本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達藻藍膽素的基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藻膽蛋白主要存在于紅藻、藍藻、隱藻及少數(shù)甲藻中，由脫輔基蛋白和色基組成，是色素蛋白復(fù)合體，能捕獲高等植物不能利用的藍綠光。同時藻膽蛋白具有多種功效，可作為熒光探針，食品添加劑，保健品和藥品等。根據(jù)藻膽蛋白吸收光譜性質(zhì)的差異，可將其分為四大類即藻紅蛋白、藻紅藍蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白。具有光學(xué)活性的藻膽蛋白主要是由脫輔基藻膽蛋白和藻膽素共價結(jié)合而成。藻膽蛋白具有熒光活性，是因為含有色素—藻膽色素，因此藻膽色素的合成是形成有光學(xué)活性藻膽蛋白非常重要的代謝途徑。

藻膽色素的合成是以氨基乙酰丙酸作為前體物質(zhì)開始的。氨基乙酰丙酸在膽色素原合酶(Porphobilinogen synthase)的作用下合成膽色素原，再利用膽色素原脫氨酶(Hydroxymethyl-bilanesynthase)、尿卟啉原III合酶(Uroporphyrinogen III synthase,UPS)、尿卟啉原III脫羧酶(Uroporphyrinogen III decarboxylase,UDC)、糞卟啉原III氧化酶(Coproporphyrinogen III oxidase,aerobic,COXae)、原卟啉原IX氧化酶(Protoporphyrinogen IX oxidase,aerobic,POXae)數(shù)步反應(yīng)生成原卟啉IX。原卟啉IX在鐵離子螯合酶等酶的作用下生成血紅素。血紅素氧化酶(heme oxygenase)將血紅素氧化，氧化發(fā)生在IXa位點使共軛環(huán)斷裂，生成膽綠素IXa，膽綠素IXa在不同的還原酶作用下產(chǎn)生不同類型的藻膽色素。

目前，對于具熒光活性的藻藍蛋白的異源表達的研究多集中于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)，魚腥藻(Anabaena sp.strain PCC7120)中。而重要經(jīng)濟藍藻-鈍頂節(jié)旋藻的相關(guān)基因還沒有被克隆，其在合成有熒光活性藻藍蛋白中的作用還缺乏研究。節(jié)旋藻(Arthrospira)營養(yǎng)豐富，富含維生素，微量元素，人體必需的8種氨基酸，蛋白含量高達60-70％。是目前公認的唯一一種人體可安全食用并具有藥用價值的經(jīng)濟藻類。其中含有的藻藍蛋白可作為一種天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種表達藻藍膽素的基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。通過本發(fā)明的技術(shù)方案，獲得的重組表達菌株H(314)P(314)BAEF具有較高的重組藻藍蛋白表達量。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種表達藻藍膽素的基因工程菌株H(314)P(314)，其分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.12909。

進一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQ ID No：1序列所示的hoxⅠ基因。

進一步的：所述hoxⅠ基因來源于節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314。

進一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQ ID No：3序列所示的pcyA基因。

進一步的：所述pcyA基因來源于節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314。

進一步的：所述菌株H(314)P(314)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達呈現(xiàn)藍綠色，在580-590nm激發(fā)波長下，在635-645nm處發(fā)射熒光。

本發(fā)明還提供了所述的表達藻藍膽素的基因工程菌株H(314)P(314)的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)克隆節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314的hoxⅠ基因和pcyA基因，并將其連入克隆載體pMD19-T中，分別獲得質(zhì)粒pMD19T-hoxⅠ(314)和pMD19T-pcyA(314)；

(2)將所述質(zhì)粒pMD19T-hoxⅠ(314)用BamHI和SacI進行雙酶切，所述質(zhì)粒pMD19T-pcyA(314)用SacⅠ和SalⅠ進行雙酶切，回收目的片段hoxⅠ(314)基因和pcyA(314)基因，并將二者連接入pET24a(+)表達載體中，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)；

(3)將所述質(zhì)粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)表達菌株，得到重組基因工程菌株H(314)P(314)。

本發(fā)明還提供了所述的表達藻藍膽素的基因工程菌株H(314)P(314)在用于制備藻藍膽素中的應(yīng)用。

進一步的：將含藻藍蛋白α與β亞基基因及色基裂合酶cpcE與cpcF基因的質(zhì)粒載體pACYCDuet-uBAEF轉(zhuǎn)化入所述重組基因工程菌株H(314)P(314)，獲得重組表達菌株H(314)P(314)BAEF。

