技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的培養(yǎng)基、菌株及方法，屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
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豌豆是制取粉絲用淀粉的主要豆類(lèi)產(chǎn)品之一，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)和膳食纖維。在我國(guó)，除少量豌豆用來(lái)直接食用外，約98%的豌豆用來(lái)加工成淀粉、蛋白和生產(chǎn)粉絲。無(wú)論是傳統(tǒng)的“酸漿法”豌豆淀粉生產(chǎn)工藝，還是現(xiàn)代的豌豆蛋白、豌豆淀粉生產(chǎn)工藝過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量廢水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。目前我國(guó)豌豆粉絲生產(chǎn)企業(yè)中，每生產(chǎn)一噸豌豆粉絲會(huì)產(chǎn)生13-15噸廢水，而“粉絲之都”招遠(yuǎn)每年產(chǎn)生的粉絲廢水高達(dá)600萬(wàn)噸。這些廢水中含有豐富的蛋白質(zhì)，膳食纖維，低聚糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，COD、BOD、SS等指標(biāo)特別高，此類(lèi)污水治理難度非常大，投入成本很高，同時(shí)造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。
聚谷氨酸作為一種新型功能性肥料，可以改良土壤環(huán)境、修復(fù)污染土壤、增強(qiáng)化肥農(nóng)藥效果，市場(chǎng)前景廣闊。
聚谷氨酸的合成方式主要有：化學(xué)合成法、固體發(fā)酵法和液體發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法工藝復(fù)雜，副產(chǎn)物多，很難得到純度較高的產(chǎn)品，沒(méi)有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。固體發(fā)酵法產(chǎn)量低且不穩(wěn)定，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，已經(jīng)逐漸退出歷史舞臺(tái)。目前，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的研究十分活躍，但生產(chǎn)上培養(yǎng)基原料成本高、產(chǎn)量低，導(dǎo)致其銷(xiāo)售價(jià)格高，嚴(yán)重制約了其在肥料領(lǐng)域的應(yīng)用，急需開(kāi)發(fā)新的生產(chǎn)工藝技術(shù)，降低其生產(chǎn)成本，擴(kuò)大市場(chǎng)應(yīng)用范圍。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種利用豌豆蛋白廢水采用微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，該方法培養(yǎng)基原料成本低、操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高。
本發(fā)明的目的還在于提供一種針對(duì)于納豆枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明的技術(shù)方案：本發(fā)明用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的菌株為納豆枯草芽孢桿菌，保藏名稱(chēng)為：Bacillus subtilis LD-9308，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于其組分(g/L)為：葡萄糖10-30，谷氨酸或谷氨酸鈉 30-50，硫酸銨20-40，磷酸氫二鉀1-3，余量為豌豆蛋白廢水，pH 6.5-7.5。
用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟：
（1）菌種活化：
采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.0-7.5；
在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線(xiàn)，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-24小時(shí)，備用；
（2）搖瓶種子制備：
搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10-20，蛋白胨 5-15，谷氨酸鈉 5-10，酵母提取物3-5， KH2PO4 1-3，MgSO4 0.2-0.5，硫酸銨0.2-0.8，余量水，pH 6.5-7.5；
250ml三角瓶裝液量為20-50ml，500ml三角瓶裝液量為40-80ml，115℃滅菌20-30分鐘；
在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200-250 rpm，培養(yǎng)時(shí)間6-15小時(shí)；
（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：
發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸銨5-10，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 6.5-7.5；
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量0.5%-2.0%（V/V）；
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量1：0.2-0.5,培養(yǎng)時(shí)間6-12小時(shí)；
（4）發(fā)酵培養(yǎng)：
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10-30，谷氨酸或谷氨酸鈉 30-50，硫酸銨20-40，磷酸氫二鉀1-3，余量為豌豆蛋白廢水，pH 6.5-7.5。
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量1%-3%（V/V）。
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培養(yǎng)時(shí)間20-25小時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量2.5-4.5%。
本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果：申請(qǐng)人通過(guò)多年的菌種選育工作，篩選到一株適合利用豌豆蛋白廢水生產(chǎn)聚谷氨酸的納豆枯草芽孢桿菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)工藝優(yōu)化，確定了生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品具有高質(zhì)量、低成本、環(huán)境效益突出的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明是利用豌豆蛋白廢水進(jìn)行聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)品的高效合成，對(duì)豌豆蛋白廢水進(jìn)行高質(zhì)化利用，在處理廢水的同時(shí)還能夠產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。與其他方法相比，它具有成本低、產(chǎn)量大、提取率高、幾乎沒(méi)有環(huán)境破壞性等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明能夠很好地解決掉工廠廢液利用和資源循環(huán)問(wèn)題。同時(shí)本生產(chǎn)技術(shù)獲得的聚谷氨酸產(chǎn)品不僅創(chuàng)造收入，還能夠?yàn)檗r(nóng)業(yè)帶來(lái)更多的利益。
具體實(shí)施方式：下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)說(shuō)明：
本發(fā)明用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的菌株為納豆枯草芽孢桿菌，保藏名稱(chēng)為：Bacillus subtilis LD-9308，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。
