本發(fā)明涉及一種活性菌的培養(yǎng)方法，更具體而言，涉及一種枯草芽孢桿菌的新型培養(yǎng)方法，屬于微生物培養(yǎng)和微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)屬于芽孢桿菌屬更進(jìn)一步的屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，呈單個(gè)細(xì)胞形式，無(wú)莢膜，通常為(0.7-0.8)×(2-3)微米。

枯草芽孢桿菌是一種益生菌，其具有多種生物功能，可應(yīng)用于多個(gè)技術(shù)領(lǐng)域中，例如：其具有繁殖速度快、產(chǎn)生大量?jī)?nèi)生消化酶、提高飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、提高肥效、可作為微生物農(nóng)藥、降解飼料中復(fù)雜有機(jī)物、促進(jìn)吸收、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗病力等等，從而在畜牧業(yè)、飼料業(yè)、農(nóng)藥、肥料、殺菌、石油開(kāi)采、園林業(yè)、蛋白質(zhì)多肽合成等多個(gè)領(lǐng)域中都具有廣泛的應(yīng)用，且其應(yīng)用領(lǐng)域和新的用途也一直在研究和拓展中。

正是由于枯草芽孢桿菌如此重要的作用，人們對(duì)于各種枯草芽孢桿菌制品以及枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基等進(jìn)行了大量的深入研究，取得了諸多的研究成果，例如：

CN1506455A公開(kāi)了一種植物枯草芽孢桿內(nèi)生菌及其制劑，其菌株BS-2(Bacillussubtilis，CGMCC NO.0819)，是由辣椒葉片內(nèi)分離，經(jīng)人工誘變篩選出的新菌株?？稍谳^低的菌液濃度下主動(dòng)進(jìn)入植物體內(nèi)，并能在植物體內(nèi)定殖繁殖和傳導(dǎo)；對(duì)植物同時(shí)具有促進(jìn)生長(zhǎng)和防病作用；其制劑用于浸種時(shí)對(duì)白菜和辣椒苗鮮重可增加90％以上；噴霧施用時(shí)，對(duì)辣椒苗和果的炭疽病、白菜炭疽病及香蕉炭疽病具有80％以上的防病效果。

CN1508243A公開(kāi)了一種用于凈化水質(zhì)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，CCTCC，M202045以及用該菌在固體培養(yǎng)基，適當(dāng)?shù)奶肌⒌葪l件下培養(yǎng)、發(fā)酵然后經(jīng)干燥，生產(chǎn)一種有效凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的枯草芽孢桿菌制劑。該菌去除水體COD效率高，能迅速降解有機(jī)物，具有一定的反硝化能力、降解殘?jiān)芰洼^強(qiáng)的降解硫化物的能力，小試結(jié)果表明：該菌在24小時(shí)消除COD可達(dá)76％；小試菌劑有效活菌數(shù)達(dá)3000億/克以上；中試菌劑有效活菌數(shù)達(dá)200億/克以上；同時(shí)具有耐鹽、耐滲透壓、維持養(yǎng)殖水體適宜pH等優(yōu)良特性。

CN101933946A公開(kāi)了一種禽類(lèi)枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括下述步驟：(1)用牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基復(fù)活枯草芽孢桿菌，作為一級(jí)種子；(2)將復(fù)活的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基加生物素培養(yǎng)，作為二級(jí)種子；(3)將牛肉湯蛋白胨、豆芽汁與二級(jí)種子液均勻混合，發(fā)酵培養(yǎng)；(4)將發(fā)酵液過(guò)濾，濾液即細(xì)菌代謝物制備口服液，菌體沉淀用石粉作為載體吸附干燥制備干粉，作為飼料添加劑。所述方法能改善固體發(fā)酵難于分離菌體的問(wèn)題，可極大地提高提純化效率，能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。同時(shí)枯草芽孢桿菌代謝物的作用也被充分利用。所述菌體干粉飼料添加劑在應(yīng)用于禽類(lèi)時(shí)，能促進(jìn)禽類(lèi)的生長(zhǎng)及免疫力提高。

