本發(fā)明屬于微生物降解吡啶類化合物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高效降解2-羥基吡啶的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1及其菌劑的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

吡啶類化合物是一種環(huán)境中常見的氮雜環(huán)污染物，廣泛存在于農(nóng)藥、除草劑、殺蟲劑和石油類產(chǎn)品中。這類化合物具有潛在的致癌作用，且氮雜環(huán)降解難度較大，降解周期長(zhǎng)，降解效果差，會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康有長(zhǎng)期、潛在的影響。

去除環(huán)境中吡啶類化合物的方法主要有：物理法、化學(xué)法和生物法。其中物理法適用于濃度較高，污染物較為集中的吡啶污染，但是物理法只是將污染物轉(zhuǎn)移，并不能將污染物完全去除，且應(yīng)用范圍較窄；化學(xué)法是利用化學(xué)手段將環(huán)境中污染物轉(zhuǎn)化成其他無毒或者毒害較小的物質(zhì)，但是化學(xué)法處理成本較高，且容易產(chǎn)生二次污染；生物法是利用環(huán)境中存在的能夠降解吡啶類化合物的微生物，通過富集篩選培養(yǎng)后得到能夠以吡啶類化合物為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)后投加到污染區(qū)域，可以實(shí)現(xiàn)快速的去除環(huán)境中的吡啶類物質(zhì)，該處理方法具有條件溫和、處理成本較低、效果好且不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為處理各類污染物的研究熱點(diǎn)。

應(yīng)用生物法處理環(huán)境中的吡啶類化合物的關(guān)鍵是高效吡啶降解菌株的篩選。微生物在好氧和厭氧條件下都可以降解吡啶類化合物。目前已經(jīng)篩選到一些吡啶類降解菌株，如降解吡啶的Nocardia sp.、Rhodococcus opacus、Pseudomonas sp.和FlavobacteriumCN3d等，降解2-羥基吡啶和3-羥基吡啶的Achromobacter sp.等。但是這些吡啶類降解菌株在實(shí)際應(yīng)用中面臨的問題有：1.大多數(shù)吡啶降解菌株對(duì)吡啶類化合物的耐受濃度較低（小于1 mg/mL），降解效率在60%左右；2.生長(zhǎng)的延遲較長(zhǎng)，而且隨著底物濃度的提高所需要的延遲期越長(zhǎng)，處理周期長(zhǎng)；3.已報(bào)到的降解2-羥基吡啶的菌株A. crystallopoietes，A. pyridinolis和A. viridescens需要2-羥基吡啶的誘導(dǎo)相關(guān)基因才能表達(dá)，在實(shí)際應(yīng)用中受到很大的限制。

因此，從環(huán)境中篩選降解效率高、耐受底物能力強(qiáng)、適應(yīng)條件較廣、性狀穩(wěn)定的吡啶類降解菌株，對(duì)于環(huán)境中吡啶類化合物的去除有重要的研究意義。同時(shí)將高效降解菌株制備成高濃度菌劑對(duì)于縮短處理時(shí)間，提高降解效率有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供了一株高效降解2-羥基吡啶的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1及其菌劑制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明將該菌株HCH-1制備成菌劑應(yīng)用于環(huán)境中2-羥基吡啶污染物的去除。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一株高效降解2-羥基吡啶的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1，其分類命名為球形節(jié)桿菌Arthrobacter globiformils，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為 CCTCC M 2017023。

本發(fā)明還提供了所述球形節(jié)桿菌菌株HCH-1在降解2-羥基吡啶中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述菌株HCH-1生長(zhǎng)溫度為18~42℃，pH為5~9。

進(jìn)一步的，所述菌株HCH-1降解2-羥基吡啶的濃度為1 mg/mL~8 mg/mL。

本發(fā)明還提供了含有所述的高效降解2-羥基吡啶的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1的菌劑。