進一步的：所述重組表達菌株H(314)P(314)BAEF的重組藻藍蛋白表達量達1.08mg/ml以上，獲得的此重組藻藍蛋白在580nm激發(fā)波長下，在640nm處發(fā)射出藻藍蛋白的特征熒光峰，且單位質(zhì)量重組藻藍蛋白發(fā)射出的熒光強度達140000。

本發(fā)明的優(yōu)點和技術(shù)效果是：本發(fā)明首次克隆了節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314的亞鐵血紅素氧化酶hoxI基因及藻藍素鐵氧還蛋白還原酶基因pcyA，將兩者連接進pET24a(+)表達載體中，構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)(hoxI基因與pcyA基因均來自Arthrospira platensis FACHB314)，并將其轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)表達菌株，以得到重組表達菌株H(314)P(314)。從而實現(xiàn)大腸桿菌異源表達藻藍膽素的所有元件都來自節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314。經(jīng)大腸桿菌異源表達的藻藍膽素可進一步與異源表達出的藻藍蛋白的α與β亞基結(jié)合，從而催化有熒光活性的藻藍蛋白的生物合成。所述重組表達菌株H(314)P(314)BAEF的重組藻藍蛋白表達量達1.08mg/ml以上，表達出的藻藍膽素活性非常高。獲得的此重組藻藍蛋白在580nm激發(fā)波長下，在640nm處發(fā)射出藻藍蛋白的特征熒光峰，且單位質(zhì)量重組藻藍蛋白發(fā)射出的熒光強度達140000。

而且，節(jié)旋藻(Arthrospira)是人體可安全食用并具有藥用價值的經(jīng)濟藻類，從節(jié)旋藻中提取的藻藍蛋白可作為一種天然色素應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，具有廣泛的市場應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為重組體系的菌液PCR檢測；其中M1為Trans 2K；M2為Trans 15K；1、2、3、4、5泳道分別對應(yīng)重組體系H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)。

圖2為重組菌株藻藍膽素的表達，其中1，2，3，4，5，6分別對應(yīng)未轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21、重組菌株H(314)、重組菌株P(guān)(314)、重組菌株H(314)P(314)、重組菌株H(6803)P(314)和重組菌株H(314)P(6803)。

圖3為重組菌株的SDS-PAGE電泳，其中0為未轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21；M為廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker；泳道1、2、3、4、5分別為重組菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)和H(314)P(6803)。

圖4為重組菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)及空白菌株BL21的熒光發(fā)射光譜。

圖5為重組菌株藻藍蛋白的表達，其中，1為未轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21；2，3，4，5，6分別為H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF和H(314)P(6803)BAEF。

圖6為重組菌株的SDS-PAGE電泳及重組蛋白的色素鋅電泳；其中圖6a中，0為未轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21；泳道1，2，3，4，5，6分別為重組菌株H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻藍蛋白標準品；

圖6b中，1為H(314)P(314)；2為pACYCDuet-uBAEF(BL21)；3，4，5，6分別為重組表達菌株H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻藍蛋白標準品。

圖7為重組菌株的Western-Blotting檢測，其中0為未轉(zhuǎn)化菌株E.coli BL21；泳道1，2，3，4，5，6分別為重組菌株H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻藍蛋白標準品。

圖8為重組菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF及BL21的熒光發(fā)射光譜。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細的說明。

實施例1：節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因及pcyA基因的克隆

1、節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因的克隆

節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314屬于保健品，具有食品和藥品方面的應(yīng)用價值，購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫淡水藻種庫(FACHB)，也可以選用市售的節(jié)旋藻。

設(shè)計引物hoxI-1和hoxI-2，并在引物hoxI-1和hoxI-2上分別引入BamHI和SacI位點(下劃線為酶切位點)。引物序列分別為：

hoxI-1 5'-GGATCCATGAGTGTTAACCTAGCCACCCA-3'；

hoxI-2 5'-GAGCTCTTAGTTCACCGAGTCAGTAGCG-3'。

以節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314基因組序列為模板進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測割膠回收后，克隆到pMD19-T載體并將其轉(zhuǎn)化克隆菌株E.coli DH5α，用含Amp的平板篩選，經(jīng)菌液PCR和測序鑒定得到陽性克隆質(zhì)粒pMD19T-hoxI(314)。

