本發(fā)明涉及一種提高大腸桿菌中己二酸產(chǎn)量的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

己二酸(Adipic acid，adipate)又稱肥酸，是一種重要的有機(jī)二元酸，廣泛應(yīng)用于化工生產(chǎn)、有機(jī)合成工業(yè)、醫(yī)藥、潤(rùn)滑劑制造等方面。

目前己二酸的主要生產(chǎn)方式是化學(xué)合成，但是該方法的產(chǎn)品收率并不高。此外，在己二酸的化學(xué)合成過(guò)程中主要以苯為原料，通過(guò)化學(xué)方法合成，原料和中間產(chǎn)物毒性很強(qiáng)，而且過(guò)程中產(chǎn)生大量的N₂O等溫室氣體，環(huán)境污染嚴(yán)重且不可持續(xù)。

為了解決上述問(wèn)題，人們將目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基礎(chǔ)工作。目前報(bào)道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。主要的生物催化法主要是利用微生物催化合成己二酸前體順，順-粘康酸，然后再利用金屬催化劑催化合成己二酸。全生物合成己二酸的方法包括：大腸桿菌以葡萄糖為底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作為底物全生物合成；釀酒酵母利用脂肪酸氧化法全生物合成己二酸。以葡萄糖為底物全生物合成己二酸具有工藝流程簡(jiǎn)單、總投入成本低、可循環(huán)利用等突出優(yōu)點(diǎn)，因此備受研究人員青睞。雖然目前在大腸桿菌中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了利用葡萄糖全生物合成己二酸，但是該途徑需要10步以上的酶促反應(yīng)，途徑冗長(zhǎng)且存在可逆反應(yīng)，最終己二酸的產(chǎn)量極低(低于1mg/L)，經(jīng)優(yōu)化目前已報(bào)道的己二酸的最高產(chǎn)量為2.5g/L。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供了一種產(chǎn)己二酸的重組大腸桿菌，是以大腸桿菌BL21(DE3)或敲除了atoB基因的大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，分模塊過(guò)量表達(dá)來(lái)自褐色喜熱裂孢菌的異源基因β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)，3-羥?；?輔酶A脫氫酶基因(Tfu_2399)，3-羥基己二酰脫氫酶基因(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因(Tfu_1648)，己二酰輔酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)；其中，基因Tfu_0875、Tfu_2399以pRSFDuet-1為表達(dá)載體；基因Tfu_0068、Tfu_1648以pTrc99a為表達(dá)載體；基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1為表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述重組大腸桿菌的方法，包括以下步驟：

(1)以質(zhì)粒pRSFDuet-1為骨架載體，連接基因片段Tfu_0875、Tfu_2399，得到重組質(zhì)粒pAD-1；

(2)以質(zhì)粒pTrc99a為骨架載體，連接基因片段Tfu_0068、Tfu_1648，得到重組質(zhì)粒pAD-4；

(3)以質(zhì)粒pCDFDuet-1為骨架載體，連接基因片段Tfu_2576、Tfu_2577，得到重組質(zhì)粒pAD-6；

(4)將pAD-1、pAD-4、pAD-6轉(zhuǎn)入敲除了atoB基因的大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組大腸桿菌Mad2ΔatoB。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)將基因片段Tfu_0875及質(zhì)粒pRSFDuet-1都用EcoR I和Hind III雙酶酶切處理后，以T₄ DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒pRSF-Tfu_0875；將Tfu_2399及重組質(zhì)粒pRSF-Tfu_0875都用Bgl II和Kpn I雙酶切處理，再用T₄ DNA連接酶連接，得到連接了基因片段Tfu_0875、Tfu_2399的重組質(zhì)粒即pAD-1。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(2)，基因片段Tfu_0068、Tfu_1648通過(guò)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ連接到質(zhì)粒pTrc99a上形成pAD-4質(zhì)粒。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(3)，基因片段Tfu_2576、Tfu_2577通過(guò)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ連接到質(zhì)粒pCDFDuet-1上形成pAD-6質(zhì)粒。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種應(yīng)用所述重組大腸桿菌Mad2ΔatoB發(fā)酵生產(chǎn)己二酸的方法，是以SOB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，將重組大腸桿菌Mad2ΔatoB于35～37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)加1mM IPTG并降溫至30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗剩2g/L左右時(shí)補(bǔ)加甘油，以維持甘油濃度在4g/L的速度進(jìn)行補(bǔ)料，直至甘油補(bǔ)加總量達(dá)到100g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述SOB培養(yǎng)基的成分為2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨芐青霉素、50μg/ml鏈霉素。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以2％的接種量，將重組大腸桿菌Mad2ΔatoB接種至裝有3L SOB培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1vvm，2M NaOH維持pH為6.8～7.2，發(fā)酵溫度37℃，培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8時(shí)加1mM IPTG，降溫至30℃誘導(dǎo)；待發(fā)酵培養(yǎng)基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右時(shí)補(bǔ)加甘油，以維持甘油濃度在4g/L的速度進(jìn)行補(bǔ)料，直至甘油補(bǔ)加總量達(dá)到100g/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，種子液的制備方法是將甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250rpm/min搖瓶過(guò)夜。次日取500μl菌液轉(zhuǎn)接于60ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，接種于5L發(fā)酵罐中。

