本發(fā)明涉及一種活性菌的培養(yǎng)方法，更具體而言，涉及一種側(cè)孢芽孢桿菌的新型培養(yǎng)方法，屬于微生物培養(yǎng)和微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
側(cè)孢芽孢桿菌(Bacilluslaterosporus)為革蘭氏陽性菌，其芽孢為橢圓形，側(cè)生、中生或近中生，孢囊膨大，游離芽孢一邊比另一邊厚，呈現(xiàn)獨(dú)木舟形。
側(cè)孢芽孢桿菌在多個(gè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用，例如：1、其能夠分泌大量的幾丁質(zhì)酶，抑制真菌類病害；2、可對弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害細(xì)菌具有很強(qiáng)的抑制作用；3、可減少魚、蝦病害發(fā)生，提高產(chǎn)量；4、可分解池中殘餌、糞便、有機(jī)物等，消除藍(lán)藻，凈化水質(zhì)；5、促進(jìn)植物根系生長，增強(qiáng)根系吸收能力，從而提高作物產(chǎn)量；6、仰制植物體內(nèi)外病原菌繁殖，減輕病蟲害，降低農(nóng)藥殘留；7、改良疏松土壤，解決土壤板結(jié)現(xiàn)象，從而活化土壤，提高肥料利用率；8、增強(qiáng)植物新陳代謝，促進(jìn)光合作用和強(qiáng)化葉片保護(hù)膜，抵抗病原菌；9、增強(qiáng)光合作用，提高化肥利用率，降低硝酸鹽含量；10、固化若干重金屬，降低植物體內(nèi)重金屬含量。
正是由于側(cè)孢芽孢桿菌的上述諸多用途，從而在畜牧業(yè)、飼料業(yè)、農(nóng)藥、肥料、殺菌、園林業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、農(nóng)作物種植、苗木培育等多個(gè)領(lǐng)域中都具有廣泛的應(yīng)用，且其應(yīng)用領(lǐng)域和新的用途也一直在研究和拓展中。
也正是由于側(cè)孢芽孢桿菌如此重要的作用，人們對于各種側(cè)孢芽孢桿菌制品以及側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基等進(jìn)行了大量的深入研究，取得了諸多的研究成果，例如：
CN102399710A公開了一種新的側(cè)孢芽孢桿菌，保藏號為CGMCC No.5090及由該菌株制備的微生物菌種劑和微生物肥料以及它們的制備方法。使用該菌種生產(chǎn)的微生物菌種劑有較高的有效菌數(shù)和較長的保質(zhì)期。
CN103289937A公開了一種高密度固體發(fā)酵生產(chǎn)側(cè)孢芽孢桿菌活菌的方法，它包括以下步驟：菌種選擇、斜面種子培養(yǎng)、一級固體種子培養(yǎng)、二級固體種子培養(yǎng)、固體發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)物烘干和發(fā)酵產(chǎn)物閃蒸。所使用的培養(yǎng)基原料都是采用農(nóng)副產(chǎn)品，成本低，配方合理，能夠滿足菌種繁殖營養(yǎng)需要，特別是加入碳酸鈣緩沖培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的pH值變化，能大大提高了固體發(fā)酵的側(cè)孢芽孢桿菌活菌含量，實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)證明利用本發(fā)明方法制備的側(cè)孢芽孢桿菌的有效活菌數(shù)可達(dá)500億/克，產(chǎn)品雜菌率低于5％，且芽孢率高達(dá)90％以上，能大大降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，滿足微生物菌劑生產(chǎn)的需要。
CN103416321A公開了一種側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵床及其制作方法。所示發(fā)酵床通過下述方法制作：將墊料原料與雞糞按體積比3-5:1混合均勻，接種側(cè)孢芽孢桿菌制劑，含水量為40-60％，進(jìn)行堆積預(yù)發(fā)酵5-7天；將預(yù)發(fā)酵墊料鋪設(shè)在雞舍內(nèi)，其上鋪設(shè)相同厚度的墊料原料，混勻后制成發(fā)酵床，所述發(fā)酵床含水量為30-60％，所述發(fā)酵床的總厚度為8-25cm；所述墊料原料由體積比為2-5:5-8的谷殼和鋸末組成。所述側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵床墊料厚度小，墊料的使用量少，極大的減少養(yǎng)殖戶的勞動工作量，節(jié)約成本；在高溫下效果仍然很好，可以抑制及殺滅蚊蟲，改善禽類腸道功能，高效降解蛋白、淀粉、脂肪、糞尿，且氨味、臭味較少；使用和擴(kuò)欄方便，可帶雞消毒。
CN103725626A公開了一種側(cè)孢芽孢桿菌制劑，其制備工藝如下：側(cè)孢芽孢桿菌菌種(安瓿管)-試管斜面菌種培養(yǎng)-搖瓶菌種培養(yǎng)-種子罐深層液體發(fā)酵培養(yǎng)-封閉式固體發(fā)酵箱培養(yǎng)-側(cè)孢芽孢桿菌制劑。其采用先進(jìn)的“深層液體發(fā)酵+封閉式固體發(fā)酵”的連續(xù)發(fā)酵工藝，利用全封閉自控式固體發(fā)酵設(shè)備，使固體發(fā)酵的整個(gè)過程都處于全封閉的自動監(jiān)控之下，對發(fā)酵過程中的培養(yǎng)基成分、配方、溫度、濕度、通氣、pH值等環(huán)境條件進(jìn)行自動化檢測、電子顯示、自動控制，不僅大幅度提高產(chǎn)量，而且保證了由該制劑配制的微生物葉面增效劑的質(zhì)量。