CN102168055A公開(kāi)了一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。該方法是經(jīng)激活枯草芽孢桿菌、二步發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品。先接種激活的枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為35-38℃、罐壓0.02-0.06Mpa、通氣比例為1:0.5-1:1、攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150-200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)8-14小時(shí)，得到種子菌液，再將種子菌液接種培養(yǎng)20-26小時(shí)，得到高芽孢率枯草芽孢桿菌液體產(chǎn)品。所述方法的培養(yǎng)基成分易得且價(jià)格便宜、工藝參數(shù)簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短，所得的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)高，并且芽孢率高，達(dá)到3.0×10⁹CFU/ml以上，顯著提高產(chǎn)品的芽孢數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量。

CN102199569A公開(kāi)了一種用于復(fù)合微生物肥料的枯草芽孢桿菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括麩皮粉和小麥粉，重量百分含量分別為：小麥粉0.8％-1.5％，麩皮粉1.5-4％。所述培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單，配置時(shí)不需另外調(diào)節(jié)pH，并能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和芽孢形成，從而提高了產(chǎn)品質(zhì)量，降低了生產(chǎn)成本。

CN102220266A公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌制劑生產(chǎn)方法及其開(kāi)放式發(fā)酵方法。該生產(chǎn)方法包括以下步驟：種子培養(yǎng)基的制備、種子培養(yǎng)基的發(fā)酵、液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、菌種的液體發(fā)酵、枯草芽孢桿菌制劑中培養(yǎng)基成分的配置及滅菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明根據(jù)菌株的特性，將枯草芽孢桿菌菌種與培養(yǎng)基成分混合制成枯草芽孢桿菌培養(yǎng)制劑，采用無(wú)需滅菌、接種和密閉培養(yǎng)條件的開(kāi)放式液體培養(yǎng)方法進(jìn)行小規(guī)模枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，不僅方便枯草芽孢桿菌制劑用戶的使用，更能大幅降低單位活菌數(shù)的生產(chǎn)成本，促進(jìn)我國(guó)枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑在飼料和水產(chǎn)行業(yè)的使用，加速我國(guó)發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的推廣。

CN1022507791A公開(kāi)了一種以豆餅粉為主要原料生產(chǎn)枯草芽孢桿菌菌劑的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中各組分的重量百分含量為：豆餅粉2-4％；葡萄糖0.1-0.5％；氯化銨0.05-0.15％；余量為水。所述培養(yǎng)基能夠促進(jìn)枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)期的大量繁殖，使菌體粗壯整齊，保持產(chǎn)品質(zhì)量不變的情況下，降低了生產(chǎn)成本。

CN102352334A公開(kāi)了一種以固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌活菌的方法，是選用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株，在30-35℃利用固體發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，然后自然風(fēng)干35-45小時(shí)，再經(jīng)粉碎過(guò)80目篩，制得含枯草芽孢桿菌活菌的固體發(fā)酵成品。所述方法原料成本低廉，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，不需要大型設(shè)備，且產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌有效活菌高，為600億/克發(fā)酵干料的產(chǎn)品，能夠滿足微生物肥料的大量需求。

CN106381276A公開(kāi)了一種利用生物碳培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌及其制備方法和用途，所述制備方法以生物碳作為吸附載體，例如木屑、動(dòng)物骨頭、植物根莖等生物碳，以任意一種枯草芽孢桿菌細(xì)菌菌種作為出發(fā)菌株，依次經(jīng)過(guò)如下步驟：步驟(1)試管擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)液體搖瓶培養(yǎng)；(3)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)、(4)發(fā)酵培養(yǎng)和(5)干燥。本發(fā)明所述的方法制備的枯草芽孢桿菌細(xì)菌菌體密度達(dá)到5×10¹³-1×10¹⁵cfu/mL。該方法能把生物吸附與液態(tài)發(fā)酵有機(jī)結(jié)合，提高了液體發(fā)酵的菌體密度，在不添加任何設(shè)備和不使用連續(xù)培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌細(xì)菌的高密度培養(yǎng)，且所培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌細(xì)菌可用作生物肥料的活菌劑或與其他菌種共同作為生物肥料的活菌劑。

