本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法及其發(fā)酵產(chǎn)物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蠟樣芽孢桿菌是芽胞桿菌屬中的一種。菌體細(xì)胞桿狀，末端方，成短或長鏈，1.0～1.2×3.0～5.0微米，產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊無明顯膨大，革蘭氏陽性，無莢膜，運(yùn)動，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則。蠟樣芽孢桿菌的菌落形態(tài)：在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落直徑5-7mm。蠟樣芽孢桿菌在M.S.P培養(yǎng)基上生長更旺盛，菌落直徑達(dá)8-10mm，質(zhì)地更軟，挑起來呈絲狀，培養(yǎng)時間稍長，菌落表面呈毛玻璃狀，并產(chǎn)生紅色色素。蠟樣芽孢桿菌在蛋白胨酵母膏平板上菌落為灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大。有益蠟樣芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)生產(chǎn)生物制品的菌種，具有調(diào)節(jié)宿主微生態(tài)平衡的功能，廣泛應(yīng)用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等各領(lǐng)域。目前對于蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵方式主要為液體發(fā)酵，這種發(fā)酵方式普遍存在活菌數(shù)和芽孢率偏低的問題，沒有芽孢的菌體會在短時間內(nèi)死亡，大大降低菌劑的活性和質(zhì)量穩(wěn)定性。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，該發(fā)酵方法采用高密度固體發(fā)酵培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌，能促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌的生長，提高蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)量和芽孢產(chǎn)率。本發(fā)明的目的之二在于提供一種所述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法得到的蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物，該發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)高、雜菌率低、芽孢率高，具有高效防治植物根結(jié)線蟲的功能。本發(fā)明的目的之三在于提供一種所述的蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物在制備農(nóng)業(yè)生物防治制劑和防治植物土傳病害中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：將蠟樣芽孢桿菌菌株經(jīng)種子活化和液體種子培養(yǎng)后，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：40～60重量份蘑菇渣、10～30重量份稻殼、15～35重量份麩皮和2～8重量份玉米漿，pH值為6.5～7.5。優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到斜面種子；(b)液體種子培養(yǎng)：將步驟(a)得到的斜面種子接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到液體種子；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(b)得到的液體種子接種于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間48～72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物干燥后，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟(a)中營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0～7.2。進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟(b)中液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0～7.2。進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟(c)中液體種子的接種量為8～12％(v/w)。進(jìn)一步，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟(c)中固體培養(yǎng)基為淺盤濕固體培養(yǎng)基，所述淺盤濕固體培養(yǎng)基為將固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)加水得到，淺盤濕固體培養(yǎng)基的水含量為55～65％。優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟(d)中干燥具體包括：將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物烘干至含水率小于20％。優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均獨立地在使用前進(jìn)行滅菌處理，滅菌條件為121℃、0.11MPa滅菌20～60min。優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0～7.2；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0～7.2；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48～72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為6.5～7.5；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于50～80℃條件下烘干，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20％時，烘干結(jié)束，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物，按照上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法得到。