本發(fā)明提供的重組大腸桿菌Mad2ΔatoB還可以用于連續(xù)循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)己二酸。例如，發(fā)酵到一定時(shí)間，將發(fā)酵體系中的重組菌菌體分離收集起來(lái)，轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，如此循環(huán)往復(fù)，可降低制備種子液的成本、縮短發(fā)酵時(shí)間。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：與化學(xué)法相比，大腸桿菌全生物法合成己二酸，首先產(chǎn)品的回收更加方便簡(jiǎn)單，而且極大程度地降低了對(duì)環(huán)境的污染程度。與前期已報(bào)道的生物法合成己二酸相比，本發(fā)明中所提到發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌BL21(DE3)高產(chǎn)己二酸。

以葡萄糖為唯一碳源，Mad2的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量分別為1.64g/L、發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)4.34g/L。我們發(fā)現(xiàn)在以Mad2為生產(chǎn)菌株發(fā)酵的過(guò)程中，發(fā)酵液中還有大量的副產(chǎn)物丁酸，通過(guò)敲除atoB基因，我們減少了副產(chǎn)物丁酸的產(chǎn)量，通過(guò)補(bǔ)料發(fā)酵將己二酸的產(chǎn)量進(jìn)一步提升到25.57g/L。由于構(gòu)建的重組大腸桿菌Mad2ΔatoB生長(zhǎng)狀況比較好，能長(zhǎng)時(shí)間在SOB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此我們利用此重組菌進(jìn)行循環(huán)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)此重組菌不但可以繼續(xù)生長(zhǎng)，而且可以產(chǎn)我們想要的產(chǎn)物己二酸。最終經(jīng)過(guò)十次循環(huán)搖瓶發(fā)酵，己二酸產(chǎn)量累積量達(dá)18.94g/L；這對(duì)于工業(yè)上連續(xù)化的大生產(chǎn)有著重要作用，可以減少菌體生長(zhǎng)時(shí)間，直接利用循環(huán)菌體發(fā)酵省時(shí)，快速，節(jié)約成本。

附圖說(shuō)明

圖1為己二酸合成途徑。

圖2為pAD-1質(zhì)粒圖譜。

圖3為pAD-3質(zhì)粒圖譜。

圖4為pAD-4質(zhì)粒圖譜。

圖5為pAD-6質(zhì)粒圖譜。

圖6為pRSF-Tfu_0875質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖譜，1：Marker，2：EcoR I/Hind III雙酶切pRSF-Tfu_0875質(zhì)粒，3：EcoR I/Hind III雙酶切pRSFDuet-1質(zhì)粒。

