緩，如不及時(shí)調(diào)理，可能造成不可逆的病變。因便秘發(fā)病率高、病因復(fù)雜，患者常有許多苦惱，便秘嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響生活質(zhì)量。因此，尋找一種能夠代替藥物來預(yù)防便秘的生物制品有很大的現(xiàn)實(shí)意義，微生態(tài)療法恰是以一個(gè)嶄新的手段解決了傳統(tǒng)療法存在的多種問題。

國內(nèi)外對雙歧桿菌的生理功能有大量的研究報(bào)道，但對雙歧桿菌預(yù)防便秘的功能性研究報(bào)道很少。關(guān)于雙歧桿菌預(yù)防便秘的研究對食品科學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和微生態(tài)學(xué)等許多學(xué)科都有很大價(jià)值。發(fā)酵乳制品是人們攝入雙歧桿菌的一條重要渠道，篩選優(yōu)良的具有預(yù)防便秘和安全的雙歧桿菌菌株，對于開發(fā)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳品的附加值將具有重要意義。因此，具有預(yù)防便秘的雙歧桿菌具有很大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

在目前已經(jīng)公開的文獻(xiàn)與專利或?qū)＠暾堉?，例如CN1O2845530A公開了一種有效緩解便秘的復(fù)合益生菌發(fā)酵豆乳飲，用于緩解便秘。CN105079450A公開了緩解老年人陰虛型便秘的益生菌中藥制劑及其制備方法和應(yīng)用，用于制備食品和藥物的組合物，緩解老年人陰虛型便秘，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高抵抗力。CN105394773A公開了一種用于改善便秘的復(fù)合益生菌和膳食纖維制劑來預(yù)防或減輕便秘。CN103908585A公開了一種用于預(yù)防和治療便秘的益生菌發(fā)酵組合物，特別是涉及中藥提取物經(jīng)腸道益生菌發(fā)酵，以提高和改善其預(yù)防和治療便秘的方法。CN102119724A公開了一種預(yù)防便秘熟大黃肉從蓉活菌酸奶片配方及制備方法，用于補(bǔ)不足、益力氣，常服改善腹瀉便秘癥狀。

但是，這些專利或?qū)＠暾埖墓餐c(diǎn)都是應(yīng)用混菌或者菌與中藥或益生元混合使用用于預(yù)防和緩解便秘。到目前為止，還沒有單菌緩解便秘，或者調(diào)解腸道運(yùn)動(dòng)等性能的雙歧桿菌。而且雙歧桿菌作為可食用的菌種之一，除了具有很多益生功能的優(yōu)點(diǎn)外，同時(shí)也不具備緩解便秘的藥物的毒副作用，綜上所述，雙歧桿菌可作為代替藥物的微生物制劑用于調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請?zhí)峁┝艘环N兩歧雙歧桿菌及其用途。本菌株單菌即具有很強(qiáng)的緩解便秘的作用，并且還有調(diào)理腸胃等多種功能和用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種兩歧雙歧桿菌CCFM 16(Bifidobacterium bifidum)，于2017年01月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC NO.13632。

本發(fā)明還提供了一種緩解便秘的組合物，所述組合物包括兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632以及在藥學(xué)上可接受的載體。

所述的組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液劑型。

優(yōu)選的，所述在藥學(xué)上可接受的載體包括醫(yī)學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵食品，所述發(fā)酵食品為使用含有兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的發(fā)酵劑生產(chǎn)的乳制品、豆制品與果蔬制品；所述發(fā)酵劑是指含有所述兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的產(chǎn)品，使用該產(chǎn)品可以快速發(fā)酵產(chǎn)生終端食品。

優(yōu)選的，所述的乳制品包括牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品包括豆奶、豆豉或豆醬；所述的果蔬制品包括黃瓜、胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。

本發(fā)明還提供了一種含有兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的菌劑，所述菌劑為將含有兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的菌液干燥得到的粉劑，它含有大于10⁶CFU/g的活性兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632。

