本發(fā)明涉及一種應用于噴霧干燥乳酸菌菌粉制備和真空冷凍干燥法的添加滑菇多糖的乳酸菌保護劑。
背景技術(shù)：
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細菌通稱。主要包括乳桿菌屬、乳球菌屬，鏈球菌屬和雙歧桿菌屬等二十多個屬。目前許多研究證實許多乳酸菌在人和動物的胃腸及結(jié)腸都是正常宿主菌。其中一些乳酸菌是人體的胃腸道的益生菌，可以產(chǎn)生許多益生功能。益生乳酸菌具有改善胃腸道、緩解乳糖不耐癥、改善機體營養(yǎng)狀況、調(diào)節(jié)免疫、提高抗氧化活性、降血壓、降低膽固醇和亞硝酸鹽以及抑制病原菌對宿主的定植等許多功能。乳酸菌作為重要的益生菌(Probiotic)已廣泛地用于食品、生物醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)和飼料等行業(yè)中。
真空冷凍干燥技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)常常用于益生乳酸菌的產(chǎn)品生產(chǎn)。在此過程中乳酸菌經(jīng)歷的低溫、高溫和干燥的壓力會引起細胞損傷。為了減少真空冷凍干燥和噴霧干燥對乳酸菌的損傷，需在凍干前添加一定的保護劑，以提高細胞存活率，并且可以改善乳酸菌的貯藏穩(wěn)定性。加工過程中的溫度對微生物存活影響最大，特別是高溫。高溫能破壞乳酸菌維系生命活動的酶系，使其活性降低或者喪失。蛋白質(zhì)、核酸與酶系統(tǒng)等重要生物高分子的也會氫鍵受到破壞，導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性，核酸發(fā)生降解變性失活，從而破壞細胞的組成；高溫還會導致細胞膜上類脂質(zhì)成分形成極小的孔，使細胞內(nèi)容物泄漏，還對細胞膜、細胞壁、細胞質(zhì)和核酸造成損害，從而導致死亡。低溫也會產(chǎn)生冰晶對細胞造成損害，其損傷主要來自于細胞膜脂肪酸物理性狀的改變和相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。真空冷凍干燥操作和噴霧干燥操作都伴隨著乳酸菌的干燥，干燥也會對乳酸菌造成損傷，會引起乳酸菌膜的融合與脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變。保護這些基本的功能和結(jié)構(gòu)對于細胞存活和保持功能性至關(guān)重要。乳酸菌保護劑是提高乳酸菌活性最重要的一種措施，通過研究合適的保護劑配方，可以大大提高乳酸菌在噴霧干燥過程和真空冷凍干燥過程時乳酸菌的成活率。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種添加滑菇多糖的乳酸菌保護劑。
本發(fā)明一種添加滑菇多糖的乳酸菌保護劑，它包括以下步驟：
1.滑菇多糖的制備
(1)滑菇的挑選
選取新鮮滑菇，表面沒有腐爛、形狀完整、無明顯組織傷痕；菇柄粗短、菇蓋圓且光滑、直徑在3cm左右、蓋面、邊緣肉厚，沒有發(fā)酸發(fā)臭味道；大小均一且干凈的優(yōu)良滑菇備用；
(2)滑菇的稱重
用電子天平稱取1000g新鮮滑菇供使用；
(3)滑菇的破碎打漿
在稱取好滑菇中加蒸餾水，滑菇與水的質(zhì)量比例為2:3；滑菇與水一同倒入高速組織搗碎機中，對滑菇進行間歇破碎打漿，30秒高速打漿10000轉(zhuǎn)/分，停止2分鐘，共4次；得滑菇組織漿液；