連接體系如下：

經(jīng)測序分析，所述節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因(如序列表SEQ ID No：1序列所示)可編碼242個氨基酸殘基，編碼產(chǎn)生的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示。

2.節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314中pcyA基因的克隆

根據(jù)節(jié)旋藻PCC8005pcyA基因序列(GenBank號：FO818640.1)設(shè)計引物，在引物pcyA-1和pcyA-2上分別引入SacI和SalI位點(下劃線為酶切位點)。引物序列分別為：

pcyA-1：5'-GAGCTCTGAAATAATTGGGCCGACGCTT-3'；

pcyA-2：5'-GTCGACTCAGTCTTCAGGAGTATCAAATAAAAC-3'。

以節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314基因組序列為模板進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，采用梯度擴增設(shè)置三個梯度55℃，52℃，48℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測割膠回收后，連接到pMD19-T載體并將其轉(zhuǎn)化克隆菌株E.coli DH5α，用含Amp的平板篩選，經(jīng)菌液PCR和測序鑒定得到陽性克隆質(zhì)粒pMD19T-pcyA(314)。

連接體系如下：

經(jīng)測序分析，所述Arthrospira platensis FACHB314中pcyA基因(如序列表SEQ ID No：3序列所示)可編碼247個氨基酸殘基，編碼產(chǎn)生的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：4所示。

實施例2：重組表達菌株H(314)P(314)的建立

將得到的陽性克隆質(zhì)粒所述pMD19T-hox I(314)和pMD19T-pcyA(314)分別用BamHI和SacI及SacI和SalI進行雙酶切，經(jīng)割膠回收目的片段得到hoxI(314)基因及pcyA(314)基因，并將二者連接入pET24a(+)空載體中，連接時先用hoxI(314)基因的酶切位點BamHI和SacI對pET24a(+)空載體進行酶切，從而將hoxI(314)基因先連接進去得到pET24a-hoxI(314)。再用pcyA(314)基因的酶切位點SacI和SalI對pET24a-hoxI(314)進行酶切，從而將pcyA(314)基因也連接入表達載體中，獲得重組表達質(zhì)粒pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)。

將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α中，并用含Kan抗性的平板進行篩選，經(jīng)菌液PCR和測序鑒定得到陽性菌株。在獲得的陽性菌株中將pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)質(zhì)粒提出，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，用含Kan平板篩選，并經(jīng)菌液PCR檢測鑒定得到陽性表達菌株H(314)P(314)，最后進行測序驗證。

為檢驗單獨的hoxI(314)基因及單獨的pcyA(314)基因在藻藍膽素合成中的作用及不同藻種中合成藻藍膽素相關(guān)基因在大腸桿菌內(nèi)異源表達的表達情況，本發(fā)明同時構(gòu)建了表達質(zhì)粒pET24a-hoxI(314)，pET24a-pcyA(314)，pET24a-hoxI(314)-pcyA(6803)(hoxI來自Arthrospira platensis FACHB314，pcyA來自Synechocystis sp.PCC6803)，pET24a-hoxI(6803)-pcyA(314)(hoxI來自Synechocystis sp.PCC6803，pcyA來自Arthrospira platensis FACHB314)并將其一起轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中構(gòu)建重組表達菌株H(314)、P(314)、H(314)P(6803)和H(6803)P(314)并將其與H(314)P(314)一起進行菌液PCR的鑒定。菌液PCR鑒定結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示：1，2泳道顯示條帶大小為700-1000bp左右，與hoxI(314)，pcyA(314)基因大小基本一致，證明重組體系H(314)與P(314)構(gòu)建成功。3，4，5泳道顯示條帶大小為1500bp左右，與連接后的hoxI-pcyA基因片段大小一致，證明重組體系H(314)P(314)，H(6803)P(314)，H(314)P(6803)重組體系構(gòu)建成功。

將獲得的重組表達菌株H(314)P(314)進行菌種保藏，保藏單位的名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。大腸埃希氏菌Escherichia coli的保藏日期：2016年8月26日；保藏編號：CGMCC No.12909。

pMD19T-hoxI(314)的酶切體系如下：

pMD19T-pcyA(314)的酶切體系如下：

pET24a-hoxI(314)連接體系如下：

以此先得到質(zhì)粒pET24a-hoxI(314)，在針對此質(zhì)粒使用pcyA基因的酶切位點對其進行酶切，從而將pcyA基因連入該表達載體中。

pET24a-hoxI(314)的酶切體系如下：

pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)的連接體系如下：

實施例3：重組表達菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE

1、重組菌株的誘導(dǎo)表達：

(1)將構(gòu)建的5個重組表達菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)分別接種到LB液體培養(yǎng)基中(含有抗生素Kan)；同時接種沒有表達載體的空白對照E.coli BL21(DE3)，培養(yǎng)基中不含抗生素，在37℃下過夜培養(yǎng)12-14h；