CN105219676A公開了一種側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，該微生物菌種保藏號為CGMCC No.5090，所述培養(yǎng)方法如下：1、將1體積菌懸液接入20倍體積的1號培養(yǎng)基中，30-38℃有氧培養(yǎng)8小時(shí)；2、將步驟1得到的培養(yǎng)液加入到約20倍體積的2號培養(yǎng)基中，30-38℃有氧培養(yǎng)8小時(shí)；3、將步驟2得到的培養(yǎng)液加入到約20倍體積的3號培養(yǎng)基中，35-38℃培養(yǎng)8小時(shí)，即得可生產(chǎn)用的微生物菌種培養(yǎng)物。
CN105272406A公開了一種由側(cè)孢芽孢桿菌制備的微生物肥料及其制備方法，該肥料由保藏號為CGMCC No.5090的微生物菌種經(jīng)過培養(yǎng)得到培養(yǎng)物，所得培養(yǎng)物和草炭粉混合得到微生物菌種劑，所得微生物菌種劑再與常規(guī)肥料混合制備而成，其中所述微生物菌種培養(yǎng)物的培養(yǎng)方如下：1、將1體積菌懸液接入20倍體積的1號培養(yǎng)基中，30-38℃有氧培養(yǎng)8小時(shí)；2、將步驟1得到的培養(yǎng)液加入到約20倍體積的2號培養(yǎng)基中，30-38℃有氧培養(yǎng)8小時(shí)；3、將步驟2得到的培養(yǎng)液加入到約20倍體積的3號培養(yǎng)基中，35-38℃培養(yǎng)8小時(shí)，即得可生產(chǎn)用的培養(yǎng)物。
如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中公開了側(cè)孢芽孢桿菌的多種培養(yǎng)方法以及多種培養(yǎng)基，但對于新型的側(cè)孢芽孢桿菌培養(yǎng)方法，仍存在繼續(xù)研究的必要和需求，這正是本發(fā)明得以完成的動力所在和基礎(chǔ)所倚。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了尋求側(cè)孢芽孢桿菌的新型培養(yǎng)方法，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的深入研究，在付出了創(chuàng)造性勞動后，從而完成了本發(fā)明。
具體而言，本發(fā)明涉及一種側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：
S1：側(cè)孢芽孢桿菌菌株活化，無菌水沖洗，得到種子液；
S2：使用第一培養(yǎng)液對種子液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S3：使用第二培養(yǎng)液對第一擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S4：第二擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；
S5：將發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵，并進(jìn)行后處理，得到側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑，從而完成側(cè)孢芽孢桿菌的所述培養(yǎng)方法。
在本發(fā)明的側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S1具體如下：
S1-1：選擇側(cè)孢芽孢桿菌菌株，并在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到活化菌株；
S1-2：無菌水清洗斜面，得到所述種子液。
其中，步驟S1中的側(cè)孢芽孢桿菌菌株可選擇任何已知的孢芽孢桿菌菌株，例如已知的CGMCC No.5090、CGMCC No.1755、孢芽孢桿菌菌株BL-11、孢芽孢桿菌菌株BL-22、孢芽孢桿菌菌株BL-21、孢芽孢桿菌菌株1.864、孢芽孢桿菌菌株BL-1、孢芽孢桿菌菌株2-Q-9等等，這些菌株均可通過多種商業(yè)渠道而獲得，在此不再一一贅述。
其中，步驟S1中，每100g所述斜面培養(yǎng)基的組成為：瓊脂5-6g、蛋白胨3-4g、酵母浸膏0.02-0.03g、黃豆粉2-3g、玉米粉0.8-1.4g、牛肉膏3-4g、氯化鈉0.2-0.5g、葡萄糖0.06-0.1g，余量為無菌水，并調(diào)節(jié)pH值為7-7.2(調(diào)節(jié)手段是常規(guī)技術(shù)，不再贅述)。
其中，黃豆粉和玉米粉均過200目篩。
其中，步驟S1中，所述活化培養(yǎng)的溫度為30-34℃，例如可為30℃、32℃或34℃。
其中，步驟S1中，所述活化培養(yǎng)的時(shí)間為34-40小時(shí)，例如可為34小時(shí)、36小時(shí)、38小時(shí)或40小時(shí)。
其中，步驟S2中，使用無菌水沖洗斜面，收集沖洗液，并調(diào)整菌液濃度為1.3×108-1.4×108個(gè)/ml，從而得到所述種子液。