優(yōu)選的，所述干燥是指真空冷凍干燥或其它菌液干燥工藝。

本發(fā)明還提供了所述的發(fā)酵食品或者菌劑的用途，所述發(fā)酵食品或者菌劑均有緩解便秘的作用。

本發(fā)明還提供了一種制備兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632菌劑的方法，包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)基的制備：兩歧雙歧桿菌的培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基，即MRS培養(yǎng)基+0.05％L-半胱氨酸鹽酸鹽，調(diào)整其pH為6.8±0.2，得到培養(yǎng)基；

(2)保護(hù)劑的制備：使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L-150g/L脫脂奶粉、100g/L-150g/L麥芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖、余量為水的凍干保護(hù)劑；

(3)兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632菌種按照以所述培養(yǎng)基的質(zhì)量計(jì)2-4％的接種量接種到在119-123℃條件下滅菌15-25min后的培養(yǎng)基中，然后在溫度35-39℃厭氧條件下培養(yǎng)24-48h，用pH為6.8-7.2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護(hù)劑重懸，使菌濃達(dá)到10¹⁰CFU/mL；接著，讓該懸浮液在溫度37℃厭氧條件下預(yù)培養(yǎng)50-70min，再在-15～-20℃預(yù)凍8-14h，最后進(jìn)行真空冷凍干燥得到所述的發(fā)酵菌劑。

所述兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632具有下述生物學(xué)特性：

(1)菌體特征：呈革蘭氏染色陽性，具有耐酸性，在pH 3.0-8.0環(huán)境條件下生長良好，不形成孢子，不運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌。菌體約0.5-1.3μm×1.5-8μm，外觀變化很大的桿狀體，其菌株的一般特征是均一或分枝或分叉的Y和V類型，以及棍棒狀或匙狀類型，單生、成對、有時(shí)呈鏈。

(2)菌落特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0.2-2.5mm之間，圓形，凸面或透鏡狀，微白，不透明，有平滑至粘液狀的柔軟表面，不形成菌絲體。MRS培養(yǎng)基深層菌落的形態(tài)不定，靠近表面不生長。

(3)生長特性：該菌株最適生長溫度為36-38℃，32-38℃生長良好，生長極限為23-25℃不等，20℃以下和45℃不生長。最適初始pH為6-7，pH 5.5或以下生長少或不生長。在含有葡萄糖的培養(yǎng)液中厭氧培養(yǎng)生長良好，混濁，若無絮狀沉淀，最后將變清，最終pH為4.0-4.8。

(4)對模擬胃腸液具有較好的耐受能力；

(5)具有粘附性，能夠較好的粘附在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29上；

(6)能顯著提高便秘小鼠的糞便含水量以及整個(gè)腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，其緩解便秘的效果與瀉劑酚酞相當(dāng)。

本菌株的提取方法為：

(一)乳酸菌的分離篩選

(l)收集若干份健康成人糞便，將糞便樣品在含有低聚果糖MRS+0.05％-0.1％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸培養(yǎng)基中富集12h；

(2)將糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋后涂布于添加了0.02％嗅甲酚紫的MRS+0.05％-0.1％半胱氨酸的固體平板上，培養(yǎng)24-48h；

(3)選取變色圈明顯，并且符合乳酸菌基本形態(tài)的單菌落進(jìn)行平板劃線純化，篩選分離出乳酸菌；

(4)將上述單菌落培養(yǎng)于液體MRS+0.05％-0.1％半胱氨酸培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后進(jìn)行革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

(二)雙歧桿菌的初步鑒定：果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶測定法

(l)將步驟(一)所篩選得到的乳酸菌在液體MRS+0.05％-0.1％半胱氨酸培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，然后取lmL培養(yǎng)物8000rpm離心2min；

(2)用含0.05％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的pH6.5的0.05M KH₂PO₄溶液洗滌兩次；

(3)重懸于200uL添加了0.25％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))Triton X-100的上述磷酸鹽緩沖液；

(4)添加50uL濃度為6mg/mL氟化鈉和10mg/mL碘乙酸鈉的混合液以及50uL濃度為80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；

(5)添加300uL濃度為0.139g/mL、pH 6.5的鹽酸輕胺，并于室溫放置10min；

(6)分別添加200uL15％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的三氯乙酸和4M HCI；

(7)添加200uL含有5％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))三氯化鐵的0.1M HCI，若體系迅速變?yōu)榧t色，即為F6PPK陽性，可初步斷定其為雙歧桿菌。