(2)分別將以上5個重組表達菌株的過夜培養(yǎng)物按1:100的比例接種在100ml(含Kan)LB液體培養(yǎng)基中；空白的大腸桿菌BL21(DE3)的過夜培養(yǎng)物按1:100的比例接種于100ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2-3個小時至OD₆₀₀≈0.6；

(3)37℃下，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至工作濃度為1mmol/L；

(4)37℃誘導(dǎo)2小時后，用分光光度計分別測量三種菌體的OD₆₀₀值，以保證離心后收集的菌量相同；

(5)5個重組體系中各取2ml IPTG誘導(dǎo)后的菌體離心，用400ulPBS懸浮菌體沉淀并加入100ul上樣緩沖液，開水煮5min用以變性重組體系中的蛋白，將處理好的蛋白樣品置于4℃，以用于蛋白電泳檢測。

其他剩余的誘導(dǎo)后的菌體4000rpm/min離心20min，棄上清，收集沉淀如圖2所示，用0.9％的NaCl溶液洗滌菌體沉淀2次。

從圖2收集到的菌體沉淀可初步判斷與陰性對照BL21相比重組菌株H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)均已誘導(dǎo)表達出了藻藍膽素，只是顏色深淺不同，H(314)P(314)>H(6803)P(314)>H(314)P(6803)。菌株H(314)P(314)和H(6803)P(314)呈現(xiàn)出天然藻藍蛋白的藍色，而菌株H(314)P(6803)的顏色偏綠，表明節(jié)旋藻314的鐵氧還蛋白還原酶(PcyA)在重組菌株中具有更好的催化活性，重組表達的藻藍膽素更接近于天然藻藍膽素。其中菌株H(314)P(314)的顏色最深，進一步表明節(jié)旋藻314的亞鐵血紅素氧化酶(HoxI)在重組菌株中具有更好的催化活性或者來自相同物種節(jié)旋藻的HoxI和PcyA間存在協(xié)調(diào)作用，從而具有更強的合成藻藍蛋白的活性。只含hoxI基因的重組菌株，經(jīng)離心所得的綠色沉淀應(yīng)為膽綠素。只含pcyA基因的重組菌株，因大腸桿菌中無膽綠素，故無法進一步形成藻藍膽素，故菌體顏色與空菌株E.coli BL21類似。

2、重組菌株的SDS-PAGE：

樣品的處理：即以上5個重組菌株在誘導(dǎo)表達過程中第5步中的處理方法。

安裝裝置：將玻璃板和電泳槽用蒸餾水沖凈，晾干并將玻璃板固定于制膠器上。

聚丙烯酰胺凝膠的配置：按照下表1配置聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為15％。

表1聚丙烯酰胺凝膠的配置

分離膠注入膠板中(給濃縮膠預(yù)留1cm位置)，用1000ul的移液槍迅速的將濃縮膠加到膠板里，插上梳子，凝膠15分鐘。

上樣：在電泳槽中加入適量Tris-Gly電泳緩沖液，緩慢拔掉梳子，將蛋白樣品加入上樣孔中，每個樣品上樣量為20ul，Marker上樣量為5～8ul；

電泳：將電源接通，使用170V電壓進行電泳，當溴酚藍指示劑到達凝膠底部時，停止電泳，此過程約需1h；

凝膠的處理：用刀片小心將凝膠取下，一塊用于Western Blotting檢測，另一塊放入三氯乙酸溶液中固定30min；

染色：將固定好的凝膠放入考馬斯亮藍溶液中染色，震蕩染色過夜；

脫色：將染色后的凝膠放入脫色液中震蕩脫色，直到背景透明，條帶清晰為止。

重組菌株的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。圖3中箭頭所示蛋白條帶依次為：1：HoxI；2：PcyA；3：HoxI(314)-PcyA(314)；4：HoxI(6803)-PcyA(314)；5：HoxI(314)-PcyA(6803))。重組菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)與陰性對照BL21相比，在29KD出現(xiàn)清晰可見且不同于BL21的條帶，該條帶為HoxI和PcyA，經(jīng)網(wǎng)上在線預(yù)測，PcyA分子量大小為28.1KD，HoxI分子量為27.7KD，因此該條帶應(yīng)為合成藻藍膽素所需的酶HoxI和PcyA。