在本發(fā)明的側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S2具體如下：
S2-1：配制第一培養(yǎng)液
分別稱取如下的物質(zhì)：金屬元素水溶液25ml、維生素E 1.5g、檸檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、瓊脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸銨1g、磷酸鈉2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸鈉4g；
將上述物質(zhì)加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢柰耆?，并用去離子水定容至1000ml，即得到所述第一培養(yǎng)液。
S2-2：按照1:40-50的體積比，將所述種子液接種于所述第一培養(yǎng)液中，在34-36℃下通風(fēng)振蕩培養(yǎng)20-24小時(shí)，從而得到所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)液。
其中，步驟S2-1中，所述金屬元素水溶液是將2.5g硫酸錳、3g氯化鋅、4g硫酸鎂、1.5g氯化鈷、2g硝酸銅、3g氯化鈣、4g氯化亞鐵、3g氯化鐵充分溶解于1000ml蒸餾水中而得到的；然后量取其中的20-30ml，即為上述步驟S2-1中所使用的20-30ml金屬元素水溶液。
其中，步驟S2-2中，所述種子液接與所述第一培養(yǎng)液的體積比為1:40-50，例如可為1:40、1:45或1:50。
其中，步驟S2-2中，所述通風(fēng)的通風(fēng)比為1:0.8-1，例如可為1:0.8、1:0.9或1:1。
其中，步驟S2-2中，所述通風(fēng)所通入的氣體中，氧氣體積含量為14-20％，例如可為14％、16％、18％或20％，優(yōu)選為16-18％，最優(yōu)選為17％。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述通風(fēng)中的氧含量對于最終的結(jié)果有著顯著的影響，在合適的體積含量下能夠取得最好的技術(shù)效果。
其中，步驟S2-2中，所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-170轉(zhuǎn)/分鐘。
在本發(fā)明的側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S3具體如下：
S3-1：將第一培養(yǎng)液中的酵母浸膏用量減半(即降低為0.7g)，且金屬元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不變，從而得到所述第二培養(yǎng)液(也就是按照第一培養(yǎng)液的相同方法進(jìn)行制備，無非是酵母浸膏用量減半和金屬元素水溶液用量增大一倍而已)；
S3-2：按照1:30-35的體積比，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)液接加入到所述第二培養(yǎng)液中，在34-36℃下通入空氣振蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)，從而得到所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)液。
其中，在步驟S3-1中，通過降低酵母浸膏的用量而增大金屬元素水溶液的用量，發(fā)現(xiàn)可以取得更好的技術(shù)效果，應(yīng)該是此時(shí)第一擴(kuò)增培養(yǎng)液中已經(jīng)得到了足夠數(shù)量和活性的活化菌群，從而可降低酵母浸膏的用量但對金屬元素的需求量卻上升(如果酵母浸膏用量不變，可導(dǎo)致繁殖過快，但活菌數(shù)卻反而降低，反而導(dǎo)致最后的效果降低)。
其中，在步驟S3-2中，振蕩培養(yǎng)時(shí)通入正常的空氣即可，已經(jīng)無需如步驟S2-3中要求氧氣的含量為14-20％。
其中，在步驟S3-2中，所述通入空氣的通風(fēng)比為1:1。
其中，步驟S3-2中，所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150-170轉(zhuǎn)/分鐘。
在本發(fā)明的側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S4具體如下：
將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)液加入到為其體積20-30倍的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間為10-12小時(shí)，期間一直通入空氣，通入空氣的通風(fēng)比為1:0.6-1，例如可為1:0.6、1:0.8或1:1，從而得到所述發(fā)酵液。
其中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基以每升(L)(即最終得到的1L混合料，也即1L液體發(fā)酵培養(yǎng)基)計(jì)，包含酵母浸膏0.5g、蛋白胨2g、麥芽糖4g、葡萄糖1g、硫酸錳0.6g、氯化鈉3.8g、黃豆粉7g、硼酸1.5g、硝酸鉀2.5g、尿素6g、賴氨酸0.7g和硫酸銨1.5g，余量為無菌水。
其中，黃豆粉過200目篩。