(4)酶解
上述滑菇組織漿液，然后加入纖維素酶10U/mg，添加量為漿液質(zhì)量的0.08％；在55℃下保溫3小時；
(5)水浴浸提
將上一步所得滑菇組織漿液置水浴鍋加熱，再將盛有滑菇組織漿液的燒杯置于恒溫水浴鍋中，85℃下水浴加熱4h；
(6)過濾
用100目不銹鋼過濾篩對水浴過后的滑菇組織漿液進行過濾，濾液混合留存；
(7)洗渣
上一步所得濾渣加1倍水于85℃下水浴浸提1h,用100目不銹鋼過濾篩過濾，保留濾液，并與上一步濾液混合；
(8)醇析
所得混合濾液按1:2比例加無水乙醇醇析，4℃靜置24h；然后在4000rpm離心20min后除去液體，獲得滑菇多糖的固體；
(9)干燥
上述醇析后的滑菇多糖固體經(jīng)80℃抽真空干燥，獲得滑菇多糖在以下步驟中供用作保護劑；
2.包含滑菇多糖的保護劑配方的組成
向乳酸菌離心后的菌體沉淀物添加滑菇多糖、硼酸鈉、谷氨酸鈉、谷胱甘肽、維生素C，其添加比例分別為乳酸菌離心后的菌體沉淀物重量的0.001－0.04％、0.01－0.03％、0.01－0.03％、0.02－0.08％和0.01－1.0％(w/w)。
本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明的乳酸菌包括干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌。本發(fā)明的乳酸菌保護劑含有滑菇多糖或者其混合物，可以用于噴霧干燥乳酸菌菌粉制備和真空冷凍干燥法乳酸菌菌粉制備，該方法能生產(chǎn)活菌數(shù)高的發(fā)酵劑，操作簡單、成本低，能規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明保護劑可以用于噴霧干燥和真空冷凍干燥生產(chǎn)乳酸菌菌粉。配方中主要含有保護乳酸菌的滑菇多糖。其中乳酸菌包括干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌。采用該保護劑制得的乳酸菌菌粉的存活率都在60％以上，活菌數(shù)都在1010以上。
具體實施方式
本發(fā)明一種添加滑菇多糖的乳酸菌保護劑的制備方法，它包括以下步驟：
1.滑菇多糖的制備
(1)滑菇的挑選
選取新鮮滑菇，表面沒有腐爛、形狀完整、無明顯組織傷痕；菇柄粗短、菇蓋圓且光滑、直徑在3cm左右、蓋面、邊緣肉厚，沒有發(fā)酸發(fā)臭味道；大小均一且干凈的優(yōu)良滑菇備用；
(2)滑菇的稱重
用電子天平稱取1000g新鮮滑菇供使用；
(3)滑菇的破碎打漿
在稱取好滑菇中加蒸餾水，滑菇與水的質(zhì)量比例為2:3；滑菇與水一同倒入高速組織搗碎機中，對滑菇進行間歇破碎打漿，30秒高速打漿10000轉(zhuǎn)/分，停止2分鐘，共4次；得滑菇組織漿液；
(5)酶解
上述滑菇組織漿液，然后加入纖維素酶10U/mg，添加量為漿液質(zhì)量的0.08％；在55℃下保溫3小時；
(6)水浴浸提
將上一步所得滑菇組織漿液置水浴鍋加熱，再將盛有滑菇組織漿液的燒杯置于恒溫水浴鍋中，85℃下水浴加熱4h；
(7)過濾
用100目不銹鋼過濾篩對水浴過后的滑菇組織漿液進行過濾，濾液混合留存；
(8)洗渣
上一步所得濾渣加1倍水于85℃下水浴浸提1h,用100目不銹鋼過濾篩過濾，保留濾液，并與上一步濾液混合；
(9)醇析