(三)雙歧桿菌的分子生物學(xué)鑒定

(l)單菌基因組抽提

A.將步驟(二)所篩選得到的乳酸菌培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)過夜的菌懸液lmL于1.5mL離心管，10000rpm離心2min，棄上清得菌體；

B.用lmL無菌水吹洗菌體后，10000rpm離心2min，棄上清得菌體；

C.加入200uLSDS裂解液，80℃水浴30min；

D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌體裂解液中，其中酚-氯仿溶液的組成成分及體積比為Tris飽和酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1，顛倒混勻后，12000rpm離心5-10min，取上清200uL；

E.加入400uL冰乙醇或冰異丙醇于200uL上清中，﹣20℃靜置1h，12000rpm離心5-10min，棄上清；

F.加入500uL70％(體積百分?jǐn)?shù))冰乙醇重懸沉淀，12000rpm離心1-3min，棄上清；

G.60℃烘箱烘干，或者自然晾干；

H.50uLddH₂O重溶沉淀以備PCR；

(2)16S rDNA PCR

A.細(xì)菌16S rDNA 50uLPCR反應(yīng)體系：

10×Taq buffer，5uL；dNTP，5uL；27F，0.5uL；1492R，0.5uL；Taq酶，0.5uL；模板，0.5uL；ddH₂O，38uL。

B.PCR條件：

95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30×；72℃5min；12℃2min；

(3)制備1％瓊脂糖凝膠，之后將PCR產(chǎn)物與10000×loading buffer混合，上樣量5uL，120V跑30min，然后進(jìn)行凝膠成像；

(4)將16S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，將得到的序列結(jié)果使用BLAST在GeneBank中進(jìn)行搜索和相似性比對，選取測序結(jié)果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌，﹣80℃保藏備用；

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632具有耐酸性，可顯著提高小鼠糞便的含水量以及首粒排黑便時(shí)間，其效果與瀉劑酚酞相當(dāng)。但其促進(jìn)小腸推進(jìn)率的效果卻優(yōu)于瀉劑酚酞，因此，本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632可代替藥物治療便秘，且不具有藥物的毒副作用。所以所述的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632可用于制備緩解便秘功能的藥物組合物與發(fā)酵食品，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本菌株對便秘相關(guān)指標(biāo)：小鼠糞便含水量的改善情況；

圖2是本菌株對便秘相關(guān)指標(biāo)：小鼠首粒排黑便時(shí)間的降低情況；

圖3是本菌株對便秘相關(guān)指標(biāo)：小鼠小腸推進(jìn)率的改善情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例、測試?yán)瑢Ρ景l(fā)明進(jìn)行具體描述。

實(shí)施例1：兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632灌喂小鼠時(shí)小鼠的耐受劑量實(shí)驗(yàn)

將兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632凍干菌粉重懸于脫脂乳粉中，制成濃度為4.0×10⁹CFU/mL的菌懸液。取體重25g左右的健康雄性BALB/c小鼠10只，每日給予該濃度懸液灌胃一次，觀察一周，記錄死亡和體重情況。

這些試驗(yàn)結(jié)果列于表1中。這些結(jié)果表明，喂食濃度4.0×10⁹CFU/mL的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632未對小鼠造成明顯影響，體重?zé)o顯著變化，無死亡現(xiàn)象產(chǎn)生。小鼠外觀無明顯病理癥狀。

表1 小鼠體重的變化及死亡情況

注：-：小鼠無死亡

實(shí)施例2：兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對小鼠便秘的緩解作用

取體重20-25g的健康雄性BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為5組：空白對照組、便秘模型對照組、兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組、植物乳桿菌對照組和酚酞治療對照組，每組含小鼠8只。

實(shí)驗(yàn)前14天每天給干預(yù)組小鼠灌喂按本說明書實(shí)施例1制備的濃度為4.0×10⁹CFU/mL的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632脫脂乳懸液0.25mL，植物乳桿菌組灌胃等量的L.plantarumST-III，其余3組灌喂等量的不含菌的脫脂乳。試驗(yàn)第15-17天，陰性對照組灌胃0.25mL生理鹽水，其余四組灌胃0.25mL，1mg/mL的洛哌丁胺溶液，確保小鼠洛哌丁胺的灌胃量為10mg/kg·body weight。