其中，所述兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)是指在發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間的前一半時(shí)間(即開始計(jì)起的5-6小時(shí))中，發(fā)酵溫度為32-34℃，然后在10分鐘內(nèi)將溫度升高至38-40℃，并在該溫度下完成后續(xù)剩余時(shí)間的發(fā)酵。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過如此的兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)，可以取得最好的技術(shù)效果，應(yīng)該是經(jīng)過初始發(fā)酵后，繼續(xù)升溫，可進(jìn)一步改善發(fā)酵效率、提高活菌數(shù)。
在本發(fā)明的側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法中，所述步驟S5具體如下：
按照質(zhì)量比1:10-14的比例，將所述發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中，再加入適量去離子水，使整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，然后充分翻拌均勻，裝入長度為3米、寬度為1.5米和深度為1.5米的發(fā)酵槽中，自然堆積發(fā)酵60-70小時(shí)，期間始終保持整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，并通入無菌風(fēng)保持發(fā)酵槽內(nèi)部的中心溫度為56-60℃；發(fā)酵結(jié)束后，通熱風(fēng)干燥，直至水分質(zhì)量含量低于5％，得到發(fā)酵菌劑，從而完成所述培養(yǎng)方法。
其中，在發(fā)酵期間，如果整體的水分質(zhì)量含量低于32-36％的區(qū)間，則通過淋入去離子水的方法來將其保持在該范圍內(nèi)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明后應(yīng)具備的常規(guī)能力，在此不再進(jìn)行詳細(xì)描述。
其中，所述固體培養(yǎng)基是按照如下方法制得的：將3重量份棉粕、4重量份花生殼粉、2重量份麥麩、0.2重量份糖蜜、2重量份花生餅、2.5重量份干蠶沙、10重量份干燥的玉米秸稈粉、0.8重量份草木灰、2重量份魚骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纖維素酶、1.8重量份干燥雞糞、0.1重量份氯化銨，混合均勻后粉碎過50目篩，然后130-140℃的高溫水蒸氣充分滅菌，即得到所述固體培養(yǎng)基。
如上所述，本發(fā)明提供了一種側(cè)孢芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，所述方法通過獨(dú)特的多個(gè)技術(shù)特征之間的相互組合和協(xié)同，從而得到具有優(yōu)異技術(shù)效果的最終側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑，能夠滿足多個(gè)領(lǐng)域的廣泛需求，具有良好的應(yīng)用前景和工業(yè)化生產(chǎn)潛力。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些例舉性實(shí)施方式的用途和目的僅用來例舉本發(fā)明，并非對本發(fā)明的實(shí)際保護(hù)范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。
制備例1：斜面培養(yǎng)基
每100g斜面培養(yǎng)基的組成為：瓊脂5.5g、蛋白胨3.5g、酵母浸膏0.025g、黃豆粉2.5g、玉米粉1.1g、牛肉膏3.5g、氯化鈉0.35g、葡萄糖0.08g，余量為無菌水，其pH值為7-7.2。
其中，黃豆粉和玉米粉均過200目篩。
制備例2：金屬元素水溶液的制備
將2.5g硫酸錳、3g氯化鋅、4g硫酸鎂、1.5g氯化鈷、2g硝酸銅、3g氯化鈣、4g氯化亞鐵、3g氯化鐵充分溶解于1000ml蒸餾水中，從而得到金屬元素水溶液。
制備例3：液體發(fā)酵培養(yǎng)基
液體發(fā)酵培養(yǎng)基以每升(L)計(jì)，包含酵母浸膏0.5g、蛋白胨2g、麥芽糖4g、葡萄糖1g、硫酸錳0.6g、氯化鈉3.8g、黃豆粉7g、硼酸1.5g、硝酸鉀2.5g、尿素6g、賴氨酸0.7g和硫酸銨1.5g，余量為無菌水。
其中，黃豆粉過200目篩。
制備例4：固體培養(yǎng)基的制備(即步驟S5中的固體培養(yǎng)基)
將3重量份棉粕、4重量份花生殼粉、2重量份麥麩、0.2重量份糖蜜、2重量份花生餅、2.5重量份干蠶沙、10重量份干燥的玉米秸稈粉、0.8重量份草木灰、2重量份魚骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纖維素酶、1.8重量份干燥雞糞、0.1重量份氯化銨，混合均勻后粉碎過50目篩，然后130-140℃的高溫水蒸氣充分滅菌，即得到所述固體培養(yǎng)基。
除非另有說明，否則如下所有的斜面培養(yǎng)基、金屬元素水溶液、液體發(fā)酵培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均為相應(yīng)的上述制備例1-4中的相應(yīng)物質(zhì)。
