本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體提供了一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基以及利用該培養(yǎng)基制備尼可霉素的方法。

背景技術(shù)：

尼可霉素是重要的肽基核苷類(lèi)抗生素，其對(duì)農(nóng)作物、果蔬及一些經(jīng)濟(jì)植物的真菌病害有良好的防治作用，并且對(duì)環(huán)境友好，適宜在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模推廣使用。傳統(tǒng)的制備方法匯總，通常采取誘變篩選優(yōu)良菌株的方式來(lái)提高尼可霉素的產(chǎn)量，但是這種方式，具有不確定因素多，篩選工作大，育種緩慢，難以有效提高尼可霉素產(chǎn)量的缺點(diǎn)。

尼可霉素與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制幾丁質(zhì)合成酶，表現(xiàn)出抗真菌、殺昆蟲(chóng)和殺螨蟲(chóng)等多種生物活性。同時(shí),尼可霉素對(duì)哺乳動(dòng)物、蜜蜂、植物和細(xì)菌等毒性極低，且在自然界中易被降解，而被認(rèn)為是一種理想的農(nóng)用抗生素。最近的研究表明它對(duì)一些危及生命的幾種致病真菌也有明顯的抑制作用，可用于人體深部真菌感染疾病的治療。

目前，現(xiàn)有技術(shù)制備尼可霉素的方法存在產(chǎn)量低、原料消耗較大的問(wèn)題。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種圈卷產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基以及利用該培養(yǎng)基制備尼可霉素的方法。

本發(fā)明所使用的本發(fā)明所使用的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005，已于 2015年2月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.10523，分類(lèi)命名為圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。

圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005菌株，孢子絲鉤狀或圈卷很少成圈環(huán)。孢子球形、橢圓形。

本發(fā)明提供了一種利用圈卷產(chǎn)色鏈霉菌制備尼可霉素的方法，包含以下步驟:

步驟(1)：將保藏編號(hào)為CGMCC No.10523的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005的種子液接種于含有質(zhì)量濃度為0.01％～0.03％的吐溫80的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取尼可霉素。

本發(fā)明適量吐溫80的加入，可以與發(fā)酵培養(yǎng)基的其他組分發(fā)生良好的協(xié)同作用，從而有效提高尼可霉素的產(chǎn)量。

本發(fā)明所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：按質(zhì)量百分比計(jì)，玉米淀粉2.5～3％、大豆餅粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化鈉0.4～0.6％、硫酸銨0.04～0.05％、碳酸鈣0.45～0.5％，消泡劑0.02～0.025％，吐溫800.01％～0.03％，余量為水；調(diào)節(jié)pH為6.0～7.5，優(yōu)選6.8。

所述發(fā)酵培養(yǎng)器皿采用8～10層紗布封口后，放置于120～125℃溫度下滅菌30～40min。

進(jìn)一步地，本發(fā)明優(yōu)選所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：按質(zhì)量百分比計(jì)，玉米淀粉3％、大豆餅粉3％、酵母粉0.2％、氯化鈉0.6％、硫酸銨0.04％、碳酸鈣0.5％，消泡劑0.02％，吐溫800.02％，余量為蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為6.8。本發(fā)明所述消泡劑優(yōu)選為有機(jī)硅類(lèi)消泡劑，更優(yōu)選為聚硅氧烷類(lèi)消泡劑。

本發(fā)明所述步驟(1)中圈卷產(chǎn)色鏈霉菌的種子液接種量為為4～10％(v/v)；

本發(fā)明所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，且振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200～220r/min，發(fā)酵時(shí)間為60～80h，發(fā)酵溫度25～28℃。

作為一個(gè)整體的技術(shù)方案，本發(fā)明提供了更有針對(duì)性的方案，具體如下：

本發(fā)明提供了一種通過(guò)圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005發(fā)酵生產(chǎn)尼可霉素的方法，包含以下步驟：

步驟(1)：將所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌的種子液以4～10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：按質(zhì)量百分比計(jì)，玉米淀粉3％、大豆餅粉3％、酵母粉0.2％、氯化鈉0.6％、硫酸銨0.04％、碳酸鈣0.5％，聚硅氧烷類(lèi)消泡劑0.02％，吐溫800.02％，余量為蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為6.8；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取尼可霉素。

本發(fā)明提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：玉米淀粉2.5～3％、大豆餅粉2～3％、酵母粉0.2～0.3％、氯化鈉0.4～0.6％、硫酸銨0.04～0.05％、碳酸鈣0.45～0.5％，消泡劑0.02～0.025％，吐溫800.01％～0.03％，余量為水。該發(fā)酵培養(yǎng)基可應(yīng)用于尼可霉素生產(chǎn)中。