一種上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物在制備農(nóng)業(yè)生物防治制劑和防治植物土傳病害中的應(yīng)用。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明的發(fā)酵方法是一種固體發(fā)酵培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌的方法，采用該方法能顯著促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌的生長，提高蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)量和芽孢產(chǎn)率。此外，該發(fā)酵方法的培養(yǎng)基成分易得且價格低廉，全部采用農(nóng)副產(chǎn)品，配方合理，能夠滿足菌種大量繁殖的需要，發(fā)酵工藝簡單、發(fā)酵周期短，可有效降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，且產(chǎn)量更高，具有較大的優(yōu)勢。(2)本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物中蠟樣芽孢桿菌有效活菌數(shù)可達(dá)100億/g，細(xì)胞密度高，雜菌率低于5％，且芽孢率高達(dá)95％以上。(3)試驗表明，本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物中蠟樣芽孢桿菌適應(yīng)性強(qiáng)，在低營養(yǎng)下即可快速生長繁殖，在植物根際能夠快速大量定殖，具有良好的應(yīng)用前景。由該發(fā)酵產(chǎn)物制備的生物防治制劑可以作為生物農(nóng)藥，不僅能高效地防治植物根結(jié)線蟲等土傳病害，還能有效促進(jìn)作物生長和提高作物產(chǎn)量，是一種極具應(yīng)用前景的生物防治制劑。(4)固體發(fā)酵所使用的原料成本較經(jīng)濟(jì)，所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)更豐富，下游的回收純化過程及廢棄物處理通常較為簡單，通常是整個基質(zhì)都被使用，較液體發(fā)酵更具優(yōu)勢。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：將蠟樣芽孢桿菌菌株經(jīng)種子活化和液體種子培養(yǎng)后，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：40～60重量份蘑菇渣、10～30重量份稻殼、15～35重量份麩皮和2～8重量份玉米漿，pH值為6.5～7.5。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是芽胞桿菌屬中的一種，是從土壤中分離獲得的，其具有以下生物學(xué)特性：在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落直徑5-7mm。在M.S.P培養(yǎng)基上生長更旺盛，菌落直徑達(dá)8-10mm，質(zhì)地更軟，挑起來呈絲狀，培養(yǎng)時間稍長，菌落表面呈毛玻璃狀，并產(chǎn)生紅色色素。在蛋白胨酵母膏平板上菌落為灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大。根據(jù)申請?zhí)枮?01410061856.X、公開號為103937699B的中國專利文獻(xiàn)的記載，本發(fā)明所提供的蠟樣芽孢桿菌已于2014年1月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學(xué))，保藏號：CCTCCNO:M2014007，名稱為：蠟樣芽孢桿菌zy-1(Bacilluscereuszy-1)，20年內(nèi)公眾可從中國典型培養(yǎng)物保藏中心獲取該菌種。種子活化是將保藏菌種從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變成對數(shù)生長狀態(tài)，以便菌種能很快適應(yīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的需要，操作是接種保藏菌種于固體斜面。種子活化不僅活化菌種，也培養(yǎng)一定數(shù)量的斜面種子。液體種子培養(yǎng)是經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得供發(fā)酵接種的足夠數(shù)量和優(yōu)質(zhì)質(zhì)量的種子。擴(kuò)大培養(yǎng)可經(jīng)過搖瓶和種子罐進(jìn)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基的蘑菇渣為廢棄的蘑菇料渣，含有豐富的粗蛋白、粗脂肪和氮浸出物，還含有鈣、磷、鉀、硅等礦物質(zhì)。蘑菇渣典型但非限制性的含量例如為40重量份、42重量份、44重量份、46重量份、48重量份、50重量份、52重量份、54重量份、56重量份、58重量份或60重量份。固體培養(yǎng)基的稻殼為稻谷外面的一層殼，稻殼富含纖維素、木質(zhì)素、二氧化硅，脂肪、蛋白質(zhì)的含量較低。稻殼典型但非限制性的含量例如為10重量份、12重量份、14重量份、16重量份、18重量份、20重量份、22重量份、24重量份、26重量份、28重量份或30重量份。固體培養(yǎng)基的麩皮為小麥最外層的表皮。麩皮典型但非限制性的含量例如為15重量份、16重量份、17重量份、18重量份、19重量份、20重量份、21重量份、22重量份、23重量份、24重量份、25重量份、26重量份、27重量份、28重量份、29重量份、30重量份、31重量份、32重量份、33重量份、34重量份或35重量份。固體培養(yǎng)基的玉米漿是制玉米淀粉的副產(chǎn)物。制造玉米淀粉須將玉米粒先用亞硫酸浸泡，浸泡液濃縮即制成黃褐色的液體，即玉米漿。玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)，含大約40％～50％固體物質(zhì)。玉米漿典型但非限制性的含量例如為2重量份、3重量份、4重量份、5重量份、6重量份、7重量份或8重量份。固體培養(yǎng)基的pH值為6.5～7.5，例如6.5、7.0或7.5。該培養(yǎng)基全部采用農(nóng)副產(chǎn)品，成本低，配方合理，通過一定量的蘑菇渣、稻殼、麩皮和玉米漿配合，能夠滿足菌種大量繁殖需要。傳統(tǒng)的蠟樣芽孢桿菌的發(fā)酵方式主要為液體發(fā)酵，存在活菌數(shù)和芽孢率偏低的問題，大大降低菌劑的活性和質(zhì)量穩(wěn)定性。