圖7為pAD-1質(zhì)粒菌落pcr驗(yàn)證圖譜，1：Marker，2-5：均為pAD-1菌落pcr驗(yàn)證Tfu_2399。

圖8為在OD 0.6，IPTG 0.8mM時(shí)不同培養(yǎng)基下Mad1發(fā)酵結(jié)果圖譜。

圖9為在SOB培養(yǎng)基，IPTG 0.8mM時(shí)不同OD下Mad1發(fā)酵結(jié)果圖譜。

圖10為在SOB培養(yǎng)基，OD 0.6時(shí)不同濃度IPTG誘導(dǎo)下Mad1發(fā)酵結(jié)果圖譜。

圖11為BL21(DE3)敲除atoB的菌落pcr驗(yàn)證圖譜，1-2：敲除atoB的菌株，3：未敲除atoB的對(duì)照菌株，4：Marker。

圖12為Mad2ΔatoB上罐發(fā)酵結(jié)果圖譜。

具體實(shí)施方式

表1下述實(shí)施例涉及的引物序列表

實(shí)施例1：重組質(zhì)粒pAD-1構(gòu)建及重組大腸桿菌的獲得。

Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列已于申請(qǐng)日前在NCBI中公布。

EcoR I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pRSFDuet-1，切膠回收目的基因片段(3798bp)，用同樣的酶酶切質(zhì)粒pUC57-Tfu_0875，切膠回收得到目的基因片段Tfu_0875，然后將兩個(gè)目的片段用T₄ DNA連接酶連接，化轉(zhuǎn)JM109，菌落PCR挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后的質(zhì)粒命名為pRSF-Tfu_0875。Bgl II和Kpn I酶切質(zhì)粒pRSF-Tfu_0875，切膠回收4936bp的目的基因片段，用同樣的酶酶切質(zhì)粒pUC57-Tfu_2399，切膠回收目的基因片段，然后將兩個(gè)目的片段用T₄ DNA連接酶連接，化轉(zhuǎn)JM109，菌落PCR挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后的質(zhì)粒命名為pAD-1。

其他質(zhì)粒使用同樣的方法進(jìn)行構(gòu)建，最終片段Tfu_0068、Tfu_1648分別通過(guò)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ，以及Nde Ⅰ、Avr Ⅱ連接到質(zhì)粒pETDuet-1上形成pAD-3質(zhì)粒；Tfu_0068、Tfu_1648通過(guò)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ連接到質(zhì)粒pTrc99a上形成pAD-4質(zhì)粒；Tfu_2576、Tfu_2577通過(guò)Nco Ⅰ、Hind Ⅲ連接到質(zhì)粒pCDFDuet-1上形成pAD-6質(zhì)粒。

將pAD-1、pAD-3、pAD-6轉(zhuǎn)入BL21(DE3)制備重組大腸桿菌Mad1；將pAD-1、pAD-4、pAD-6轉(zhuǎn)入BL21(DE3)制備重組大腸桿菌Mad2。

實(shí)施例2：重組大腸桿菌Mad1初步搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化。

發(fā)酵培養(yǎng)基：

SOB培養(yǎng)基，成分為2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl₂+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

M9培養(yǎng)基：M9鹽溶液+8g/L葡萄糖+2mM MgSO₄+0.1mM CaCl₂+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

LB培養(yǎng)基：1％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+1％NaCl+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

MOPS培養(yǎng)基：40mM MOPS+0.3％NH₄Cl+0.1％K₂HPO₄+2mM MgSO₄+0.1mM CaCl₂+50mM NaCl+100mM Bis-Tris+134μM EDTA+31μM FeCl₃+6.2μM ZnCl₃+0.76μM CuCl₂+0.42μM H₃BO₃+0.081μM MnCl₂+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

TB培養(yǎng)基：1.2％胰蛋白胨+2.4％酵母粉+17mM KH₂PO₄+72mM K₂HPO₄+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250rpm/min搖瓶過(guò)夜。

發(fā)酵條件：2％接種量(1ml)，接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，使其初始OD₆₀₀為0.1。37℃、250r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0時(shí)分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM IPTG誘導(dǎo)Mad1，改為30℃、250rpm/min培養(yǎng)。發(fā)酵策略：使用上述不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，誘導(dǎo)時(shí)的OD及IPTG濃度分別設(shè)定為以下梯度。OD₆₀₀梯度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，IPTG濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM。最終在OD₆₀₀0.6，IPTG 0.8mM時(shí)不同發(fā)酵培養(yǎng)基下發(fā)酵；在SOB培養(yǎng)基，IPTG 0.8mM時(shí)不同OD₆₀₀下發(fā)酵；在SOB培養(yǎng)基，OD₆₀₀0.6時(shí)不同濃度IPTG誘導(dǎo)下發(fā)酵。

結(jié)果分析：發(fā)酵過(guò)程中每4h取一次樣，10,000r/min離心2min將發(fā)酵液與菌體分離，0.22μm濾膜處理發(fā)酵液，用于進(jìn)行HPLC(高效液相色譜法，美國(guó)伯Bio-Rad伯樂(lè)Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱)檢測(cè)，HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相為5mM H₂SO₄，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器210nm。最終發(fā)現(xiàn)SOB培養(yǎng)基，OD₆₀₀在0.6、0.8時(shí)用1.0mM IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)己二酸的效率最高。

實(shí)施例3：Mad1、Mad2搖瓶發(fā)酵及結(jié)果分析。

發(fā)酵培養(yǎng)基：SOB培養(yǎng)基，成分為2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl₂+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250r/min搖瓶過(guò)夜。