進(jìn)一步的，該菌劑是通過以下方法獲得的：將菌株HCH-1接種于LB液體培養(yǎng)基中，在25~30℃條件下振蕩培養(yǎng)48~60 h；收集培養(yǎng)的菌液加入終濃度為3%~6%的甘油作為保護(hù)劑，-20℃預(yù)冷后置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干成粉末，即為固體菌劑。

本發(fā)明還提供了所述的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1菌劑在降解2-羥基吡啶中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述菌劑的適應(yīng)溫度為18~42℃，pH為5~9。

進(jìn)一步的，所述菌劑降解2-羥基吡啶的濃度為1 mg/mL~8 mg/mL。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：本發(fā)明所述的球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformils）HCH-1是從遼河口濕地中篩選并經(jīng)過富集、分離和純化得到的高效2-羥基吡啶降解菌株，具有性狀穩(wěn)定、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、適用條件較廣、能夠耐受高濃度的底物和高降解效率等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的球形節(jié)桿菌（Arthrobacter globiformils）HCH-1能夠利用2-羥基吡啶為唯一碳源和能源，不需要誘導(dǎo)，且性能穩(wěn)定，該菌株可以在LB固體/液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，也可以在2-羥基吡啶濃度從1 mg/mL~8 mg/mL的基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度為18~42℃，pH為5~9，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH為7。

本發(fā)明利用微生物的降解去除環(huán)境中2-羥基吡啶污染物，具有處理?xiàng)l件溫和，效率高且不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明所述的菌株，特異性強(qiáng)，只能降解2-羥基吡啶，不能降解4-羥基吡啶、3-羥基吡啶、2,5-二羥基吡啶、煙酸、2-氨基吡啶、2-甲基吡啶、2-乙基吡啶、吡啶等底物，可用于專一性去除環(huán)境中的2-羥基吡啶污染物。

本發(fā)明所述的菌株雖然能夠降解高濃度的2-羥基吡啶，但是隨著2-羥基吡啶濃度的提高，適應(yīng)時(shí)間相應(yīng)的延長(zhǎng)。因此本發(fā)明將該菌株制備成菌劑，能夠?qū)崿F(xiàn)在較短時(shí)間內(nèi)快速去除高濃度2-羥基吡啶的效果。本發(fā)明所述的菌劑具有活菌數(shù)高，菌劑中菌種適應(yīng)能力強(qiáng)，菌株性能穩(wěn)定，制備方法簡(jiǎn)單，成本低等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明分離得到的球形節(jié)桿菌菌株 HCH-1在LB固體培養(yǎng)基上的菌落照片。

圖2為本發(fā)明分離得到的球形節(jié)桿菌菌株 HCH-1的掃描電子顯微鏡照片。

圖3為菌株的進(jìn)化樹。

圖4為不同濃度下球形節(jié)桿菌菌株HCH-1的生長(zhǎng)曲線。

圖5為不同濃度下球形節(jié)桿菌菌株HCH-1的降解曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，但是引用實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1：球形節(jié)桿菌Arthrobacter globiformils HCH-1的分離和純化

將來源于遼河口石油污染土壤樣品約5 g加入到50 mL含有1 mg/mL 2-羥基吡啶的富集培養(yǎng)基中，30℃ 170 rpm恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，取5 mL富集培養(yǎng)液接種到新鮮含有2-羥基吡啶的富集培養(yǎng)基中，重復(fù)該過程4-5次，將最終得到的富集培養(yǎng)液涂布到LB固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，選取不同形態(tài)特征的單菌落接種于含有1 mg/mL的2-羥基吡啶的篩選培養(yǎng)基中，進(jìn)行驗(yàn)證，選取在2-羥基吡啶篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好的菌株，其中一株定名為HCH-1，將其保藏于甘油管和LB固體斜面培養(yǎng)基中。