本發(fā)明采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)蠟樣芽孢桿菌，工藝簡單、易于實施，通過采用該方法能夠顯著促進(jìn)蠟樣芽孢桿菌的生長，提高蠟樣芽孢桿菌的活菌數(shù)量和芽孢產(chǎn)率。高密度固體發(fā)酵一般指發(fā)酵產(chǎn)物中細(xì)胞密度超過常規(guī)培養(yǎng)的生長狀態(tài)，目前市場上的蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵品中菌數(shù)基本在30～60億/g，而本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物中菌數(shù)可達(dá)100億/g，屬于一種高密度的固體發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明所述的“主要由”，意指其除所述組份外，還可以包括其他組份，這些其他組份賦予所述復(fù)合肥不同的特性。除此之外，本發(fā)明所述的“主要由”，還可以替換為封閉式的“為”或“由……組成”。在一種優(yōu)選的實施方式中，蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到斜面種子；(b)液體種子培養(yǎng)：將步驟(a)得到的斜面種子接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到液體種子；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(b)得到的液體種子接種于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37±1℃，培養(yǎng)時間48～72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物干燥后，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。步驟(a)中，斜面培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基的一種形式，制作時應(yīng)趁熱定量分裝于試管內(nèi)，并凝固成斜面的稱為斜面培養(yǎng)基，用于菌種擴(kuò)大轉(zhuǎn)管及菌種保藏。營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基采用牛肉膏、蛋白胨等營養(yǎng)基質(zhì)配制而成。將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，對蠟樣芽孢桿菌種子進(jìn)行活化，典型但非限制性的培養(yǎng)溫度為36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培養(yǎng)時間為36h、40h、44h或48h，得到斜面種子。步驟(b)中，液體培養(yǎng)基為液體發(fā)酵罐物料，例如1000L液體發(fā)酵罐物料，液體發(fā)酵罐物料為采用牛肉膏、蛋白胨等營養(yǎng)基質(zhì)與水配制而成的液體培養(yǎng)基，將斜面種子接種于液體發(fā)酵罐物料中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)，典型但非限制性的培養(yǎng)溫度為36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培養(yǎng)時間為36h、40h、44h或48h，得到液體種子。步驟(c)中，將液體種子接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，典型但非限制性的培養(yǎng)溫度為36℃、37℃或38℃，典型但非限制性的培養(yǎng)時間為48h、54h、60h、66h或72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物。最后對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟(a)中營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0～7.2。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟(b)中液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0～7.2。牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉是菌種的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，通過各組分之間的合理配比關(guān)系，可滿足蠟樣芽孢桿菌菌種的生長需要。適宜生長的pH值為7.0、7.1或7.2。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟(c)中液體種子的接種量為8～12％(v/w)。接種量是指移入的種子液體積和接種后固體培養(yǎng)基質(zhì)量的百分比。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達(dá)高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來。典型但非限制性的接種量例如為8％、9％、10％、11％或12％。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟(c)中固體培養(yǎng)基為淺盤濕固體培養(yǎng)基，所述淺盤濕固體培養(yǎng)基為將固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)加水得到，淺盤濕固體培養(yǎng)基的水含量為55～65％。淺盤發(fā)酵是在一定的溫度和濕度環(huán)境中在底面開孔或不開孔的淺盤中利用固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物以生產(chǎn)微生物菌體或其代謝產(chǎn)物。由于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的濕度(體現(xiàn)在水份含量上)對微生物生產(chǎn)繁殖及代謝有很大關(guān)系，上述水含量百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。對蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行淺盤發(fā)酵時典型但非限制性的水分含量例如為55％、60％或65％，通過淺盤濕固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)，使蠟樣芽孢桿菌的生長達(dá)到最佳水平。