實施例4：重組表達菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的熒光檢測

將以上洗滌過的菌體沉淀重懸于0.01mol/L的PBS中并進行超聲破碎(超聲5s，停止2.5s，共6min)。離心后取上清進行熒光檢測，掃描速度1200nm/min，狹縫寬度5.0nm，電壓為950V，用580nm波長激發(fā)得到熒光發(fā)射光譜(如圖4)。重組菌株H(314)即膽綠素的熒光發(fā)射峰在637nm左右；重組菌株P(guān)(314)的熒光發(fā)射光譜與BL21類似，主要是與體系內(nèi)無法形成膽綠素進而無法形成藻藍膽素有關(guān)；菌株H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)形成色素主要為藻藍膽素，同時可觀察到菌株H(314)P(314)與H(6803)P(314)相較體系H(314)P(6803)中藻藍膽素的熒光發(fā)射峰更加接近天然藻藍膽素的熒光發(fā)射峰640nm，由此可表明在形成藻藍膽素的過程中，來源于Arthrospira platensis FACHB314的PcyA要優(yōu)于Synechocystis sp.PCC6803的PcyA。

實施例5：藻藍膽素在合成有熒光活性藻藍蛋白中的應(yīng)用

1、重組表達菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的獲得

將質(zhì)粒載體pACYCDuet-uBAEF(含藻藍蛋白α與β亞基基因及色基裂合酶cpcE與cpcF基因)分別轉(zhuǎn)化入重組菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)，用含Kan與Cm的雙抗平板篩選，并經(jīng)菌液PCR和測序檢測鑒定得到重組表達菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF。

2、重組表達菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的誘導(dǎo)表達

誘導(dǎo)表達過程與實施例3中重組表達菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的誘導(dǎo)過程相同。所得的菌體沉淀如圖5所示。從圖5中可以判斷：與空白對照BL21相比，菌株H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF中的具熒光活性的藻藍蛋白均已表達，顏色與單獨只有藻藍膽素表達時不同，且各體系顏色深淺不同，H(314)P(314)BAEF>H(6803)P(314)BAEF>H(314)P(6803)BAEF。由此可進一步斷定hoxI和pcyA基因均來源于Arthrospira platensis FACHB314的重組體系在大腸桿菌中合成和組裝具有熒光活性的藻藍蛋白的協(xié)調(diào)性較來源于Synechocystis sp.PCC6803的要強。菌株H(6803)P(314)BAEF相較于菌株H(314)P(6803)BAEF沉淀顏色更接近于天然藻藍蛋白的藍色，由此表明在形成有熒光活性藻藍蛋白過程中，PcyA的作用很重要，而且節(jié)旋藻FACHB314的PcyA在形成有熒光活性的藻藍蛋白中的活性比集胞藻PCC6803的活性強。。

菌株H(314)與菌株P(guān)(314)中因只含單獨的hoxI和pcyA基因，故確認體系中并未生成具有熒光活性的藻藍蛋白，菌株H(314)中表現(xiàn)出的綠色仍為膽綠素的顏色。

3、重組表達菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的SDS-PAGE電泳，和Western-blotting檢測

SDS-PAGE電泳與實施例3中重組菌株的SDS-PAGE過程相同。所得SDS-PAGE電泳圖譜如圖6a所示，圖6a中箭頭所示條帶均為各體系表達出的藻藍蛋白。

SDS-PAGE結(jié)束后，用Launch sensiAnsys.exe軟件對SDS-PAGE凝膠結(jié)果進行分析，測定藻藍蛋白在表達的總蛋白中所占百分比。重組菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的目標蛋白表達量分析如表2所示。

表2重組菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的目標蛋白表達量分析

重組表達菌株的Western-blotting檢測：

轉(zhuǎn)膜：采用半干式電轉(zhuǎn)儀(120V，25min)；

麗春紅染色：染色時間不宜太長，染后迅速用蒸餾水沖洗；

封閉：將硝酸纖維素膜用封閉液脫脂奶粉進行4℃封閉過夜；

洗膜：封閉完成后倒掉封閉液，用0.02MPBS洗膜5分鐘，兩次；

一抗反應(yīng)：使用兔抗藻藍蛋白多克隆抗體作為一抗，將其用抗體稀釋液稀釋200倍，37℃震蕩孵育2h。反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，使用0.02MPBS洗膜5分鐘，兩次；