實(shí)施例2：球形節(jié)桿菌Arthrobacter globiformils HCH-1的鑒定

1、菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征

菌株HCH-1在LB固體平板上的菌落形態(tài)如圖1所示為白色、半透明、表面濕潤(rùn)、邊緣整齊，在以2-羥基吡啶-MSN培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基顏色由無色透明先是變成藍(lán)紫色后變成棕黃色，通過對(duì)不同時(shí)期菌株進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)菌株位于對(duì)數(shù)期時(shí)培養(yǎng)基為藍(lán)紫色，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后培養(yǎng)基變?yōu)樽攸S色。分別取不同生長(zhǎng)階段（對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期）的菌株進(jìn)行革蘭氏染色均呈陽性，在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)均呈球形，掃描電鏡結(jié)果顯示菌株為短桿狀，如圖2所示，長(zhǎng)約為0.5-0.7 μm，直徑約為0.4-0.6 μm，呈圓柱形且末端有輻射狀花紋。

2、菌株的16S rDNA鑒定：

用基因組提取試劑盒提取菌株HCH-1的基因組，以其為模板，以16S rDNA通用引物27F（5^,-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3^,）和1492R（5^,-ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT -3^,）引物進(jìn)行擴(kuò)增16S rDNA序列。

PCR反應(yīng)體系為：2×pfu PCR mix 12.5微升，上游引物27F 1微升，下游引物1492R 1微升，基因組模板0.5微升，超純水10微升。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明PCR產(chǎn)物條帶單一大小約為1.5 kb，經(jīng)純化后送至上海生工測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見序列表SEQ ID No:1的核苷酸序列，將測(cè)序結(jié)果遞交到NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株與節(jié)桿菌的序列相似性為99%，如圖3所示，因此判斷該菌株為節(jié)桿菌屬。

本發(fā)明將篩選到的節(jié)桿菌菌株HCH-1進(jìn)行菌種保藏，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期：2017年1月11日，球形節(jié)桿菌HCH-1（Arthrobacter globiformis HCH-1）的保藏編號(hào)為 CCTCC NO：M 2017023。

實(shí)施例3：球形節(jié)桿菌Arthrobacter globiformils HCH-1對(duì)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中不同濃度2-羥基吡啶的降解

所述菌株HCH-1在降解2-羥基吡啶中的應(yīng)用時(shí)，生長(zhǎng)溫度為18~42℃，pH為5~9，優(yōu)選最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適pH為7。因此本實(shí)施例選取溫度為30℃、pH為7進(jìn)行試驗(yàn)。

將所述球形節(jié)桿菌菌株HCH-1接種到LB液體培養(yǎng)基中活化48 h作為種子，按照1%的接種量接種到2-羥基吡啶濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，每隔2小時(shí)取樣，測(cè)定菌體生長(zhǎng)的OD_600nm的吸收值和2-羥基吡啶的濃度，并計(jì)算降解效率。

該菌株在不同初始濃度2-羥基吡啶下的生長(zhǎng)曲線和降解曲線參見圖4和圖5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株對(duì)2-羥基吡啶濃度為1 -8 mg/mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的2-羥基吡啶均具有較強(qiáng)的降解能力，對(duì)初始濃度為1 mg/mL的2-羥基吡啶在16小時(shí)的降解效率接近100%，初始濃度為2-4 mg/mL的2-羥基吡啶的降解率為94%以上，分別需要42小時(shí)和84小時(shí)，初始濃度為8 mg/mL的2-羥基吡啶120小時(shí)的降解率為89%。同時(shí)可以看出，隨著底物濃度的提高菌株的適應(yīng)時(shí)間不斷延長(zhǎng)，因此考慮將菌株制備成粉末狀菌劑，一方面便于運(yùn)輸和使用，另一方面可以在短時(shí)間內(nèi)迅速提高菌體濃度，縮短處理時(shí)間，提高降解效率。

2-羥基吡啶的檢測(cè)方法如下：

1）液相色譜檢測(cè)法：

利用安捷倫高效液相色譜儀（HPLC）監(jiān)測(cè)2-羥基吡啶的濃度變化。色譜柱為：5 mm×4.6 mm×250 mm的Agilent Eclipse XDB-C18反相柱，流動(dòng)相為：10% 甲醇和90% 1 mM H₂SO₄，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫 30℃，流速為1 mL/min，檢測(cè)器為 DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為 200 nm-400 nm。樣品處理方法：樣品中加入2倍體積甲醇，4℃靜置10 min，10 000 r/min離心2 min，取上清液利用 0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