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟(d)中干燥具體包括：將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物烘干至含水率小于20％。發(fā)酵后烘干主要是為了迅速降低發(fā)酵產(chǎn)生的大量水分，避免與空氣接觸感染變質(zhì)。優(yōu)選地，將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于50～80℃條件下烘干，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20％時，烘干結(jié)束。典型但非限制性的烘干溫度例如為50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基在使用前進(jìn)行滅菌處理，滅菌條件為121℃、0.11MPa滅菌20～60min。典型但非限制性的滅菌時間例如為20min、30min、40min、50min或60min。優(yōu)選地，采用高壓蒸汽滅菌。培養(yǎng)基在制備過程中容易混入各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，至少應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌。優(yōu)選地，一種典型的蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0～7.2；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36～48h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0～7.2；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48～72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為6.5～7.5；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于50～80℃條件下烘干，期間取樣測定水分，當(dāng)含水率低于20％時，烘干結(jié)束，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物，該產(chǎn)物按照上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法得到。通過上述高密度固體發(fā)酵方法制得的發(fā)酵產(chǎn)物中蠟樣芽孢桿菌有效活菌數(shù)高，可達(dá)100億/g，雜菌率低，小于5％，且芽孢率高，達(dá)95％以上。此外，蠟樣芽孢桿菌適應(yīng)性強(qiáng)，在低營養(yǎng)下即可快速生長繁殖，在植物根際能夠快速大量定殖，具有良好的應(yīng)用前景。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了一種上述蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵產(chǎn)物在制備農(nóng)業(yè)生物防治制劑和防治植物土傳病害中的應(yīng)用。利用該發(fā)酵產(chǎn)物可制備生物制劑或生物農(nóng)藥，起到防治植物根結(jié)線蟲等土傳病害的目的，還能有效提高作物產(chǎn)量，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域。為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法及效果作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實施例1一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例2一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.2；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間48h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.2；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量55％；將步驟(b)得到的液體種子以8％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間48h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：40重量份蘑菇渣、30重量份稻殼、15重量份麩皮和8重量份玉米漿，pH值為6.5；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于50℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例3一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度38℃，培養(yǎng)時間48h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.1；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌40min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度38℃，培養(yǎng)時間40h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.1；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌50min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量65％；將步驟(b)得到的液體種子以12％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度38℃，培養(yǎng)時間72h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：60重量份蘑菇渣、10重量份稻殼、35重量份麩皮和2重量份玉米漿，pH值為7.5；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于80℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例4一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌50min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌40min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.2；