發(fā)酵條件：2％接種量，接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基SOB中，使其初始OD₆₀₀為0.1。37℃、250r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8左右時(shí)加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)1mM IPTG誘導(dǎo)Mad1和Mad2，改為30℃、250rpm/min培養(yǎng)。

結(jié)果分析：發(fā)酵過(guò)程中每4h取一次樣，10,000r/min離心2min將發(fā)酵液與菌體分離，0.22μm濾膜處理發(fā)酵液，用于進(jìn)行HPLC(高效液相色譜法，美國(guó)伯Bio-Rad伯樂(lè)Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱)檢測(cè)，HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相為5mM H₂SO₄，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器210nm。Mad1、Mad2上罐發(fā)酵己二酸產(chǎn)量分別為0.119g/L，1.64g/L，故之后選用組合Mad2菌株進(jìn)行生產(chǎn)己二酸。

實(shí)施例4：Mad2上罐發(fā)酵及結(jié)果分析。

3L培養(yǎng)基：SOB培養(yǎng)基，成分為2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl₂+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素，補(bǔ)料加100g/L甘油。

種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250rpm/min搖瓶過(guò)夜。次日取500μl菌液轉(zhuǎn)接于60ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，接種于5L發(fā)酵罐中。

發(fā)酵條件：2％接種量，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8左右時(shí)加1mM IPTG 30℃誘導(dǎo)，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1vvm，2M NaOH維持pH為6.8～7.2。待發(fā)酵培養(yǎng)基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右時(shí)補(bǔ)加甘油，以維持甘油濃度在4g/L的速度進(jìn)行補(bǔ)料，直至甘油補(bǔ)加總量達(dá)到100g/L。

結(jié)果分析：發(fā)酵過(guò)程中每4h取一次樣，10,000r/min離心2min將發(fā)酵液與菌體分離，0.22μm濾膜處理發(fā)酵液，用于進(jìn)行HPLC(高效液相色譜法，美國(guó)伯Bio-Rad伯樂(lè)Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱)檢測(cè)，HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相為5mM H₂SO₄，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器210nm。最終Mad2上罐發(fā)酵己二酸產(chǎn)量為4.34g/L。

實(shí)施例5：BL21(DE3)中乙酰CoA硫解酶(atoB)的敲除。

制備電轉(zhuǎn)BL21(DE3)感受態(tài)：挑取BL21(DE3)的單菌落在LB固體培養(yǎng)基劃線分離，于37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)16h；在劃線平板上挑取單菌落接種至含20mL LB液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)6-8h；取1％的接種量轉(zhuǎn)入含50mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4-0.6；將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50mL離心管中，置于一冰水混合物中驟冷(至少15min)，4℃條件下4000r/min離心10min，棄上清收集菌體；每管加入1ml預(yù)冷到4℃的無(wú)菌超純水，輕微振蕩使菌體懸浮，再加入超純水到10mL，4℃條件下4000r/min離心10min，棄上清收集菌體；用30％甘油清洗菌體，加入1ml冷到4℃的30％的甘油，輕微振蕩使菌體懸浮，再加入30％甘油到10mL，4℃條件下4000r/min離心10min，棄上清收集菌體，甘油重復(fù)洗一次；最后用1ml 30％甘油重懸菌體，進(jìn)行分裝，每管100μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

電轉(zhuǎn)pcas質(zhì)粒(該質(zhì)粒購(gòu)自Addgene)進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)：從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，取1μl純化后的質(zhì)粒于1.5ml的離心管中，將其和0.1CM的電極杯儀器置于冰上預(yù)冷，將100μl解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至此1.5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置10min。打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1KV。將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯中，輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部。將電極杯推入電轉(zhuǎn)儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴后，向電極杯中迅速加入1000μl的SOC液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中。37℃，250rpm復(fù)蘇1小時(shí)。取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物4000r/min離心3min，倒去上清后重新懸浮后涂在有50μg/ml硫酸卡那霉素的平板上，放入30℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。