所得混合濾液按1:2比例加無水乙醇醇析，4℃靜置24h；然后在4000rpm離心20min后除去液體，獲得滑菇多糖的固體；
(10)干燥
上述醇析后的滑菇多糖固體經(jīng)80℃抽真空干燥，獲得滑菇多糖在以下步驟中供用作保護劑；
2.包含滑菇多糖的保護劑配方的組成
向乳酸菌離心后的菌體沉淀物添加滑菇多糖、硼酸鈉、谷氨酸鈉、谷胱甘肽、維生素C，其添加比例分別為乳酸菌離心后的菌體沉淀物重量的0.001－0.04％、0.01－0.03％、0.01－0.03％、0.02－0.08％和0.01－1.0％(w/w)。
本發(fā)明的乳酸菌保護劑含有滑菇多糖或者其混合物，可以用于噴霧干燥乳酸菌菌粉制備和真空冷凍干燥法乳酸菌菌粉制備，具體實施例如下：
實施例1：噴霧干燥法生產(chǎn)干酪乳桿菌菌粉
①高密度培養(yǎng)
將活化后的干酪乳桿乳酸菌菌體培養(yǎng)物以體積分數(shù)為1％接種量接至MRS培養(yǎng)24小時，該MRS是經(jīng)實驗優(yōu)化后培養(yǎng)干酪乳桿菌的MRS培養(yǎng)基，能使最大培養(yǎng)活菌數(shù)達1012。
②保護劑配方及添加方法
含滑菇多糖的一種保護劑配方，添加比例分別是收集的菌體離心沉淀物重量的百分比：滑菇多糖0.01％、硼酸鈉0.02％、谷胱甘肽0.08％和維生素C 0.02％(w/w)。保護劑制備及添加方法：干酪乳桿菌離心后的菌體沉淀添加配制好的保護劑。
收集干酪乳桿菌的乳酸菌菌體離心沉淀物。保護劑按上述配方稱量后，加入其重量5倍的水溶解，8000r/min均質(zhì)5分鐘，121℃滅菌15分鐘，冷卻到40℃。加入0.1％Tween 80后二次均質(zhì)，均質(zhì)條件5000r/min，10分鐘，將菌體沉淀物和保護劑混合后，輕輕攪拌均勻，然后進行下一步噴霧干燥。
③噴霧干燥的工藝參數(shù)：①進料流量15ml/min(采用10L的小型噴霧干燥機)；進料濃度30％；②進料溫度為28℃；③進風溫度130℃；④霧化器壓力150kPa。
采用該方法制得的干酪乳桿菌菌粉的存活率都在60％以上，活菌數(shù)都在1010以上。
實施例2：真空冷凍干燥法生產(chǎn)嗜酸乳桿菌菌粉
①高密度培養(yǎng)
將活化后的干酪乳桿乳酸菌菌體培養(yǎng)物以體積分數(shù)為1％接種量接至MRS培養(yǎng)24小時，該MRS是經(jīng)實驗優(yōu)化后培養(yǎng)干酪乳桿菌的MRS培養(yǎng)基，能使最大培養(yǎng)活菌數(shù)達1012。
②保護劑配方及添加方法
含滑菇多糖的一種保護劑配方，添加比例分別是收集的菌體離心沉淀物重量的百分比：滑菇多糖0.008％、硼酸鈉0.01％、谷氨酸鈉0.02％和維生素C 0.04％(w/w)。保護劑制備及添加方法：干酪乳桿菌離心后的菌體沉淀物添加配制好的保護劑。
收集干酪乳桿菌的乳酸菌菌體離心沉淀物。保護劑按上述配方稱量后，加入其重量5倍的水溶解，8000r/min均質(zhì)5分鐘，121℃滅菌15分鐘，冷卻到40℃。加入0.1％Tween 80后二次均質(zhì)，均質(zhì)條件5000r/min，10分鐘，將菌體沉淀物和保護劑混合后，輕輕攪拌均勻，然后進行下一步真空冷凍干燥。
③真空冷凍干燥的工藝參數(shù)：①預冷溫度-30℃；②預凍速率0.6℃/min；③干燥室壓力62Pa；④加熱板溫度40℃；⑤含水量在5％以下。
采用該方法制得的干酪乳桿菌菌粉的存活率都在65％以上，活菌數(shù)都在1010以上。貯存半年后的存活率都在50％以上。