灌胃結(jié)束1h后，陰性對照組和便秘模型對照組灌胃脫脂乳，兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組小鼠灌喂按本說明書實(shí)施例1制備的濃度4.0×10⁹CFU/mL的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.136320.25mL，酚酞治療對照組灌胃0.25mL，7mg/mL的酚酞溶液，確保小鼠酚酞灌胃量為70mg/kg·body weight。植物乳桿菌組灌胃0.25mL，4.0×10⁹CFU/mL的L.plantarum ST-III。

實(shí)驗(yàn)期間的每天收集小鼠糞便，用于小鼠糞便含水量的計(jì)算，按下式計(jì)算糞便含水量。糞便含水量(％)＝(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重x100。第17天上午除空白對照組灌胃生理鹽水，其余組均灌胃洛哌丁胺，灌胃1h后，對所有小鼠灌胃活性炭阿拉伯樹膠水溶液0.25mL，然后將每只小鼠單獨(dú)放置在一個(gè)干凈的鋪有吸水紙的不銹鋼籠中，記錄從灌胃活性炭開始到第一粒黑便排出的時(shí)間(min)，作為首粒排黑便時(shí)間，用于評價(jià)兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對小鼠便秘的緩解作用，期間小鼠自由進(jìn)食和飲水。

在17日下午6點(diǎn)左右對小鼠進(jìn)行禁食，于18日上午重復(fù)17日上午的實(shí)驗(yàn)一次，不同之處就是在灌胃洛哌丁胺30mim后，取血并處死小鼠，剖開腹腔并分離小鼠的腸系膜，剪取上自幽門、下至回盲部的整根腸管，放于吸水紙上，將此條腸管拉成直線，所測腸管長度即為小腸總長度，從幽門至活性炭汁前沿為“活性炭推進(jìn)長度”。通過測量小腸中活性炭的推進(jìn)長度，按下式計(jì)算推進(jìn)率。推進(jìn)率(％)＝(活性炭推進(jìn)距離)/(小腸總長度)×100。計(jì)算小腸推進(jìn)率的目的就是確定兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對小鼠小腸蠕動(dòng)的影響。

這些試驗(yàn)結(jié)果如附圖1，2，3所示，由這3組圖可以看出，通過對便秘模型組與兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組、植物乳桿菌對照組和酚酞治療對照組的小鼠糞便含水量、首粒排黑便時(shí)間以及小腸推進(jìn)率的比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632、植物乳桿菌對照組和酚酞治療對照組均能夠顯著提高糞便的含水量、小腸推進(jìn)率以及縮短首粒黑便時(shí)間，其中本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632在改善糞便含水量、提高整個(gè)腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間方面優(yōu)于植物乳桿菌對照組，且達(dá)到瀉劑酚酞的治療效果，而在提高小腸推進(jìn)率方面優(yōu)于酚酞并呈現(xiàn)最好的效果。這說明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的確具有非常顯著的緩解便秘的作用。

實(shí)施例3：兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對便秘小鼠血清中便秘相關(guān)胃腸肽的調(diào)節(jié)作用

取體重20-25g的健康雌性BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為5組：空白對照組、便秘模型對照組、兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組、植物乳桿菌對照組和酚酞治療對照組，每組含小鼠8只。實(shí)驗(yàn)前14天每天給干預(yù)組小鼠灌喂按本說明書實(shí)施例1制備的濃度為4.0×10⁹CFU/mL的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632脫脂乳懸液0.25mL，植物乳桿菌對照組灌胃等量的L.plantarumST-III，其余3組灌喂等量的不含菌的脫脂乳。試驗(yàn)第15-17天，空白對照組灌胃0.25mL生理鹽水，其余四組灌胃0.25mL，1mg/mL的洛哌丁胺溶液，確保小鼠洛哌丁胺的灌胃量為10mg/kg·body weight。

灌胃結(jié)束1h后，陰性對照組和便秘模型對照組灌胃脫脂乳，兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組小鼠灌喂按本說明書實(shí)施例1制備的濃度4.0×10⁹CFU/mL的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632，酚酞治療對照組灌胃0.25mL，7mg/mL的酚酞溶液，確保小鼠酚酞灌胃量為70mg/kg·body weight。植物乳桿菌組灌胃0.25mL，4.0×10⁹CFU/mL的L.plantarum ST-III。