將轉(zhuǎn)有pcas質(zhì)粒的BL21(DE3)做電轉(zhuǎn)感受態(tài)，但是要在OD₆₀₀＝0.2時(shí)加L-阿拉伯糖，其余操作同上。轉(zhuǎn)化時(shí)需要控制pTarget F質(zhì)粒(該質(zhì)粒購(gòu)自Addgene)與atoB基因上下游同源500bp的摩爾比是1:4，然后一同電轉(zhuǎn)入含有pcas質(zhì)粒的BL21(DE3)感受態(tài)中，其余步驟同上。挑取單菌落于2ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至4-6小時(shí)后取1μl菌液作為pcr模板，進(jìn)行pcr然后瓊脂糖凝膠電泳以驗(yàn)證基因是否敲除成功。在驗(yàn)證敲除成功的重組菌中加入IPTG就可以利用pcas將pTarget F消除掉，消除pTarget F后，37℃消除pcas，得到BL21(DE3)ΔatoB菌株。將pAD-1、pAD-4、pAD-6轉(zhuǎn)入BL21(DE3)ΔatoB制備重組大腸桿菌Mad2ΔatoB。

表2菌落PCR反應(yīng)體系

膠的制作：稱取0.3g瓊脂糖溶于25mL 1×TAE緩沖液中，加熱30-60s使其完全溶化，加入5μL EB，搖勻后倒入已插好梳子的水平膠框中，避免產(chǎn)生氣泡，放置待其凝固。

跑膠：輕輕地拔出梳子，將膠放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液使其沒(méi)過(guò)膠塊，根據(jù)上樣量加入適量的10×Loading Buffer，垂直點(diǎn)入上樣孔中，插好電極后開始跑膠，100V跑30min后結(jié)束，取出膠塊放入凝膠成像儀中進(jìn)行拍照。

實(shí)施例6：Mad2ΔatoB上罐發(fā)酵及結(jié)果分析。

3L培養(yǎng)基：SOB培養(yǎng)基，成分為2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl₂+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素，補(bǔ)料加100g/L甘油。

種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250rpm/min搖瓶過(guò)夜。次日取500μl菌液轉(zhuǎn)接于60ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，接種于5L發(fā)酵罐中。

發(fā)酵條件：2％接種量，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8左右時(shí)加1mM IPTG 30℃誘導(dǎo)，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1vvm，2M NaOH維持pH為6.8～7.2。待發(fā)酵培養(yǎng)基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右時(shí)補(bǔ)加甘油，以維持甘油濃度在4g/L的速度進(jìn)行補(bǔ)料，直至甘油補(bǔ)加總量達(dá)到100g/L。

結(jié)果分析：發(fā)酵過(guò)程中每4h取一次樣，10,000r/min離心2min將發(fā)酵液與菌體分離，0.22μm濾膜處理發(fā)酵液，用于進(jìn)行HPLC(高效液相色譜法，美國(guó)伯Bio-Rad伯樂(lè)Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱)檢測(cè)，HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相為5mM H₂SO₄，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器210nm。Mad2ΔatoB上罐發(fā)酵己二酸產(chǎn)量為25.57g/L。

實(shí)施例7：Mad2ΔatoB搖瓶循環(huán)發(fā)酵及結(jié)果分析。

培養(yǎng)基：SOB培養(yǎng)基，成分為2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl+10mM MgCl₂+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨芐青霉素+50μg/ml鏈霉素。

種子液制備：甘油保藏的菌種于平板上劃線，挑取單菌落接種于盛有50ml的LB液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，37℃、250r/min搖瓶過(guò)夜。

發(fā)酵條件：2％接種量，接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基SOB中，使其初始OD₆₀₀為0.1。37℃、250r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-0.8左右時(shí)加入相應(yīng)的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)1mM IPTG誘導(dǎo)Mad2ΔatoB，改為30℃、250rpm/min培養(yǎng)。培養(yǎng)至72小時(shí)時(shí)停止發(fā)酵，取10ml菌液進(jìn)行4℃、4000r/min離心10min，后用新鮮的50ml培養(yǎng)基重新懸浮菌體，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。每次循環(huán)培養(yǎng)至72小時(shí)均進(jìn)行此操作。

結(jié)果分析：發(fā)酵過(guò)程中每4h取一次樣，10,000r/min離心2min將發(fā)酵液與菌體分離，0.22μm濾膜處理發(fā)酵液，用于進(jìn)行HPLC(高效液相色譜法，美國(guó)伯Bio-Rad伯樂(lè)Aminex HPX-87H有機(jī)酸柱)檢測(cè)，HPLC檢測(cè)中流動(dòng)相為5mM H₂SO₄，柱溫為30℃，紫外檢測(cè)器210nm。

Mad2ΔatoB循環(huán)發(fā)酵己二酸產(chǎn)量為1.22g/L，3.82g/L，3.52g/L，1.29g/L，1.15g/L，1.73g/L，1.84g/L，1.20g/L，1.91g/L，1.23g/L。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種提高大腸桿菌中己二酸產(chǎn)量的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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