CN106148245A公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，它是由如下質(zhì)量百分比的組分組成：玉米粉0.5％-2％、蛋白胨1％-3％、生物氮源1％-5％、蔗糖0.5％-2％、硫酸鎂0.01％-0.1％、硫酸錳0.1％-1％、磷酸氫二鉀0.1％-1％、磷酸二氫鉀0.01％-0.1％，余量為水。該培養(yǎng)基能促進(jìn)枯草芽孢桿菌的良好生長(zhǎng)，提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢率，成本低。

CN106085917A公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，由培養(yǎng)基經(jīng)菌種發(fā)酵得到，其中，所述培養(yǎng)基中的碳源包括毛葉山桐子粕，氮源包括菜籽粕；所述菌種選自酵母菌和根霉菌中的兩種以上。本發(fā)明以毛葉山桐子粕作為碳源、菜籽粕作為氮源，經(jīng)過(guò)酵母菌和根霉菌中的兩種發(fā)酵以后即可獲得枯草芽孢桿菌擴(kuò)繁培養(yǎng)基，以該培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌時(shí)能夠獲得較高的活菌數(shù)，同時(shí)采用毛葉山桐子粕和菜籽粕，極大地降低了生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基用于枯草芽孢桿菌時(shí)，活菌數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)基相當(dāng)，但是成本大幅降低。

CN106190885A公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及其應(yīng)用，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L，硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，所述發(fā)酵培養(yǎng)基使得枯草芽孢桿菌產(chǎn)品中活菌數(shù)200-400cfu/ml，芽孢形成率87-92％。

CN105018397A公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基及其制備方法，其中，培養(yǎng)基由以下重量份數(shù)的成分制得：甘薯4-8份、蛋白胨7-13份、硝酸銨0.05-0.3份、氫氧化鉀0.4-0.8份、磷酸氫鈣0.5-1份、碳酸氫鎂0.3-0.6份、枸杞8-12份、甘蔗6-13份、茅栗7-10份、天花粉5-8份、鄰羥基苯甲酸鈉0.05-0.2份、8-羥基喹啉0.01-0.3份和去離子水70-90份。并公開(kāi)了制備方法。所述培養(yǎng)基應(yīng)用于枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，芽孢產(chǎn)率高，成本低，并且得到的枯草芽孢桿菌具有較高的抑菌性能，穩(wěn)定性好。

如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了枯草芽孢桿菌的多種培養(yǎng)方法以及多種培養(yǎng)基，但對(duì)于新型的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法，仍存在繼續(xù)研究的必要和需求，這正是本發(fā)明得以完成的動(dòng)力所在和基礎(chǔ)所倚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了尋求枯草芽孢桿菌的新型培養(yǎng)方法，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的深入研究，在付出了創(chuàng)造性勞動(dòng)后，從而完成了本發(fā)明。

具體而言，本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：

S1：配制第一液體培養(yǎng)基；

S2：配制第二液體培養(yǎng)基；

S3：菌種培養(yǎng)得到第一培養(yǎng)液；

S4：繼續(xù)培養(yǎng)得到第二培養(yǎng)液，從而完成所述培養(yǎng)方法。

在本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S1具體如下：

S1-1：分別稱(chēng)取如下的基礎(chǔ)物：微量元素水溶液40-50ml、維生素E 1-2g、蘇氨酸300-400mg、L-脯氨酸200-300mg、葡萄糖3-4.5g、蔗糖2-4g、瓊脂5-6g、蛋白胨6-8g、酵母浸膏1.5-3g、10-12g大豆粉和牛肉膏3-5g；

S1-2：將上述基礎(chǔ)物加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml，即得到所述第一液體培養(yǎng)基。

其中，所述微量元素水溶液是將4g硝酸鋅、3.5g硫酸鋅、3g硝酸鎂、1g氯化鈷、2g硝酸銅、2.5g氯化鈣、4g氯化錳、8g氯化亞鐵和3g氯化鐵充分溶解于1000ml蒸餾水中而得到的；然后量取其中的40-50ml，即為上述步驟S1-1中所使用的40-50ml微量元素水溶液。