在17日下午6點(diǎn)左右對小鼠進(jìn)行禁食，于18日上午取血并處死小鼠，4℃，3000g離心15min，取上層血清。按照胃動(dòng)素(MTL)、胃泌素(Gas)、內(nèi)皮素(ET)、生長抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)和血管活性腸肽(VIP)測試試劑盒說明書的方法測定血清中上述因子水平。其試驗(yàn)結(jié)果列于下表2。

表2 便秘小鼠血清中便秘相關(guān)胃腸肽的調(diào)節(jié)作用

注：a，b，c，d字母表示不同字母所代表的組別都存在顯著性差異(P＜0.5)

由表2可以看到相對便秘模型組，本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632干預(yù)組的小鼠血清中興奮性遞質(zhì)MTL，Gas和SP呈現(xiàn)增長的趨勢，而抑制性遞質(zhì)SS，ET和VIP呈現(xiàn)下降的趨勢，其中本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632可將便秘小鼠的便秘相關(guān)胃腸肽遞質(zhì)調(diào)節(jié)到正常小鼠水平，這是其他兩組陽性對照所不能達(dá)到的，由此證明本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632可以很好的調(diào)節(jié)便秘引起的胃腸肽類物質(zhì)的分泌。

實(shí)施例4：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制造含該菌的牛乳

將原料乳脫脂奶在95℃熱殺菌20min，然后冷卻至4℃，再加入在本說明書描述的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10⁶CFU/ml以上，在4℃下冷藏保存，于是，得到含有本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632活菌的牛乳。

實(shí)施例5：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制造含該菌的豆奶

采用軟水浸泡大豆，在溫度80℃下浸泡2h，再去除大豆皮。接著，瀝去浸泡水，再加沸水磨漿，并在高于80℃的溫度條件下保溫12min。得到的漿料用150目篩網(wǎng)過濾，接著進(jìn)行離心分離，得到的離心液即為粗豆奶，再將它加熱到溫度140-150℃，然后將此粗豆奶迅速導(dǎo)入真空冷卻室進(jìn)行抽真空，所述粗豆奶中的異味物質(zhì)隨著水蒸汽迅速排出。經(jīng)過真空脫氣后，將其溫度降至約37℃，再接入本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632工作發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10⁶CFU/ml以上，在溫度4℃下冷藏保存，于是得到含有本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632活菌的豆奶。

實(shí)施例6：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制造含該菌的果蔬飲料

選用新鮮蔬菜洗凈后榨汁，接著進(jìn)行高溫瞬間滅菌，在溫度140℃下高溫?zé)釟⒕?秒后，立即降溫至37℃，再接入本發(fā)明制備的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632菌劑發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10⁶CFU/mL以上，在溫度4℃下冷藏保存，于是得到含有本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632活菌的果蔬飲料。

實(shí)施例7：制備含有本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的膠囊制品

將本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，在溫度4℃條件下，4000g離心20min，用pH7.2磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，用脫脂乳重懸菌體，并使最終菌體濃度達(dá)到1×10¹⁰-3×10¹⁰CFU/mL。將菌懸液加入到3％的海藻酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢瑁沟眉?xì)胞均勻地分散于海藻酸鈉溶液中，然后將此混合液擠壓到2％的氯化鈣溶液中形成膠粒，靜止固化30min，過濾收集膠粒，將收集得到的膠粒進(jìn)行冷凍干燥48h，得到含有本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的粉劑，把這種粉劑裝入到在目前市場上銷售的藥用膠囊中，得到所述的膠囊制品。

實(shí)施例8：使用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制備用于生產(chǎn)乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑

將兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632按照以培養(yǎng)基體積計(jì)3％的接種量接種于115℃滅菌20min的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基+0.05％L-半胱)調(diào)整其pH為7.0。然后，將接種兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的培養(yǎng)基在溫度37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，用pH7.2磷酸鹽緩沖液清洗兩次，再用保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度10¹⁰CFU/mL。所述的保護(hù)劑含有100g/L-150g/L脫脂奶粉、100g/L-150g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖。

