本發(fā)明屬于家畜病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兔支氣管敗血波氏桿菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
兔支氣管敗血波氏桿菌病在秋冬季節(jié)和早春多發(fā)；該菌主要通過空氣傳播，經(jīng)呼吸道而感染。幼兔發(fā)病率高，并且有死亡病例。成年兔發(fā)病較少。此菌在群養(yǎng)兔污染為64.4％，散養(yǎng)兔為20％。在自然條件下，多種哺乳動(dòng)物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天氣突變，兔的抵抗力下降，兔舍衛(wèi)生不好，空氣污濁等情況下，均可引起本病發(fā)生。本病的潛伏期7～10d。成年兔表現(xiàn)鼻炎和支氣管炎。有多量的漿液性、黏液性鼻液流出。鼻炎長期不愈，鼻腔流出黏液性或膿性分泌物，打噴嚏，呼吸困難，不食，消瘦等。仔兔多呈急性經(jīng)過，初期剛見鼻炎病狀后，即表現(xiàn)呼吸困難，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病變?yōu)楸茄?、化膿性鼻氣管炎、化膿性支氣管肺炎，個(gè)別的出現(xiàn)敗血病變化。鼻腔、氣管黏膜充血、水腫。鼻腔內(nèi)有漿液性、黏液性或黏液膿性分泌物。在肺門支氣管周圍到肺的邊緣見有支氣管肺炎病灶。病變多見于心葉、尖葉，嚴(yán)重的病例，波及全肺葉。病變部隆起、堅(jiān)硬，呈暗紅色，褐色，進(jìn)而為灰黃色。有些病例肺上有大小不等的膿瘡。嚴(yán)重的占肺部的90％以上。有的肝臟表面有黃豆至蠶豆大的膿瘡。膿瘡破后可見黏稠的奶油狀乳白色的膿汁。還見有心包炎、胸膜炎、胸腔積膿及肌肉膿腫等。
根據(jù)臨床病狀及剖檢變化可初步確診。但必須進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，找出病原才能最后確診。采取呼吸道分泌物或病變組織涂片，革蘭氏染色，鏡檢，能看到革蘭氏陰性、小球桿菌；如用美藍(lán)染色，鏡檢，可見多形態(tài)、兩極染色的小桿菌。血清學(xué)檢查可用平板凝集試驗(yàn)，在潔凈的玻片上，滴加1滴菌液(2500億菌1ml)，再加1滴被檢血清，充分混合，在20～25℃條件下作用2～5min，出現(xiàn)顆粒絮狀物，液體清亮為陽性。以上檢測方法均不能進(jìn)行對(duì)分離到的病原菌直接定性，往往存在同種類分離菌的影響，不能精確確診，易出現(xiàn)誤診。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種兔支氣管敗血波氏桿菌的檢測方法，可以更靈敏、更特異的檢測到兔體是否感染了兔支氣管敗血波氏桿菌，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明首先提供一種用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的試劑盒，包含如下的組分：
1)一抗：用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的單因子血清抗體；
2)二抗：fitc標(biāo)記的山羊抗小鼠igg；
3)陽性對(duì)照樣品：兔支氣管敗血波氏桿菌；
4)pbs洗液:nacl8.0g/l；kcl0.2g/l；na2hpo43.58g/l；kh2po40.24g/l定容至1l。
其中單因子血清抗體，其制備方法如下：將兔支氣管敗血波氏桿菌qdbb01株(rabbitbordetellabronchisepticaqdbb01)，保藏編號(hào)為cctccno:m2016607；進(jìn)行培養(yǎng)，并4000r/min收集菌體，再用ph7.2的tris-hcl溶液重懸菌體，將重懸菌體超聲波破碎，破碎工作1s，間隔時(shí)間3s，全程時(shí)間12min，總共180次；再4000r/min低速離心去除未破碎掉的細(xì)菌菌體和較重的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，取上清液于100000r/min，超速離心20min，去上清；將含外膜蛋白的沉淀用含2％tritonx-100的tris-hcl緩沖液溶解，室溫下孵育1h去除內(nèi)膜蛋白，再進(jìn)行100000r/min超速離心30min，沉淀用緩沖液再重懸，采用能夠截留蛋白分子量在40kda以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白；將純化后的兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白濃度稀釋至50μg/ml，再與弗氏完全佐劑按照體積比1:1乳化制備亞單位疫苗，將此疫苗三次強(qiáng)化免疫balb/c小鼠，每次間隔14d后，用兔支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行攻毒，選擇攻毒后無發(fā)病臨床癥狀的健康小鼠采集血清制備成單因子血清抗體。
上述的試劑盒用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌；操作步驟包括如下：