實(shí)施例1
S1：側(cè)孢芽孢桿菌菌株活化，無菌水沖洗，得到種子液
S1-1：選擇側(cè)孢芽孢桿菌菌株CGMCC No.1755，并在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，所述活化培養(yǎng)的溫度為32℃，活化培養(yǎng)的時(shí)間為37小時(shí)，從而得到活化菌株；
S1-2：無菌水清洗斜面，得到所述種子液
使用無菌水沖洗斜面，收集沖洗液，并調(diào)整菌液濃度為1.35×108個(gè)/ml，從而得到所述種子液；
S2：使用第一培養(yǎng)液對種子液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液
S2-1：配制第一培養(yǎng)液
分別稱取如下的物質(zhì)：金屬元素水溶液25ml、維生素E 1.5g、檸檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、瓊脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸銨1g、磷酸鈉2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸鈉4g；
將上述物質(zhì)加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢柰耆?，并用去離子水定容至1000ml，即得到第一培養(yǎng)液；
S2-2：按照1:45的體積比，將所述種子液接種于所述第一培養(yǎng)液中，在34-36℃下通風(fēng)振蕩培養(yǎng)22小時(shí)(通風(fēng)比為1:0.9，氧氣體積含量為17％，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S3：使用第二培養(yǎng)液對第一擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液
S3-1：將第一培養(yǎng)液中的酵母浸膏用量減半(即降低為0.7g)，且金屬元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不變，從而得到第二培養(yǎng)液；
S3-2：按照1:32.5的體積比，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)液接加入到所述第二培養(yǎng)液中，在34-36℃下通入空氣振蕩培養(yǎng)15小時(shí)(通風(fēng)比為1:1，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S4：第二擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液
將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)液加入到為其體積25倍的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間為11小時(shí)，期間一直通入空氣，通入空氣的通風(fēng)比為1:0.8，從而得到發(fā)酵液；
其中，所述兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)是指在發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間的前一半時(shí)間(即前5.5個(gè)小時(shí))中，發(fā)酵溫度為33℃，然后在10分鐘內(nèi)將溫度升高至39℃，并在該溫度下完成后續(xù)剩余時(shí)間(即后5.5個(gè)小時(shí))的發(fā)酵；
S5：將發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵，并進(jìn)行后處理，得到側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑，從而完成側(cè)孢芽孢桿菌的所述培養(yǎng)方法，具體為：
按照質(zhì)量比1:12的比例，將所述發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中，再加入適量去離子水，使整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，然后充分翻拌均勻，裝入長度為3米、寬度為1.5米和深度為1.5米的發(fā)酵槽中，自然堆積發(fā)酵65小時(shí)，期間始終保持整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，并通入無菌風(fēng)保持發(fā)酵槽內(nèi)部的中心溫度為56-60℃；發(fā)酵結(jié)束后，通熱風(fēng)干燥，直至水分質(zhì)量含量低于5％，得到發(fā)酵菌劑，將其命名為F1，從而完成所述培養(yǎng)方法。
實(shí)施例2
S1：側(cè)孢芽孢桿菌菌株活化，無菌水沖洗，得到種子液
S1-1：選擇側(cè)孢芽孢桿菌菌株CGMCC No.1755，并在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，所述活化培養(yǎng)的溫度為30℃，活化培養(yǎng)的時(shí)間為40小時(shí)，從而得到活化菌株；