在本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S2具體如下：

S2-1：同步驟S1-1；

也即別稱(chēng)取如下的基礎(chǔ)物：微量元素水溶液40-50ml、維生素E1-2g、蘇氨酸300-400mg、L-脯氨酸200-300mg、葡萄糖3-4.5g、蔗糖2-4g、瓊脂5-6g、蛋白胨6-8g、酵母浸膏1.5-3g、10-12g大豆粉和牛肉膏3-5g；

S2-2：將所述基礎(chǔ)物和25-40ml無(wú)機(jī)物混合液加入到去離子水中充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml且調(diào)節(jié)pH值為6.4-7.2，即得到所述第二液體培養(yǎng)基。

其中，所述無(wú)機(jī)物混合液是將5g Na₂SO₄、2g NaCl、12g K₂HPO₄、4g Na₃PO₄、7g NH₄Cl、2.5g硼酸、3g KNO₃和5g KI加入到1000ml蒸餾水中充分?jǐn)嚢枞芙舛玫降模蝗缓罅咳∑渲械?5-40ml，即為上述步驟S2-2中所使用的25-40ml無(wú)機(jī)物混合液。

其中，步驟S2-2中將pH值調(diào)節(jié)為6.4-7.2，例如可為6.4、6.6、6.8、7或7.2，最優(yōu)選為6.8。

該pH值調(diào)節(jié)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)非常常規(guī)的技術(shù)手段，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為6.8時(shí)，可以取得最好的技術(shù)效果，這應(yīng)該是該pH值下枯草芽孢桿菌具有最適宜的生長(zhǎng)和繁殖環(huán)境。

而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在步驟S1的S1-1基礎(chǔ)上，繼續(xù)加入步驟S2-2中額外的無(wú)機(jī)物混合液時(shí)，可以顯著促進(jìn)和改善第二培養(yǎng)液的活菌數(shù)量和芽孢率等，這應(yīng)該是當(dāng)加入無(wú)機(jī)物混合液，能夠在第一培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改善和促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)與繁殖，發(fā)明人意欲進(jìn)行后續(xù)的研究。

在本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S3具體如下：

將枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行斜面試管培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌落，然后使用接種環(huán)接1環(huán)接種于120ml所述第一液體培養(yǎng)基中，于溫度T1和轉(zhuǎn)速為140-160轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)30-34小時(shí)，從而得到所述第一培養(yǎng)液。

其中，所述斜面試管培養(yǎng)是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。

其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇任何已知的枯草芽孢桿菌菌株，例如可使用已經(jīng)保藏在中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的編號(hào)為ACCC10619或ACCC03120等的枯草芽孢桿菌菌株，或保藏在中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心的編號(hào)為CGMCC No.0954、CGMCC No.1019、CGMCC No.2099等的枯草芽孢桿菌菌株，或者可以商業(yè)渠道而購(gòu)買(mǎi)獲得多種枯草芽孢桿菌菌株，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。

其中，溫度T1為35-37℃，例如可為35℃、36℃或37℃。

在本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S4具體如下：

按照1.5-1.9:100的體積比，將所述第一培養(yǎng)液接種于所述第二液體培養(yǎng)基中，并降溫至溫度T2，然后以160-170轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌并通風(fēng)(即通入空氣)，培養(yǎng)18-22小時(shí)，從而得到所述第二培養(yǎng)液，完成所述培養(yǎng)方法。

其中，溫度T2為28-32℃，例如可為28℃、29℃、30℃、31℃或32℃，且優(yōu)選T1-T2(即溫度T1與溫度T2的差值)為5-7℃，最優(yōu)選為6℃，即最優(yōu)選T1-T2＝6℃。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，溫度T1和T2的差值能夠顯著影響第二培養(yǎng)液中的活菌總數(shù)和芽孢率，這應(yīng)該是合適的溫度降低能夠在第二液體培養(yǎng)基的協(xié)同作用下進(jìn)一步增強(qiáng)了菌種的繁殖和培養(yǎng)能力，從而取得了更好的技術(shù)效果。