接著，將該懸浮液在溫度37℃厭氧條件下預(yù)培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥，得到所述的乳制品、豆制品以及果蔬制品的發(fā)酵劑。

實(shí)施例9：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制備發(fā)酵乳

鮮奶加糖溶解后，在溫度65℃與20MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)，然后在溫度95℃下保溫殺菌5min，再將溫度降到37℃，加入本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632、商業(yè)干粉發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和商業(yè)干粉發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌組成的混合菌，它們的質(zhì)量比例為1：1：1，所述混合菌的接種量為鮮奶重量的0.03％，混勻，在溫度37℃下保溫厭氧發(fā)酵，凝乳后，在溫度4℃下冷藏24h，得到所述的發(fā)酵乳。

實(shí)施例10：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制備片劑

分別稱取冷凍干燥后制得的本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632菌粉制劑25.7重量份、淀粉55.0重量份、纖維素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉鈉12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份與水1.0重量份，混合，采用常規(guī)方法制成濕顆粒，然后使用例如中南制藥機(jī)械廠生產(chǎn)的壓片機(jī)進(jìn)行壓片，然后使用例如青州市益康中藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)的小型藥物干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，再包裝得到本發(fā)明的片劑。

實(shí)施例11：利用本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632制備丸劑

分別稱取冷凍干燥方法制備的本發(fā)明兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632菌粉制劑32.2重量份、微晶纖維素48.0重量份、聚乙烯吡咯烷酮4.5重量份、碳酸鈣10.0重量份、硬脂酸鎂2.8重量份、卵磷脂1.3重量份與乙醇1.2重量份?；旌暇鶆?，再加入常規(guī)量的煉蜜制成本發(fā)明的丸劑。

實(shí)施例12：兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632在模擬胃腸液的耐受性

將冷凍保存的兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632接種于改良MRS培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基+0.05％半胱氨酸鹽酸鹽)中，在溫度37℃厭氧培養(yǎng)48h，再經(jīng)改良MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2～3次后，取1mL兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632的培養(yǎng)液，其菌體用1.0mL pH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗菌體兩次，再用1.0mL pH7.2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.0mL pH 2.5人工胃液混合，然后在37℃下厭氧培養(yǎng)，分別在開始(0h)和3h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。

存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌數(shù)對數(shù)值與在第0h時(shí)活菌數(shù)對數(shù)值之比，以％表示。取經(jīng)人工胃液處理的培養(yǎng)液1.0mL加入9mL人工腸液中，然后在37℃下厭氧培養(yǎng)，分別在開始(0h)、2h、4h和8h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌數(shù)對數(shù)值與在第0h時(shí)活菌數(shù)對數(shù)值之比，以％表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632在人工胃腸液中的存活率在80％以上。結(jié)果見表3由此可見，兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對人工胃腸液具有較好的耐受性。

表3 兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632在模擬胃腸液的耐受性

注：a，b字母表示不同字母所代表的組別都存在顯著性差異(P＜0.5)

實(shí)施例13：兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的粘附能力測定

將放置于液氮罐中的HT-29細(xì)胞的凍存管迅速置于37℃水浴鍋中使其融化；將其與DMEM培養(yǎng)液一同混入培養(yǎng)皿中，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，每隔一天換一次培養(yǎng)液；其中，所述DMEM培養(yǎng)液為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))胎牛血清+1％(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))青鏈霉素。

待傳代3-4次后，細(xì)胞長滿80％培養(yǎng)板之后，胰酶消化，PBS清洗后，離心，用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵cells/mL，并且在事先置入載玻片的6孔板中培養(yǎng)10h；將兩歧雙歧桿菌CGMCC NO.13632過夜培養(yǎng)，用DME基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整過夜培養(yǎng)的菌懸液的濃度為10⁷CFU/mL，與上述HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)4h；PBS清洗3次，然后用甲醇固定-10min，甲醇的添加量以鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板為宜。

之后進(jìn)行革蘭氏染色，染色后取出載玻片，在100倍的油鏡下觀察，其中，20個(gè)隨機(jī)選取的視野當(dāng)中總的細(xì)菌數(shù)大于100個(gè)，即屬于粘附能力強(qiáng)的菌。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。