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量58％；將步驟(b)得到的液體種子以11％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：45重量份蘑菇渣、25重量份稻殼、20重量份麩皮和6重量份玉米漿，pH值為6.8；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于60℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例5一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌25min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.2；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量62％；將步驟(b)得到的液體種子以9％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：55重量份蘑菇渣、15重量份稻殼、30重量份麩皮和4重量份玉米漿，pH值為7.2；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于70℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例6一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以5％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例7一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量45％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。實施例8一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量70％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、20重量份稻殼、25重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例1一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/v)的接種量接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括：5重量份牛肉膏、9重量份蛋白胨、5重量份氯化鈉、12重量份葡萄糖、1重量份MnSO4·H2O、2重量份KH2PO4、0.5重量份MgSO4·7H2O和65.5重量份水，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例2一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：30重量份稻殼、35重量份麩皮和35重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例3一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、25重量份麩皮和25重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例4一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：50重量份蘑菇渣、30重量份稻殼和20重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例5一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：70重量份蘑菇渣、5重量份稻殼、40重量份麩皮和10重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。對比例6一種蠟樣芽孢桿菌固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：(a)斜面種子活化：將蠟樣芽孢桿菌菌株在無菌條件下接種于經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌20min的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到斜面種子；所述營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/L氯化鈉和20g/L瓊脂，pH值為7.0；(b)液體種子培養(yǎng)：挑取步驟(a)得到的斜面種子兩環(huán)接種于1000L液體發(fā)酵罐中的經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌30min的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間36h，得到液體種子；所述液體培養(yǎng)基的組分包括3g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨和5g/L氯化鈉，pH值為7.0；(c)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將經(jīng)121℃、0.11MPa滅菌60min的固體培養(yǎng)基的組分放入淺盤內(nèi)，加水得到淺盤濕固體培養(yǎng)基，淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量60％；將步驟(b)得到的液體種子以10％(v/w)的接種量接種于淺盤濕固體培養(yǎng)基中，攪拌均勻，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間60h，得到發(fā)酵產(chǎn)物；所述固體培養(yǎng)基的組分包括：30重量份蘑菇渣、40重量份稻殼、10重量份麩皮和5重量份玉米漿，pH值為7.0；(d)將步驟(c)得到的發(fā)酵產(chǎn)物置于65℃條件下烘干至含水率低于20％，得到干燥的發(fā)酵產(chǎn)物。效果例1發(fā)酵產(chǎn)物活菌和芽孢計數(shù)對各實施例和各對比例得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行活菌和芽孢計數(shù)?；罹嫈?shù)：以平板涂布法進(jìn)行計數(shù)。芽孢計數(shù)：將樣品在80℃水浴中處理15min后進(jìn)行平板涂布計數(shù)。具體包括：準(zhǔn)確稱取粉碎后發(fā)酵物料10g，放入盛有90mL無菌生理鹽水的三角瓶中制成菌懸液，80℃水浴15min殺死營養(yǎng)體，然后將菌懸液稀釋至10-7～10-8，取100μL均勻涂布到LB平板上，于37℃倒置培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計數(shù)。