本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物防治領(lǐng)域，特別涉及一種抗大棚蔬菜灰霉枯草芽孢桿菌的篩選和菌劑制備方法。
背景技術(shù)：
：
灰霉病是蔬菜生產(chǎn)中的一種世界性的主要病害，病原主要為灰葡萄孢菌(Boytrytiscinerea)，屬半知菌亞門真菌，其有性世代屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)盤菌綱(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)核盤菌科(Sclerotiniaceae)中的葡萄抱盤菌屬(Botrytinia)。它能危害番茄、草莓、梨、洋蔥、葡萄等多種蔬菜和瓜果。病原菌多從開敗的雌花浸人，致使花瓣腐爛，并且長出淡灰綠色的霉層，使幼果迅速變軟，被害部位停止生長、腐爛或者脫落，爛花或者爛果附著在莖上引起莖部病害、嚴重時下部的莖腐爛使上部枯死?；颐咕坏绊懱幱谏L期的植物，有時它不在生長的植株上表現(xiàn)癥狀，而是處于潛伏狀態(tài).在收獲后的果實儲藏和運輸過程中，由于儲藏箱中的濕度大、溫度低而大規(guī)模發(fā)病，使得農(nóng)業(yè)經(jīng)濟受到巨大損失。
目前對灰霉病菌的防治主要以化學防治為主，輔以生物防治和農(nóng)業(yè)措施防治。由于灰霉菌很容易產(chǎn)生抗藥性，且施藥時主要以果實為靶標，直接對消費者構(gòu)成威脅，使得化學防治的方法越來越不能為大眾所接受。不僅如此大量的施用農(nóng)藥也對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境造成很大的負面影響。而農(nóng)業(yè)措施防治投入大費時費工并且效果不理想。因此迫切需要一種高效、低毒的防治措施，將病害損失控制在經(jīng)濟閥值以下。生物防治由于其低污染、低殘留的特性而凸顯出優(yōu)勢，成為目前研究的重點，篩選抗灰霉的有益菌株及其代謝產(chǎn)物來防治灰霉是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的方向，具有廣闊的應用前景。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：
本發(fā)明針對灰霉菌對番茄的等農(nóng)作物危害巨大，設(shè)施農(nóng)業(yè)及化學防治方法效果有限的現(xiàn)狀，篩選高效灰霉拮抗菌株用于灰霉病害的生物防治。
技術(shù)方案：
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
從山東、河北、江西、北京等蔬菜種植地采集土壤、蔬菜根、葉、花、果樣品。采用平板培養(yǎng)和挑取單菌落的方法，從這些新鮮的樣品中分離灰霉和細菌。通過將分離得到的細菌與灰霉菌拮抗試驗，篩選抗灰霉微生物用于灰霉生物防治。然后對分離到的能夠抑制灰霉的微生物，并進行鑒定，進而通過規(guī)?；l(fā)酵制備菌劑，應用于大棚蔬菜灰霉的防治。
具體實施方式
實施例1：大棚蔬菜灰霉的篩選和孢子制備
從山東、河北、江西、北京等蔬菜種植地采集土壤、蔬菜根、葉、花、果樣品84份。采集新鮮樣品后置于4℃冰箱保存，一周內(nèi)完成微生物分離。土壤和蔬菜根部灰霉分離方法為：取3-5g土壤或用消毒過的剪刀剪碎的蔬菜根置于100ml無菌水中，室溫下150rpm震蕩1h后，用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6.、10-7、10-8八個梯度，取稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的樣品0.1ml涂布于PDA固體培養(yǎng)基((馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉10～15g，蒸餾水1000mL))上，27℃培養(yǎng)5天，然后分離鑒定?；颐规咦討腋∫旱臏蕚洌簩⒎蛛x鑒定后的灰霉接種在PDA斜面上，27℃培養(yǎng)6天，用無菌水將孢子沖洗下來，用4層無菌紗布過濾，得到孢子懸液，用無菌水調(diào)整孢子濃度為100個左右每毫升。
實施例2：抗灰霉菌芽孢桿菌的初篩
從山東、河北、江西、北京等蔬菜種植地采集土壤、蔬菜根、葉、花、果樣品84份。采集新鮮樣品后置于4℃冰箱保存，一周內(nèi)完成微生物分離。土壤和蔬菜根部灰霉分離方法為：取3-5g土壤或用消毒過的剪刀剪碎的蔬菜根置于100ml無菌水中，室溫下150rpm震蕩1h后，用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6.、10-7、10-8八個梯度，取稀釋倍數(shù)為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的樣品0.1ml涂布于LB培養(yǎng)基(酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，蒸餾水1 000mL；固體加入10～15g瓊脂粉)平板上，在25-30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況，24-48h菌落長出，挑取菌落形態(tài)不同的菌落于LB試管斜面上，在25-30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，得到466株細菌，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例3：抗灰霉菌芽孢桿菌的復篩
細菌懸浮液的準備：將分離得到的細菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，200rmp，30℃搖床培養(yǎng)48h?；颐规咦拥呐囵B(yǎng)：將0.1ml灰霉孢子懸液涂布在PDA平板上，培養(yǎng)12h后，在平板中央放入紙碟，紙碟上加入25μl細菌懸浮液，30℃培養(yǎng)，觀察并測定抑菌圈的大小。經(jīng)過篩選得到菌株ZZ-302對灰霉有強烈的抑制作用，抑菌圈達到32mm。通過生理生化鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
實施例4抗大棚蔬菜灰霉枯草芽孢桿菌菌劑制備
將菌株ZZ-302首先接種于LB液體培養(yǎng)基，200rmp，30℃搖床培養(yǎng)48h。然后接種于10L發(fā)酵罐，轉(zhuǎn)速200-300rpm,溫度30℃，培養(yǎng)12-24h，收集菌劑，通過灌溉、噴霧等方法應用于蔬菜大棚。
<110> 中國科學院過程工程研究所
<120> 一種抗大棚蔬菜灰霉枯草芽孢桿菌的篩選和菌劑制備方法
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis zz-302
<400> 1
cagagggtgc tatacatgca agtcgagccc acagatggga gcttgctccc tgatgttagc 60
ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa 120
ccggggctaa taccggatgg ttgtctgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg 180
gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240
aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300
ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360
gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac 420
aagtgccgtt caaatagggc cccaccttga cggtacctat ccagaaagcc acggctttct 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaaaa attgggcgta 540
aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgattgcc cccggctcaa ccggggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaggag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720
acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagccggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcccaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagttcct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtggccttc gggggcagag tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaacc tggggatgac gtcaaatcat catgccccaa atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct 1260
gttctcagaa cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtttccttt atggagccag ccgccgaagg 1440
ggacag 1446