S1-2：無菌水清洗斜面，得到所述種子液
使用無菌水沖洗斜面，收集沖洗液，并調(diào)整菌液濃度為1.3×108個(gè)/ml，從而得到所述種子液；
S2：使用第一培養(yǎng)液對種子液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液
S2-1：配制第一培養(yǎng)液
分別稱取如下的物質(zhì)：金屬元素水溶液25ml、維生素E 1.5g、檸檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、瓊脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸銨1g、磷酸鈉2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸鈉4g；
將上述物質(zhì)加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢柰耆?，并用去離子水定容至1000ml，即得到第一培養(yǎng)液；
S2-2：按照1:40的體積比，將所述種子液接種于所述第一培養(yǎng)液中，在34-36℃下通風(fēng)振蕩培養(yǎng)20小時(shí)(通風(fēng)比為1:0.8，氧氣體積含量為17％，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S3：使用第二培養(yǎng)液對第一擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液
S3-1：將第一培養(yǎng)液中的酵母浸膏用量減半(即降低為0.7g)，且金屬元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不變，從而得到第二培養(yǎng)液；
S3-2：按照1:30的體積比，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)液接加入到所述第二培養(yǎng)液中，在34-36℃下通入空氣振蕩培養(yǎng)14小時(shí)(通風(fēng)比為1:1，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S4：第二擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液
將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)液加入到為其體積20倍的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間為10小時(shí)，期間一直通入空氣，通入空氣的通風(fēng)比為1:0.6，從而得到發(fā)酵液；
其中，所述兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)是指在發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間的前一半時(shí)間(即前5個(gè)小時(shí))中，發(fā)酵溫度為32℃，然后在10分鐘內(nèi)將溫度升高至38℃，并在該溫度下完成后續(xù)剩余時(shí)間(即后5個(gè)小時(shí))的發(fā)酵；
S5：將發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵，并進(jìn)行后處理，得到側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑，從而完成側(cè)孢芽孢桿菌的所述培養(yǎng)方法，具體為：
按照質(zhì)量比1:10的比例，將所述發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中，再加入適量去離子水，使整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，然后充分翻拌均勻，裝入長度為3米、寬度為1.5米和深度為1.5米的發(fā)酵槽中，自然堆積發(fā)酵60小時(shí)，期間始終保持整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，并通入無菌風(fēng)保持發(fā)酵槽內(nèi)部的中心溫度為56-60℃；發(fā)酵結(jié)束后，通熱風(fēng)干燥，直至水分質(zhì)量含量低于5％，得到發(fā)酵菌劑，將其命名為F2，從而完成所述培養(yǎng)方法。
實(shí)施例3
S1：側(cè)孢芽孢桿菌菌株活化，無菌水沖洗，得到種子液
S1-1：選擇側(cè)孢芽孢桿菌菌株CGMCC No.1755，并在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，所述活化培養(yǎng)的溫度為34℃，活化培養(yǎng)的時(shí)間為34小時(shí)，從而得到活化菌株；
S1-2：無菌水清洗斜面，得到所述種子液
使用無菌水沖洗斜面，收集沖洗液，并調(diào)整菌液濃度為1.4×108個(gè)/ml，從而得到所述種子液；
S2：使用第一培養(yǎng)液對種子液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液
S2-1：配制第一培養(yǎng)液
分別稱取如下的物質(zhì)：金屬元素水溶液25ml、維生素E 1.5g、檸檬酸0.15g、L-脯氨酸0.2mg、蔗糖2.5g、瓊脂8g、蛋白胨12g、酵母浸膏1.4g、硫酸銨1g、磷酸鈉2.5g、牛肉膏3.5g和硝酸鈉4g；