2）紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法：

根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-羥基吡啶在220 nm和290 nm處有特征吸收峰，因此可用紫外可見光掃描200 nm - 400 nm 范圍內(nèi)的吸光值表征2-羥基吡啶濃度變化，研究菌株Arthrobacterglobiformils HCH-1 對(duì)2-羥基吡啶的降解情況。

實(shí)施例4：菌株HCH-1的固體菌劑的制備

所述球形節(jié)桿菌菌株HCH-1的菌劑的制備方法包括以下步驟：將純化后的菌株HCH-1按照1%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30℃170 rpm恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)48 h后，5000 r/min離心10min收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次后，加入終濃度為3%~6%的甘油作為保護(hù)劑，將菌體重懸后置于-20℃冰箱中冷凍至少30 min，預(yù)冷后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥后得固體粉末狀菌劑，每1L上述培養(yǎng)物可獲得約100-900 mg固體菌劑，菌劑中有效活菌數(shù)≧1×10⁹ cfu/g。

實(shí)施例5：高密度菌劑應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)

稱取實(shí)施例4中制備的固體菌劑1 g投加到含有4 mg/mL的2-羥基吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，每隔6小時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中2-羥基吡啶的降解情況。在降解12 h時(shí)，幾乎檢測(cè)不到培養(yǎng)基中的2-羥基吡啶，降解效率達(dá)到100%。

實(shí)施例6：高密度菌劑應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)

稱取實(shí)施例4中制備的固體菌劑1 g投加到含有6 mg/mL的2-羥基吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，每隔6小時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中2-羥基吡啶的降解情況。在降解18 h時(shí)，幾乎檢測(cè)不到培養(yǎng)基中的2-羥基吡啶，降解效率達(dá)到100%。

實(shí)施例7：高密度菌劑應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)

稱取實(shí)施例4中制備的固體菌劑1 g投加到含有8 mg/mL的2-羥基吡啶無機(jī)鹽培養(yǎng)基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，每隔6小時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)基中2-羥基吡啶的降解情況。在降解36 h時(shí)，幾乎檢測(cè)不到培養(yǎng)基中的2-羥基吡啶，降解效率達(dá)到100%。

以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)海洋大學(xué)

<120> 一株高效降解2-羥基吡啶的球形節(jié)桿菌菌株HCH-1及其菌劑制備方法與應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 球形節(jié)桿菌

<400> 1

tgcagtcgaa cgatgatccg gtgcttgcac cggggattag tggcgaacgg gtgagtaaca 60

cgtgagtaac ctgcccttga ctctgggata agcctgggaa actgggtcta ataccggata 120

tgactcctca tcgcatggtg gggggtggaa agcttttgcg gttttggatg gactcgcggc 180

ctatcagctt gttggtgagg taatggctta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240

gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct 360

tcgggttgta aacctctttc agtagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag 420

cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggaa 480

ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtct gccgtgaaag tccggggctc 540

aactccggat ctgcggtggg tacgggcaga ctagagtgat gtaggggaga ctggaattcc 600

tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcaggtctct 660

gggcattaac tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg aacaggatta gataccctgg 720

tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg tgtgggggac attccacgtt ttccgcgccg 780

tagctaacgc attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900

ccttaccaag gcttgacatg gaccggatcg ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc 960

cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020

cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg ccagcacgtg atggtgggga ctcatgggag 1080

actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca aatcatcatg ccccttatgt 1140

cttgggcttc acgcatgcta caatggccgg tacaaagggt tgcgatactg tgaggtggag 1200

ctaatcccaa aaagccggtc tcagttcgga ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc 1260

ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320

acaccgcccg tcaagtcacg aaagttggta acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt 1380

gggaggagcc gtcg 1394