二抗反應(yīng)：采用羊抗兔IgG-HRP(H L)作為二抗，用抗體稀釋液稀釋2000倍，37℃震蕩孵育1h。反應(yīng)結(jié)束后，倒掉反應(yīng)液，使用0.02MPBS洗膜5分鐘，四次；

DAB顯色反應(yīng)：將配置的DAB顯色液均勻的淋于硝酸纖維素膜上，避光顯色，約五分鐘后，用蒸餾水將膜沖洗干凈。

所得Western-blotting檢測結(jié)果如圖7所示。圖7中箭頭所示條帶均為各體系表達出的藻藍蛋白。

從電泳結(jié)果可知重組體系H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF與陰性對照BL21相比，在18KD出現(xiàn)清晰可見且不同于BL21的條帶，最后一個泳道出現(xiàn)的條帶為藻藍蛋白標準品，且Western-Blotting檢測結(jié)果顯示在18KD附近呈現(xiàn)出顏色加深的條帶，且條帶位置與最后一列藻藍蛋白標準品位置大體一致。據(jù)文獻報道，藻藍蛋白αβ通常以聚合體存在，分子量在36KD。在SDS-PAGE中，藻藍蛋白的αβ亞基會分開，單獨的一個亞基大小約為18KD。由此判斷重組菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF中均已表達出藻藍蛋白。

4、重組表達菌株H(314)P(314)、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的色素蛋白鋅電泳

電泳過程與SDS-PAGE電泳過程相同。電泳結(jié)束后將聚丙烯酰胺凝膠置于0.02M的ZnSO4溶液中震蕩浸泡10分鐘，浸泡結(jié)束后將膠置于紫外燈下觀察。結(jié)果如圖6b所示，圖中3，4泳道箭頭所示條帶為由重組表達菌株表達出的藻藍蛋白與藻藍膽素結(jié)合后在鋅染后于紫外下觀察獲得的條帶。箭頭6為天然的具熒光活性的藻藍蛋白在鋅染后于紫外下觀察獲得的條帶。

由圖6b可知單獨的藻藍膽素由于分子量太小，不能被聚丙烯酰胺凝膠截留從而無法停留在膠上，故經(jīng)ZnSO4染色后，在紫外下無熒光條帶產(chǎn)生(泳道1)。泳道2是只表達藻藍蛋白的重組表達菌株，因沒有藻藍膽素產(chǎn)生，單獨的藻藍蛋白未與藻藍膽素結(jié)合，故經(jīng)ZnSO4染色后，在紫外光下也無熒光條帶產(chǎn)生。藻藍蛋白標準品為從節(jié)旋藻中提取出的天然藻藍蛋白，其脫輔基藻藍蛋白上結(jié)合著藻藍膽素，故經(jīng)ZnSO₄染色后，在紫外下有熒光條帶產(chǎn)生。而重組表達菌株H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF表達出的藻藍蛋白，經(jīng)ZnSO₄染色后，在紫外下有熒光條帶產(chǎn)生，且熒光條帶產(chǎn)生位置與藻藍蛋白標準品的條帶位置相同，并與經(jīng)SDS-PAGE電泳后的藻藍蛋白的條帶位置相同，大小為18KD左右。表明這兩個重組菌株中均可表達出藻藍蛋白和藻藍膽素，而且表達出的藻藍膽素與藻藍蛋白能夠結(jié)合在一起。重組菌株H(314)P(6803)BAEF表達出的蛋白經(jīng)ZnSO4染色后紫外下并未顯示出明顯條帶，是由于該重組菌株內(nèi)藻藍膽素的表達量過低，或者藻藍膽素的結(jié)構(gòu)不正確，進而無法與藻藍蛋白結(jié)合產(chǎn)生光學(xué)活性。

5、重組表達菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的熒光檢測

超聲破碎過程及熒光檢測過程與實施例4中的檢測過程相同。將超聲破碎后的菌體離心取上清后用580nm波長進行熒光檢測并根據(jù)表2中藻藍蛋白的表達量計算單位質(zhì)量藻藍蛋白的熒光強度，所得熒光光譜如圖8所示。因圖8中重組菌株H(314)P(314)BAEF和H(6803)P(314)BAEF的熒光強度太強，導(dǎo)致無法在同一個圖中顯示出其他體系的熒光發(fā)射光譜，故單獨對重組體系H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF和BL21作圖。