將上述物質(zhì)加入到去離子水中，充分?jǐn)嚢柰耆?，并用去離子水定容至1000ml，即得到第一培養(yǎng)液；
S2-2：按照1:50的體積比，將所述種子液接種于所述第一培養(yǎng)液中，在34-36℃下通風(fēng)振蕩培養(yǎng)24小時(shí)(通風(fēng)比為1:1，氧氣體積含量為17％，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第一擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S3：使用第二培養(yǎng)液對第一擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液
S3-1：將第一培養(yǎng)液中的酵母浸膏用量減半(即降低為0.7g)，且金屬元素水溶液的用量增大一倍(即增大到50ml)，其它均不變，從而得到第二培養(yǎng)液；
S3-2：按照1:35的體積比，將所述第一擴(kuò)增培養(yǎng)液接加入到所述第二培養(yǎng)液中，在34-36℃下通入空氣振蕩培養(yǎng)16小時(shí)(通風(fēng)比為1:1，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為170轉(zhuǎn)/分鐘)，從而得到第二擴(kuò)增培養(yǎng)液；
S4：第二擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液
將所述第二擴(kuò)增培養(yǎng)液加入到為其體積30倍的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間為12小時(shí)，期間一直通入空氣，通入空氣的通風(fēng)比為1:1，從而得到發(fā)酵液；
其中，所述兩段式升溫發(fā)酵培養(yǎng)是指在發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間的前一半時(shí)間(即前6個(gè)小時(shí))中，發(fā)酵溫度為34℃，然后在10分鐘內(nèi)將溫度升高至40℃，并在該溫度下完成后續(xù)剩余時(shí)間(即后6個(gè)小時(shí))的發(fā)酵；
S5：將發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵，并進(jìn)行后處理，得到側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑，從而完成側(cè)孢芽孢桿菌的所述培養(yǎng)方法，具體為：
按照質(zhì)量比1:14的比例，將所述發(fā)酵液淋入固體培養(yǎng)基中，再加入適量去離子水，使整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，然后充分翻拌均勻，裝入長度為3米、寬度為1.5米和深度為1.5米的發(fā)酵槽中，自然堆積發(fā)酵70小時(shí)，期間始終保持整體的水分質(zhì)量含量為32-36％，并通入無菌風(fēng)保持發(fā)酵槽內(nèi)部的中心溫度為56-60℃；發(fā)酵結(jié)束后，通熱風(fēng)干燥，直至水分質(zhì)量含量低于5％，得到發(fā)酵菌劑，將其命名為F3，從而完成所述培養(yǎng)方法。
對比例1-6：培養(yǎng)液的考察
對比例1-3：除分別將實(shí)施例1-3的步驟S3的第二培養(yǎng)液替換為第一培養(yǎng)液外(即在步驟S2-S3中均使用第一液體培養(yǎng)基)，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對比例1-3，將所得側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑順次命名為D1、D2和D3。
對比例4-6：除分別將實(shí)施例1-3的步驟S2的第一培養(yǎng)液替換為第二培養(yǎng)液外(即在步驟S2-S3中均使用第二液體培養(yǎng)基)，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對比例4-6，將所得側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑順次命名為D4、D5和D6。
對比例7-10：步驟S2-2中通風(fēng)中氧含量的考察
分別采用下表所示的步驟S2-2中的氧體積含量(其它操作均不變)，所使用氧體積含量、對應(yīng)實(shí)施例和最終所得側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑的命名見下表1。
表1
對比例11-16：步驟S4中兩段式升溫的考察
對比例11-13：除分別將實(shí)施例1-3的步驟S4的兩段式升溫修改為均在各自的第一段溫度下全程實(shí)施完所有的發(fā)酵(相應(yīng)地?zé)o需10分鐘的升溫操作)，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對比例11-13(即對比例11、12、13的步驟S3中的全程發(fā)酵溫度分別為33℃、32℃、34℃)，將所得側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑順次命名為D11、D12和D13。