其中，通風(fēng)的通風(fēng)比為1:0.7-0.8，例如可為1:0.7、1:0.75或1:0.8。

如上所述，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，所述方法通過(guò)獨(dú)特的多個(gè)技術(shù)特征相互之間的協(xié)同作用和相互促進(jìn)，從而取得了良好的技術(shù)效果，可以提供具有高活性、高密度的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，從而可為后續(xù)的多種應(yīng)用提供具有優(yōu)異活性的枯草芽孢桿菌原料，在工業(yè)上具有良好的應(yīng)用前景和生產(chǎn)潛力。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些例舉性實(shí)施方式的用途和目的僅用來(lái)例舉本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的實(shí)際保護(hù)范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。

制備例1：微量元素水溶液的制備

將4g硝酸鋅、3.5g硫酸鋅、3g硝酸鎂、1g氯化鈷、2g硝酸銅、2.5g氯化鈣、4g氯化錳、8g氯化亞鐵和3g氯化鐵充分溶解于1000ml蒸餾水中，從而得到微量元素水溶液。

制備例2：無(wú)機(jī)物混合液的制備

將5g Na₂SO₄、2g NaCl、12g K₂HPO₄、4g Na₃PO₄、7g NH₄Cl、2.5g硼酸、3g KNO₃和5g KI加入到1000ml蒸餾水中攪拌溶解，從而得到無(wú)機(jī)物混合液。

除非另有說(shuō)明，否則如下所有的微量元素水溶液、無(wú)機(jī)物混合液均為相應(yīng)的上述制備例1-2得到的。

實(shí)施例1

S1：配制第一液體培養(yǎng)基

S1-1：分別稱(chēng)取如下的基礎(chǔ)物：微量元素水溶液45ml、維生素E 1.5g、蘇氨酸350mg、L-脯氨酸250mg、葡萄糖3.75g、蔗糖3g、瓊脂5.5g、蛋白胨7g、酵母浸膏2.25g、11g大豆粉和牛肉膏4g；

S1-2：將上述基礎(chǔ)物加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml，得到所述第一液體培養(yǎng)基；

S2：配制第二液體培養(yǎng)基

S2-1：同步驟S1-1；

S2-2：將所述基礎(chǔ)物和32.5ml無(wú)機(jī)物混合液加入到去離子水中充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml且調(diào)節(jié)pH值為6.8，得到所述第二液體培養(yǎng)基；

S3：菌種培養(yǎng)得到第一培養(yǎng)液

將枯草芽孢桿菌菌株(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的編號(hào)為ACCC10619的枯草芽孢桿菌菌株)進(jìn)行斜面試管培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌落，然后使用接種環(huán)接1環(huán)接種于120ml所述第一液體培養(yǎng)基中，于溫度T1(為36℃)和轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)32小時(shí)，從而得到所述第一培養(yǎng)液；

S4：繼續(xù)培養(yǎng)得到第二培養(yǎng)液

按照1.7:100的體積比，將所述第一培養(yǎng)液接種于所述第二液體培養(yǎng)基中，并降溫至溫度T2(為30℃)，然后以160轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌并通風(fēng)(通風(fēng)比為1:0.75)，培養(yǎng)20小時(shí)，從而得到所述第二培養(yǎng)液(將其命名為P1)，完成所述培養(yǎng)方法。

實(shí)施例2

S1：配制第一液體培養(yǎng)基

S1-1：分別稱(chēng)取如下的基礎(chǔ)物：微量元素水溶液40ml、維生素E 2g、蘇氨酸300mg、L-脯氨酸300mg、葡萄糖3g、蔗糖4g、瓊脂5g、蛋白胨6g、酵母浸膏3g、10g大豆粉和牛肉膏5g；

S1-2：將上述基礎(chǔ)物加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml，得到所述第一液體培養(yǎng)基；

S2：配制第二液體培養(yǎng)基

S2-1：同步驟S1-1；

S2-2：將所述基礎(chǔ)物和25ml無(wú)機(jī)物混合液加入到去離子水中充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml且調(diào)節(jié)pH值為6.8，得到所述第二液體培養(yǎng)基；