由圖8可知重組體系H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF在天然藻藍蛋白的特征發(fā)射峰640nm處有特征熒光發(fā)射峰，且體系H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF單位質(zhì)量藻藍蛋白發(fā)射出的熒光強度更高，約為140000和120000，遠遠高于其他重組體系，表明重組體系H(314)P(314)BAEF與H(6803)P(314)BAEF均已表達出了具有熒光活性的藻藍蛋白，且PcyA在形成具有熒光活性的藻藍蛋白的過程中具有重要作用，來源于節(jié)旋藻Arthrospira platensis FACHB314中的PcyA的活性遠高于來源于Synechocystis sp.PCC6803的PcyA。重組菌株H(314)P(314)BAEF具有最高的熒光強度，表明hoxI和pcyA基因均來源于Arthrospira platensisFACHB314的重組體系在大腸桿菌中合成和組裝具有熒光活性的藻藍蛋白的效率更高，重組藻藍蛋白的光學(xué)活性更強。

體系H(314)中的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)大幅度紅移，偏離天然藻藍蛋白特征熒光峰，因為體系H(314)中僅含有hoxI基因，因而只能形成膽綠素，膽綠素無法與脫輔基藻藍蛋白正常結(jié)合，從而無法指導(dǎo)具有天然構(gòu)象的藻藍蛋白的正確合成。也進一步證實了天然藻藍蛋白所具有的特征熒光活性主要是由于藻藍膽素與脫輔基藻藍蛋白的正確結(jié)合形成的。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國海洋大學(xué)

<120> 一種表達藻藍膽素的基因工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> Arthrospira platensis

<400> 1

atgagtgtta acctagccac ccagttgcgc gaaggaacca aaaagtccca cactatggcg 60

gaaaatgtgg gttttatcaa atgcttttta agagggacag ttgaaaaaac ctcctatcgg 120

aaattagccg ggaatctcta ctttgtctat acggcaatgg aagaggaaat ggatcgccat 180

aaaaatcacc ccatcctctc gaaactatat tttcccgaat taaaccgcaa gtctgctatt 240

gagcaggatt tattgttcta ctatggtagc aactggcggg aggaagttca gccctccgaa 300

gctgctcagg cttatgtggc tagaattaga gagatttcgg agcgggagcc ggcgttgttg 360

atttctcacc tgtacacccg ttatttggga gacctttcgg gaggacaaat cctgaaaggt 420

attgctcaaa cagcgatgaa tttatccgac ggtcaaggaa ctcaatttta tgagtttaac 480

gaaattcctg atgagaagga atttaagaac aattaccgtc agatcatgaa tgatttgccg 540

attgaccagg aaacagccga tcgcattgtt gaggaagcta atgatgcttt cggaatgaac 600

atgaaaatgt ttaatgaact cgaaggcaat ttggtaaaag cgatcggaat tatgctattt 660

aatagcttaa ctcgccgacg cggtaaaggt tccacagaac tagcgaccgc tactgactcg 720

gtgaactaa 729

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> Arthrospira platensis

<400> 2

Met Ser Val Asn Leu Ala Thr Gln Leu Arg Glu Gly Thr Lys Lys Ser

1 5 10 15

His Thr Met Ala Glu Asn Val Gly Phe Ile Lys Cys Phe Leu Arg Gly

20 25 30

Thr Val Glu Lys Thr Ser Tyr Arg Lys Leu Ala Gly Asn Leu Tyr Phe

35 40 45

Val Tyr Thr Ala Met Glu Glu Glu Met Asp Arg His Lys Asn His Pro

50 55 60

Ile Leu Ser Lys Leu Tyr Phe Pro Glu Leu Asn Arg Lys Ser Ala Ile

65 70 75 80

Glu Gln Asp Leu Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Asn Trp Arg Glu Glu Val

85 90 95

Gln Pro Ser Glu Ala Ala Gln Ala Tyr Val Ala Arg Ile Arg Glu Ile

100 105 110

Ser Glu Arg Glu Pro Ala Leu Leu Ile Ser His Leu Tyr Thr Arg Tyr

115 120 125

Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Ile Leu Lys Gly Ile Ala Gln Thr