本發(fā)明所采用的圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005菌株遺傳穩(wěn)定性好，連續(xù)傳代5次后其生產(chǎn)尼可霉素的能力仍保持原來(lái)水平。

本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量吐溫80，優(yōu)化消泡劑的選擇；進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基其他組分的種類(lèi)和用量，以及控制其他培養(yǎng)條件，使得吐溫80、有機(jī)硅類(lèi)消泡劑以及其他組分的協(xié)同作用，有效提高了尼可霉素的產(chǎn)量。本發(fā)明尼可霉素的產(chǎn)量可高達(dá)42600μg/mL，且方案簡(jiǎn)單、成本低廉、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明所述產(chǎn)品皆為市售，濃度皆為質(zhì)量濃度，接種量為體積比。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所使用的保藏編號(hào)為CGMCC No.10523圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)BJX005，已于2015年2月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.10523，分類(lèi)命名為圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。

實(shí)施例中的產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品，其中GP型聚醚類(lèi)消泡劑環(huán)氧乙烷購(gòu)自山東昌邑新興助劑廠(chǎng)；聚硅氧烷消泡劑SXP-101-1，購(gòu)自安徽宿州華潤(rùn)化工有限公司；GPE型聚醚類(lèi)消泡劑，即泡敵，購(gòu)自濟(jì)南澳興化工有限公司，檢測(cè)手段采用煙草赤星病菌作為指示菌的生物檢測(cè)方法。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供了一種通過(guò)發(fā)酵圈卷產(chǎn)色鏈霉菌BJX005制取尼可霉素的方法，包含以下步驟：

步驟(1)：制備所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌的種子液，并將所述種子液以4％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；所述培養(yǎng)基包含以下組分：玉米淀粉3g、大豆餅粉3g、酵母粉0.2g、氯化鈉0.6g、硫酸銨0.04、碳酸鈣0.5g、聚硅氧烷消泡劑SXP-101-10.02g、吐溫800.02g，加水至100g。加熱至80℃溶解，冷卻后利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值6.8；所述發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，且振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220r/min，發(fā)酵時(shí)間為70h，發(fā)酵溫度為28℃；發(fā)酵器皿用8層紗布封口后，121℃滅菌30min；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取尼可霉素。

本實(shí)施例所制得尼可霉素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為42600μg/mL。

實(shí)施例2

本發(fā)明提供了一種通過(guò)發(fā)酵圈卷產(chǎn)色鏈霉菌制取尼可霉素的方法，包含以下步驟：

步驟(1)：制備所述圈卷產(chǎn)色鏈霉菌的種子液，并將所述種子液以10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；所述培養(yǎng)基包含以下組分：玉米淀粉2.5g、大豆餅粉2g、酵母粉0.2g、氯化鈉0.4g、硫酸銨0.05、碳酸鈣0.45g、聚硅氧烷消泡劑DF-805(購(gòu)自于廣東東莞德豐消泡劑廠(chǎng))0.025g、吐溫800.01g，加水至100g。加熱至80℃溶解，冷卻后利用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值7.5；所述發(fā)酵培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，且振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200r/min，發(fā)酵時(shí)間為80h，發(fā)酵溫度為25℃；發(fā)酵器皿用10層紗布封口后，125℃滅菌40min；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取尼可霉素。

本實(shí)施例所制得尼可霉素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為41000μg/mL。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本實(shí)施例所使用消泡劑為GPE型聚醚類(lèi)消泡劑即泡敵，其他條件均相同。

本實(shí)施例所制備得到的尼可霉素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為40300μg/mL。

實(shí)施例4

一種發(fā)酵培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：玉米淀粉2.5％、大豆餅粉2％、酵母粉0.2％、氯化鈉0.4％、硫酸銨0.04％、碳酸鈣0.45％，消泡劑0.02％，吐溫800.01％，余量為水。

實(shí)施例5

一種發(fā)酵培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：玉米淀粉3％、大豆餅粉3％、酵母粉0.3％、氯化鈉0.6％、硫酸銨0.05％、碳酸鈣0.5％，消泡劑0.025％，吐溫800.03％，余量為水。

對(duì)比例1

與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本實(shí)施例發(fā)酵培養(yǎng)基中不含吐溫80，其他條件均相同。

本實(shí)施例所制備得到的尼可霉素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為36700μg/mL

實(shí)驗(yàn)表明：在培養(yǎng)基中添加吐溫80能夠提高尼可霉素的產(chǎn)量。

對(duì)比例2

與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本實(shí)施例發(fā)酵培養(yǎng)基中吐溫80的質(zhì)量含量為0.1％，其他條件均相同。

本實(shí)施例所制備得到的尼可霉素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為40800μg/mL

實(shí)驗(yàn)表明：發(fā)酵培養(yǎng)基中，聚硅氧烷類(lèi)消泡劑的適量添加，能夠有效提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。