S3：菌種培養(yǎng)得到第一培養(yǎng)液

將枯草芽孢桿菌菌株(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的編號(hào)為ACCC10619的枯草芽孢桿菌菌株)進(jìn)行斜面試管培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌落，然后使用接種環(huán)接1環(huán)接種于120ml所述第一液體培養(yǎng)基中，于溫度T1(為35℃)和轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)34小時(shí)，從而得到所述第一培養(yǎng)液；

S4：繼續(xù)培養(yǎng)得到第二培養(yǎng)液

按照1.5:100的體積比，將所述第一培養(yǎng)液接種于所述第二液體培養(yǎng)基中，并降溫至溫度T2(為29℃)，然后以170轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌并通風(fēng)(通風(fēng)比為1:0.7)，培養(yǎng)22小時(shí)，從而得到所述第二培養(yǎng)液(將其命名為P2)，完成所述培養(yǎng)方法。

實(shí)施例3

S1：配制第一液體培養(yǎng)基

S1-1：分別稱(chēng)取如下的基礎(chǔ)物：微量元素水溶液50ml、維生素E 1g、蘇氨酸400mg、L-脯氨酸200mg、葡萄糖4.5g、蔗糖2g、瓊脂6g、蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、12g大豆粉和牛肉膏3g；

S1-2：將上述基礎(chǔ)物加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢瑁⒂萌ルx子水定容至1000ml，得到所述第一液體培養(yǎng)基；

S2：配制第二液體培養(yǎng)基

S2-1：同步驟S1-1；

S2-2：將所述基礎(chǔ)物和40ml無(wú)機(jī)物混合液加入到去離子水中充分?jǐn)嚢?，并用去離子水定容至1000ml且調(diào)節(jié)pH值為6.8，得到所述第二液體培養(yǎng)基；

S3：菌種培養(yǎng)得到第一培養(yǎng)液

將枯草芽孢桿菌菌株(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的編號(hào)為ACCC10619的枯草芽孢桿菌菌株)進(jìn)行斜面試管培養(yǎng)，得到枯草芽孢桿菌菌落，然后使用接種環(huán)接1環(huán)接種于120ml所述第一液體培養(yǎng)基中，于溫度T1(為37℃)和轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，從而得到所述第一培養(yǎng)液；

S4：繼續(xù)培養(yǎng)得到第二培養(yǎng)液

按照1.9:100的體積比，將所述第一培養(yǎng)液接種于所述第二液體培養(yǎng)基中，并降溫至溫度T2(為31℃)，然后以160轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌并通風(fēng)(通風(fēng)比為1:0.8)，培養(yǎng)18小時(shí)，從而得到所述第二培養(yǎng)液(將其命名為P3)，完成所述培養(yǎng)方法。

性能考察

按照本領(lǐng)域中的常規(guī)測(cè)試方法，對(duì)實(shí)施例1-3得到的不同第二培養(yǎng)液在制備得到后，立刻進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)考察，分別考察了每毫升(ml)發(fā)酵物中的活菌數(shù)和芽孢率，結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1

由此可見(jiàn)，本發(fā)明培養(yǎng)方法可得到具有高活菌數(shù)和高芽孢率的最終枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，從而為其后續(xù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景和工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

對(duì)比例1-6：培養(yǎng)基的考察

對(duì)比例1-3：除分別將實(shí)施例1-3的S4中的第二液體培養(yǎng)基替換為第一液體培養(yǎng)基外(即全程使用第一液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng))，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對(duì)比例1-3，將所得第二培養(yǎng)液順次命名為D1、D2和D3。

對(duì)比例4-6：除分別將實(shí)施例1-3的S3中的第一液體培養(yǎng)基替換為第二液體培養(yǎng)基外(即全程使用第二液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng))，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對(duì)比例4-6，將所得第二培養(yǎng)液順次命名為D4、D5和D6。

按照上述相同的方法對(duì)D1-D6進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)考察，分別考察了每毫升(ml)發(fā)酵物中的活菌數(shù)(單位為：×10⁹cfu/ml)和芽孢率，結(jié)果見(jiàn)下表2。