通過將待檢測的樣品菌進(jìn)行3％tsb培養(yǎng)基培養(yǎng)后，先收集細(xì)胞于離心管中，1500r/min離心收集細(xì)菌，并用pbs重懸洗滌收集菌，然后加入10％多聚甲醛對(duì)重懸菌體固定、1％bsa封閉，再依次加入試劑盒中制備的一抗(兔支氣管敗血波氏桿菌單因子血清)、二抗(fitc標(biāo)記的山羊抗小鼠igg)賦育，以上操作步驟均采用1500r/min離心10min的方法進(jìn)行洗滌多聚甲醛以及未結(jié)合的bsa、一抗和二抗，最后將染色后的細(xì)菌液滴至載玻片上，并用蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察。
為了彌補(bǔ)現(xiàn)今國內(nèi)外兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮培養(yǎng)后檢測方法的不足，本發(fā)明通過構(gòu)建兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮熒光免疫檢測試劑盒，將待檢兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮培養(yǎng)后，采用間接免疫熒光檢測技術(shù)(ifa)進(jìn)行該菌懸浮狀態(tài)下的一抗、二抗熒光抗體染色。該檢測方法能夠具體檢測到兔支氣管敗血波氏桿菌的單個(gè)菌體(出現(xiàn)特異性綠色熒光)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的懸浮熒光免疫試劑盒的構(gòu)建
1.1針對(duì)兔支氣管敗血波氏桿菌單因子血清抗體的制備方法
用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的熒光免疫試劑盒主要成分為鼠抗兔支氣管敗血波氏桿菌外模蛋白的單因子血清抗體，是將青島易邦生物工程有限公司技術(shù)中心分離鑒定保存的兔支氣管敗血波氏桿菌qdbb01株(于2016年11月1日保藏在中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccm2016607)進(jìn)行3％tsb培養(yǎng)，并4000r/min收集菌體，再用ph7.2tris-hcl重懸菌體，將重懸菌體超聲波破碎，工作1s，間隔時(shí)間3s，全程時(shí)間12min，總共180次。4000r/min低速離心去除未破碎掉的細(xì)菌菌體和較重的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，取上清液于100000r/min，超速離心20min，去上清。將含外膜蛋白的沉淀用含2％tritonx-100的tris-hcl緩沖液溶解，室溫下孵育1h去除內(nèi)膜蛋白，再進(jìn)行100000r/min超速離心30min，沉淀用緩沖液再重懸，采用能夠截留蛋白分子量在40kda以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白，分裝，置-20℃保存。采用bradford蛋白含量測定法測出樣品中純化的兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白濃度。將純化后的兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白濃度稀釋至50ug/ml，再與弗氏完全佐劑按照體積比1:1乳化制備亞單位疫苗，將此疫苗三次強(qiáng)化免疫10只balb/c小鼠，每只1ml(25ug/只)；14d后用進(jìn)行第二次免疫，1ml/只；再經(jīng)14d后第三次免疫(方法同第二次)，其中5只未免疫balb/c小鼠作為陰性對(duì)照組。第三次免疫后10d，，用兔支氣管敗血波氏桿菌p13株(進(jìn)行攻毒的兔支氣管敗血波氏桿菌還可以選用其它兔支氣管敗血波氏桿菌)進(jìn)行攻毒，選擇攻毒后發(fā)病臨床癥狀的健康小鼠采集血清制備，析出的血清-20℃保存。其制備出的抗體能夠與兔支氣管敗血波氏桿菌外膜蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。以此單因子血清構(gòu)建的兔支氣管敗血波氏桿菌的熒光免疫檢測試劑盒，可以檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的外膜抗原蛋白，可以檢測臨床上兔支氣管敗血波氏桿菌感染兔病料組織中的抗原，判定是否感染圖支氣管敗血波氏桿菌，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好且檢測速度快，與以往的pcr、革蘭氏染色、平板凝集試驗(yàn)及動(dòng)物回歸試驗(yàn)檢測方法相比，利用該試劑盒通過ifa檢測更方便、更準(zhǔn)確。
實(shí)施例2間接懸浮免疫熒光抗體檢測方法操作步驟
2.1收集懸浮培養(yǎng)的兔支氣管敗血波氏桿菌(qdbb01株)菌體1ml(細(xì)菌總數(shù)為106～107個(gè)/ml)于1.5mlep管中，1500r/min離心10min，棄上清。
2.2加入1mlpbs，溫和上下顛倒，1500r/min，棄上清。
2.3重復(fù)1.2.2步驟，去除培養(yǎng)基中血清的影響；
2.4加入10％多聚甲醛1ml，重懸細(xì)菌菌體，室溫放置10min；期間每隔2min輕彈ep管管底數(shù)次，使細(xì)菌單個(gè)菌體充分接觸固定液；1500r/min離心10min，棄上清。
2.5加入1ml含1％bsa37℃封閉1小時(shí)，以封閉細(xì)菌表面的非特異性抗原；期間每隔2min輕彈ep管管底數(shù)次，使細(xì)菌單個(gè)菌體充分接觸封閉液1500r/min離心10min，棄上清。
2.6將析出的小鼠血清分別用pbs按1:50、1:100、1:200、1:500作4個(gè)稀釋度稀釋至1ml重懸菌體，37℃孵育1小時(shí)。