對比例14-16：除分別將實(shí)施例1-3的步驟S4的兩段式升溫修改為均在各自的第二段溫度下全程實(shí)施完所有的發(fā)酵(相應(yīng)地?zé)o需10分鐘的升溫操作)，其它操作均不變，從而重復(fù)操作了實(shí)施例1-3，分別得到對比例14-16(即對比例11、12、13的步驟S3中的全程發(fā)酵溫度分別為39℃、38℃、40℃)，將所得側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑順次命名為D14、D15和D16。
性能考察
A、菌落計(jì)數(shù)的考察
按照本領(lǐng)域中的常規(guī)測試方法，對各個(gè)實(shí)施例和對比例得到的不同側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑在制備得到后，立刻進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)考察，分別考察了每克發(fā)酵菌劑中的活菌數(shù)和芽孢率，結(jié)果見下表2。
其中，相同組別的多個(gè)發(fā)酵菌劑均取其平均數(shù)。
表2
由此可見：1、本發(fā)明方法得到的F1-F3具有很高的活菌數(shù)和芽孢率；2、而當(dāng)一直使用第一培養(yǎng)液或第二培養(yǎng)液時(shí)，活菌數(shù)和芽孢率均有顯著降低，尤其是第二培養(yǎng)液降低更為明顯(見D4-D6)；3、步驟S2-2中通風(fēng)的氧含量非常重要，當(dāng)為17％時(shí)可以取得最好的技術(shù)效果，偏離該值越大，則活菌數(shù)和芽孢率降低越明顯(見D7-D10)，這證明氧含量的確定具有非顯而易見性，且效果不可預(yù)料；4、步驟S4中的兩段式升溫發(fā)酵對于最終結(jié)果同樣有著最為顯著的影響，當(dāng)未進(jìn)行升溫操作，一直在第一階段溫度下發(fā)酵時(shí)，活菌數(shù)和芽孢率最差(見D11-D13)；直在第一階段溫度下發(fā)酵時(shí)，活菌數(shù)和芽孢率也降低顯著(見D14-D16)，但要優(yōu)于D11-D13，這證明了只有采用本發(fā)明的兩段式升溫，才能取得最好的技術(shù)效果。
B、耐高溫性的考察
各個(gè)實(shí)施例和對比例在得到不同的側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑后40分鐘，分別在不同的溫度(70℃、80℃、90℃和100℃)下恒溫保持20分鐘，然后再次測量其活菌數(shù)，并與初始活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)算，從而得到高溫后的存活率，結(jié)果見下表3。
其中，相同組別的多個(gè)發(fā)酵菌劑均取其平均數(shù)。
表3
由此可見：1、本發(fā)明方法得到的F1-F3具有優(yōu)異的抗高溫性能，這在發(fā)酵制備有機(jī)肥時(shí)具有更好的高溫適應(yīng)性；2、而對比例的發(fā)酵菌劑的耐高溫性能，尤其是在高于80℃時(shí)具有明顯的降低，尤其是D11-D13，此時(shí)的菌落耐高溫性能顯著降低。
C、儲存穩(wěn)定性的考察
將各個(gè)實(shí)施例和對比例在得到不同的側(cè)孢芽孢桿菌發(fā)酵菌劑后，常溫下避光保存一定的時(shí)間，并分別考察不同時(shí)間時(shí)的活菌數(shù)，并與初始活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)算，從而得到不同儲存時(shí)間后的存活率，結(jié)果見下表4。
其中，相同組別的多個(gè)發(fā)酵菌劑均取其平均數(shù)。
表4
由此可見：1、本發(fā)明方法得到的F1-F3具有優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性，這在飼料和微生物肥料領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可以儲存更長時(shí)間；2、而對比例的發(fā)酵菌劑的儲存穩(wěn)定性則有明顯的降低，尤其是D7-D8、D11-D16降低最為顯著，其中D11-D13最差，這證明步驟S3中的氧含量以及步驟S4中的兩段式升溫發(fā)酵可不可預(yù)測地影響最終性能。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種側(cè)孢芽孢桿菌的新型培養(yǎng)方法，所述方法通過獨(dú)特的多個(gè)技術(shù)特征之間的相互組合和協(xié)同，從而得到具有優(yōu)異技術(shù)效果的最終側(cè)孢芽孢桿菌的發(fā)酵菌劑，能夠滿足多個(gè)領(lǐng)域的廣泛需求，具有良好的應(yīng)用前景和工業(yè)化生產(chǎn)潛力。
應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例的用途僅用于說明本發(fā)明而非意欲限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，也應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動、修改和/或變型，所有的這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍之內(nèi)。