菌種選育、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化：以自然菌種富集法制作納豆，從拉絲好的納豆制品中分離芽孢桿菌菌株。從分離純化的685株菌中，篩選到一株聚谷氨酸產(chǎn)量高的菌株，首先按芽孢桿菌的要求進(jìn)行了傳統(tǒng)方法鑒定，包括形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定，如革蘭氏染色和芽孢染色，接觸酶、甲基紅、V-P 反應(yīng)、硝酸鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、水解淀粉、明膠液化、卵磷脂酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、形成吲哚、分解酪素等試驗(yàn)，表明為芽孢桿菌屬。又進(jìn)行了16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物純化和測(cè)序，利用Blast軟件與基因庫(kù)中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，菌株l6S rDNA與枯草芽孢桿菌的16s rDNA序列同源性達(dá)99.12% ，表明該菌株確為枯草芽孢桿菌。對(duì)該菌株的產(chǎn)生聚谷氨酸的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
實(shí)施例1：用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，其包括如下步驟：
（1）菌種活化：
采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.0；
在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線(xiàn)，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10小時(shí)，備用。
（2）搖瓶種子制備：
搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，谷氨酸鈉8，酵母提取物4， KH2PO4 2，MgSO4 0.3 ，硫酸銨0.5，余量水，pH 7；
250ml三角瓶裝液量為35ml，500ml三角瓶裝液量為60ml，115℃滅菌25分鐘；
在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速220 rpm，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。
（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：
發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，硫酸銨8，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 7；
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量1.0%（V/V）；
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量1：0.3,培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)。
（4）發(fā)酵培養(yǎng)：
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，谷氨酸或谷氨酸鈉 40，硫酸銨30，磷酸氫二鉀2，余量為豌豆蛋白廢水，pH 7；
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量2%（V/V）。
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速220 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.25,后期1：0.4,培養(yǎng)時(shí)間23小時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量4.5%。
實(shí)施例2：用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，其包括如下步驟：
（1）菌種活化：
采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.2；
在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線(xiàn)，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15小時(shí)，備用。
（2）搖瓶種子制備：
搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，谷氨酸鈉 5，酵母提取物3， KH2PO4 1，MgSO4 0.2 ，硫酸銨0.2，余量水，pH 6.5；
250ml三角瓶裝液量為20ml，500ml三角瓶裝液量為40ml，115℃滅菌20分鐘；
在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí)。
（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：
發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，硫酸銨5，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 6.5；
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量0.5%（V/V）；
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量1：0.2,培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí)。
（4）發(fā)酵培養(yǎng)：
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，谷氨酸或谷氨酸鈉 30，硫酸銨20，磷酸氫二鉀1，余量為豌豆蛋白廢水，pH 6.5。
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量1%（V/V）。
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.2,后期1：0.3,培養(yǎng)時(shí)間20小時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量3.5%。
實(shí)施例3：用豌豆蛋白廢水發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的方法，其包括如下步驟：
（1）菌種活化：
采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH7.5；
在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線(xiàn)，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，備用。
（2）搖瓶種子制備：
搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨15，谷氨酸鈉 10，酵母提取物5， KH2PO43，MgSO4 0.5，硫酸銨0.8，余量水，pH 7.5；
250ml三角瓶裝液量為50ml，500ml三角瓶裝液量為80ml，115℃滅菌30分鐘；
在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速250 rpm，培養(yǎng)時(shí)間15小時(shí)。
（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：
發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，硫酸銨10，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 7.5；
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量2.0%（V/V）；
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速250 rpm，通氣量1： 0.5,培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。
（4）發(fā)酵培養(yǎng)：
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，谷氨酸或谷氨酸鈉50，硫酸銨40，磷酸氫二鉀3，余量為豌豆蛋白廢水，pH 7.5。
115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量3%（V/V）。
培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速250 rpm，通氣量前10小時(shí)1： 0.3,后期1： 0.5,培養(yǎng)時(shí)間25小時(shí)，聚谷氨酸產(chǎn)量4.2%。
以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，其它優(yōu)選實(shí)施方式在此不一一累述，且并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落于本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。