2.7使用1mlpbs輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次10min(切忌將細(xì)胞沖起)。
2.8加入fitc標(biāo)記的山羊抗小鼠igg熒光二抗(sigma),500μl/孔，37℃避光孵育1小時(shí)。
2.9使用1mlpbs輕輕沖洗細(xì)胞3次，每次10min。
2.10將1.2.9處理的ep管中的菌懸液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片壓成單側(cè)，在倒置顯微鏡下用藍(lán)色激發(fā)光(波長490nm)放大100×～200×觀察。
2.11結(jié)果判定當(dāng)待檢ep管中細(xì)菌菌體出現(xiàn)特異性綠色熒光，陰性對(duì)照管中細(xì)菌菌體未出現(xiàn)特異性綠色熒光時(shí)，試驗(yàn)成立。待檢孔被判為陽性。
2.12結(jié)果單因子血清可與兔支氣管敗血波氏桿菌發(fā)生特異性反應(yīng)，并且因子血清在1：100倍稀釋效果較好。
實(shí)施例3：兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮熒光檢測試方法的敏感性和特異性鑒定
3.1以此單因子血清為基礎(chǔ)構(gòu)建的兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮熒光免疫檢測方法所用試劑盒成份包括：
1)一抗：用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的單因子血清抗體(鼠源)，工作濃度100倍稀釋；
2)二抗：fitc標(biāo)記的山羊抗小鼠igg；
3)陽性對(duì)照樣品：兔支氣管敗血波氏桿菌(p13株)；
4)pbs洗液:nacl8.0g/l；kcl0.2g/l；na2hpo43.58g/l；kh2po40.24g/l定容至1l。
3.2用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮熒光檢測方法的靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)
1)ifa和pcr對(duì)比檢測
為了分析本發(fā)明檢測兔支氣管敗血波氏桿菌抗原的懸浮熒光檢測方法的敏感性和特異性，分別用ifa和pcr方法對(duì)江蘇、河南、天津和山東等地兔場送檢的89份臨床診斷疑似兔支氣管敗血波氏桿菌感染的組織樣品進(jìn)行了對(duì)比檢測。ifa和pcr檢測不同地區(qū)來源組織樣品結(jié)果見下表。
2)重復(fù)性試驗(yàn)
利用此用于檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的懸浮熒光免疫檢測方法對(duì)89份臨床樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)，提取樣品細(xì)菌dna用pcr方法進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證該方法檢測結(jié)果，除了江蘇和天津組織樣品檢測陽性數(shù)：pcr方法比ifa方法均多一例外，其余檢測結(jié)果基本一致。同時(shí)，對(duì)上述江蘇及天津樣品進(jìn)行兩次重復(fù)檢測，ifa檢測結(jié)果與第一次相同，第二、三次pcr檢測結(jié)果與ifa結(jié)果一致，說明pcr檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，從而證明此方法檢測結(jié)果的靈敏性、特異性及可重復(fù)性。重復(fù)檢測結(jié)果見下表。
3)交叉試驗(yàn)
隨機(jī)抽取一批利用檢測兔支氣管敗血波氏桿菌懸浮熒光免疫檢測方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的一些病原毒株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明兔巴氏桿菌、兔魏氏梭菌、兔大腸桿菌和兔沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察均未出現(xiàn)熒光，為陰性結(jié)果，進(jìn)一步說明本發(fā)明檢測兔支氣管敗血波氏桿菌的懸浮熒光免疫檢測方法不會(huì)出現(xiàn)假陰性，具有良好的特異性。
對(duì)本發(fā)明方法的應(yīng)用效果描述如下：
a應(yīng)用此方法不會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。
b敏感性和特異性較高：制備的該單因子血清工作濃度1:100倍稀釋效果較好，且能準(zhǔn)確靈敏的對(duì)實(shí)驗(yàn)室已知的兔支氣管敗血波氏桿菌進(jìn)行檢測診斷。
c臨床應(yīng)用效果較好：利用此方法對(duì)臨床89份疑似兔支氣管敗血波氏桿菌引發(fā)的兔組織等樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)，用靈敏度較高的pcr方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果檢測出20份含有兔支氣管敗血波氏桿菌的感染，此方法檢測結(jié)果與第二、三次pcr方法檢測結(jié)果一致，證明了此方法檢測結(jié)果的靈敏性、特異性及可重復(fù)性較高，臨床應(yīng)用效果較好。