芽孢率＝芽孢數(shù)/活菌數(shù)×100％。試驗結(jié)果如表1所示。表1發(fā)酵產(chǎn)物活菌和芽孢計數(shù)結(jié)果由表1可以看出，本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物中蠟樣芽孢桿菌有效活菌數(shù)可達(dá)100億/g，雜菌率低于5％，且芽孢率高達(dá)95％以上。實施例1～實施例5得到的發(fā)酵產(chǎn)物中蠟樣芽孢桿菌的有效活菌數(shù)>100億/g，芽孢數(shù)>97億/g，芽孢率>95％，且雜菌數(shù)少，雜菌率<5％。實施例6與實施例1相比，液體種子的接種量小，抑制了菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖，有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)有所降低。實施例7，8與實施例1相比，有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)也有所降低，可見淺盤濕固體培養(yǎng)基水含量過少或過多，都不利于菌種的發(fā)酵及代謝。對比例1～對比例6的有效活菌數(shù)和芽孢數(shù)與實施例相比有顯著降低，雜菌也有所增加。對比例1采用傳統(tǒng)的液體發(fā)酵法，有效活菌數(shù)和芽孢率偏低；對比例2～對比例4采用的淺盤濕固體培養(yǎng)基中缺少部分營養(yǎng)成分，不能使蠟樣芽孢桿菌得到有效生長繁殖，對比例5～對比例6采用的淺盤濕固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分配比與本發(fā)明不同，也不能獲得較好的發(fā)酵效果。效果例2田間藥效試驗1)供試藥劑蠟樣芽孢桿菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物(實施例一和對比例一中制備)；噻唑膦10％顆粒劑(市售)；阿維菌素1.8％乳油(市售)。2)供試作物與防治對象：供試作物為黃瓜；品種為中農(nóng)1101；防治對象：根結(jié)線蟲。3)試驗地情況、試驗設(shè)計及安排試驗地設(shè)在山東省濟(jì)南市濟(jì)陽縣董家村黃瓜大棚，土壤為粘土地，往年根結(jié)線蟲病害發(fā)生嚴(yán)重。試驗地栽培條件均勻一致。田間試驗共設(shè)6個不同的處理：處理1為實施例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋10倍，施藥劑量為150L/hm2；處理2為實施例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋10倍，施藥劑量為400L/hm2；處理3為噻唑膦10％顆粒劑，施藥劑量為30kg/hm2；處理4為阿維菌素1.8％乳油500倍液，施藥劑量為15L/hm2；處理5為對比例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋10倍，施藥劑量為400L/hm2；處理6為無菌水空白對照(CK)，共6個處理，每處理0.1hm2，灌根黃瓜幼苗。在田間大棚培養(yǎng)2月后緩慢取出黃瓜植株根系，調(diào)查根結(jié)線蟲病情況，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果如表2所示。表2不同藥劑對黃瓜根結(jié)線蟲病害防治效果處理處理株數(shù)發(fā)病率(％)病情指數(shù)防治效果(％)處理150059.82％10.4670.24％處理250062.53％8.3575.87％處理350070.15％9.1274.32％處理450085.63％20.5464.58％處理550064.16％15.5666.37％處理6500100％89.82—其中：病情指數(shù)＝普遍率×嚴(yán)重度×100由表2可以看出，蠟質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物在400L/hm2大劑量使用時防治效果最好，達(dá)到75.87％，顯著高于阿維菌素1.8％乳油的64.58％，略高于小劑量使用后的70.24％，與噻唑膦10％顆粒劑74.32％的防治效果相近。可見，該發(fā)酵產(chǎn)物可用于制備生物藥劑，作為生物農(nóng)藥，植物根結(jié)線蟲等土傳病害有較好的防治效果。處理5與處理2相比，防治效果降低近10個百分點，可見采用液體發(fā)酵法得到的發(fā)酵產(chǎn)物中由于活菌數(shù)較少，對植物根結(jié)線蟲病不能起到較好的防治效果。效果例3蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對農(nóng)作物促生作用的田間試驗1)供試藥劑蠟樣芽孢桿菌菌株發(fā)酵產(chǎn)物(實施例一和對比例一中制備)。2)供試作物：供試作物為小麥、玉米和油菜。3)試驗設(shè)計田間試驗共設(shè)6個不同的處理：處理1為實施例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋100倍，制成菌懸液，浸種24h；處理2為實施例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋100倍，制成菌懸液，浸種24h并進(jìn)行灌根；處理3為實施例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋100倍，制成菌懸液，浸種24h、灌根并噴灑葉面；處理4為對比例一蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物加蒸餾水稀釋100倍，制成菌懸液，浸種24h；處理5為無菌水空白對照(CK)，浸種24h。每小區(qū)長7m，寬3m，2次重復(fù)，用常規(guī)的栽培方式進(jìn)行肥水管理。40d后，采樣測量株高、干鮮重，每個小區(qū)采樣50株。記錄鮮重、干重和株高。結(jié)果表明，處理1～處理4都能增加小麥植株干重和鮮重，與對照相比，鮮重增加了2％～15％，干重增加了2％～15％。處理1～處理3的增長幅度明顯比處理4的增長幅度大，處理1～處理3與對照相比，干、鮮重增加了9～15％，處理4與對照相比，干、鮮重增加了2～6％?？梢?，采用液體發(fā)酵后的發(fā)酵產(chǎn)物在對作物的促生長作用上較本發(fā)明效果差。此外，處理1～處理3較對照的增長幅度越來越大，通過多方面施用，可以進(jìn)一步增加其促生長效果。處理后，小麥株高除處理4與對照基本相當(dāng)外，其他幾個處理的小麥株高與對照相比都有所增加，增加幅度為2％～5％。經(jīng)過處理1～處理3處理過的小麥都較對照明顯健壯。按上述方法處理玉米和油菜，處理1～處理3都較對照明顯健壯，其鮮重和干重的增加均在6％～20％。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁1 2 3