其中，為了方便進(jìn)行對(duì)比，將P1-P3的數(shù)據(jù)一同列出。

表2

其中，P1-P3的數(shù)據(jù)分別按照相同的順序進(jìn)行對(duì)應(yīng)，例如對(duì)于芽孢率(％)而言，“97.6、97.1、97.4”意味著P1為97.6、P2為97.1和P3為97.4。所有編號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系均如此(在下面的所有表格中也是具有同樣的含義，屆時(shí)不再一一列出)，在此不再一一贅述。

由此可見(jiàn)，在不同步驟中，培養(yǎng)基的種類(lèi)選擇和組分選擇可以對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)的影響；D4-D6的活菌數(shù)要顯著優(yōu)于D1-D3，但芽孢率卻相差無(wú)幾。這進(jìn)一步證明了只有先后使用本發(fā)明的獨(dú)特第一液體培養(yǎng)基和第二液體培養(yǎng)基，才能取得最好的技術(shù)效果。

對(duì)比例7-10：步驟S2-2中pH的考察

分別采用下表所示的步驟S2-2中的pH值(其它操作均不變)，從而分別重復(fù)了實(shí)施例1-3，得到對(duì)比例7-10，所使用pH值、對(duì)應(yīng)實(shí)施例、最終所得第二培養(yǎng)液的命名以及相同方法測(cè)試的活菌數(shù)(單位為：×10⁹cfu/ml)和芽孢率數(shù)據(jù)見(jiàn)下表3。其中，為了方便進(jìn)行對(duì)比，將P1-P3的數(shù)據(jù)一同列出。

表3

其中，“--”表示實(shí)施例1-3的對(duì)應(yīng)關(guān)系即分別為自身。

由此可見(jiàn)，步驟S2-2中的pH值調(diào)節(jié)非常重要，當(dāng)為6.8時(shí)可以取得最好的技術(shù)效果，偏離該值越大，則活菌數(shù)和芽孢率降低越明顯(見(jiàn)D7-D10)，這證明pH值的確定具有非顯而易見(jiàn)性，且效果不可預(yù)料。

對(duì)比例11-16：步驟S3中T1-T2差值的考察

分別采用下表所示的步驟S3中的具體T1、T2和T1-T2的差值(其它操作均不變)，從而分別重復(fù)了實(shí)施例1-3，得到對(duì)比例11-16，其中所使用的T1、T2和T1-T2、對(duì)應(yīng)實(shí)施例和最終所得第二培養(yǎng)液的命名見(jiàn)下表4(其中T1、T2和T1-T2的單位均為℃)。

表4

按照相同方法測(cè)試活菌數(shù)(單位為：×10⁹cfu/ml)和芽孢率，數(shù)據(jù)見(jiàn)下表5。其中，為了方便進(jìn)行對(duì)比，將P1-P3的數(shù)據(jù)一同列出。

表5

由此可見(jiàn)，步驟S3中T1和T2的差值對(duì)于最終結(jié)果同樣有著非常顯著的影響，當(dāng)差值為6℃時(shí)，可以取得最好的技術(shù)效果，而當(dāng)為5℃或7℃時(shí)，則效果降低明顯，而且對(duì)于同樣的偏離值(1℃)，D11-D13的活菌數(shù)要顯著優(yōu)于D14-D16，但芽孢率卻劣于D14-D16，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)活菌數(shù)和芽孢率的同時(shí)最優(yōu)，這也證明了只有差值為6℃時(shí)才能取得最好的平衡性能，達(dá)到兩者的最優(yōu)效果。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，所述方法通過(guò)獨(dú)特的多個(gè)技術(shù)特征相互之間的協(xié)同作用和相互促進(jìn)，從而取得了良好的技術(shù)效果，可以提供具有高活性、高密度的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，從而可為后續(xù)的多種應(yīng)用提供具有優(yōu)異活性的枯草芽孢桿菌原料，在工業(yè)上具有良好的應(yīng)用前景和生產(chǎn)潛力。

應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例的用途僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非意欲限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，也應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)、修改和/或變型，所有的這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的保護(hù)范圍之內(nèi)。