130 135 140

Ala Met Asn Leu Ser Asp Gly Gln Gly Thr Gln Phe Tyr Glu Phe Asn

145 150 155 160

Glu Ile Pro Asp Glu Lys Glu Phe Lys Asn Asn Tyr Arg Gln Ile Met

165 170 175

Asn Asp Leu Pro Ile Asp Gln Glu Thr Ala Asp Arg Ile Val Glu Glu

180 185 190

Ala Asn Asp Ala Phe Gly Met Asn Met Lys Met Phe Asn Glu Leu Glu

195 200 205

Gly Asn Leu Val Lys Ala Ile Gly Ile Met Leu Phe Asn Ser Leu Thr

210 215 220

Arg Arg Arg Gly Lys Gly Ser Thr Glu Leu Ala Thr Ala Thr Asp Ser

225 230 235 240

Val Asn

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> Arthrospira platensis

<400> 3

atgcaatcaa ctttcaacca aaattctttg cgggaacaac aacacccgtt aattagccga 60

ttggcgaaca gtattgaacg cctatggggt cagtatttgg atccgcaacc ctatcatctg 120

cctgatgatt taggatacat tgaggggcga ttagaagggg aaaggttgac tattgaaaat 180

cgctgctatc aaactccaca gtttcgtaag atgcacttgg aattggctaa ggtgggtagc 240

ggtttggata ttctccattg tgtgatgttt ccccgcagtt cattcgctct gcctatgttt 300

ggtacggatt tggtgggggg acgtggtaga attggggcgg cgattgtgga tttgtcgccc 360

ctaagtggcg atcgcacttt accggaaaat tatcatcggg ttttgcaaga attaccccaa 420

aatcagtttt ctcaaccccg tgatattccc gcctgggggg atattttttc ggagttttgt 480

ctatttgtgc gtccggctaa cgagcaggag gaggacttgt ttctgagtcg ggttgagact 540

tatatggaac tacactgtca aagtgcgatc gctcaaactc cggtttcccc agaacaacaa 600

attcagatta tcaacgccca acgccactac tgtcaacaac aacagcaaaa cgacaagacc 660

aggcgcgtcc tcgaaaaagc ctttggcgag gaatgggcag aacgctatat gaccacagtt 720

ttatttgata ctcctgaaga ctga 744

<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> Arthrospira platensis

<400> 4

Met Gln Ser Thr Phe Asn Gln Asn Ser Leu Arg Glu Gln Gln His Pro

1 5 10 15

Leu Ile Ser Arg Leu Ala Asn Ser Ile Glu Arg Leu Trp Gly Gln Tyr

20 25 30

Leu Asp Pro Gln Pro Tyr His Leu Pro Asp Asp Leu Gly Tyr Ile Glu

35 40 45

Gly Arg Leu Glu Gly Glu Arg Leu Thr Ile Glu Asn Arg Cys Tyr Gln

50 55 60

Thr Pro Gln Phe Arg Lys Met His Leu Glu Leu Ala Lys Val Gly Ser

65 70 75 80

Gly Leu Asp Ile Leu His Cys Val Met Phe Pro Arg Ser Ser Phe Ala

85 90 95

Leu Pro Met Phe Gly Thr Asp Leu Val Gly Gly Arg Gly Arg Ile Gly

100 105 110

Ala Ala Ile Val Asp Leu Ser Pro Leu Ser Gly Asp Arg Thr Leu Pro

115 120 125

Glu Asn Tyr His Arg Val Leu Gln Glu Leu Pro Gln Asn Gln Phe Ser

130 135 140

Gln Pro Arg Asp Ile Pro Ala Trp Gly Asp Ile Phe Ser Glu Phe Cys

145 150 155 160

Leu Phe Val Arg Pro Ala Asn Glu Gln Glu Glu Asp Leu Phe Leu Ser

165 170 175

Arg Val Glu Thr Tyr Met Glu Leu His Cys Gln Ser Ala Ile Ala Gln

180 185 190

Thr Pro Val Ser Pro Glu Gln Gln Ile Gln Ile Ile Asn Ala Gln Arg

195 200 205

His Tyr Cys Gln Gln Gln Gln Gln Asn Asp Lys Thr Arg Arg Val Leu

210 215 220

Glu Lys Ala Phe Gly Glu Glu Trp Ala Glu Arg Tyr Met Thr Thr Val

225 230 235 240

Leu Phe Asp Thr Pro Glu Asp

245