專利名稱：一種重組藻藍(lán)膽素的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和食品醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說是一種重組藻藍(lán)膽素的制備方法 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藻藍(lán)膽素(Phycocyanobilin，PCB)是存在于紅藻及藍(lán)藻中的一種光合作用輔助 色素。與膽紅素類似，是由4個(gè)吡咯環(huán)通過甲烯基呈直鏈連接，分子量約為588.69g/mol。 它們?cè)隗w內(nèi)與可溶性蛋白質(zhì)結(jié)合稱為藻藍(lán)蛋白(phycocyanin)或別藻藍(lán)蛋白，溶于稀鹽溶 液中。它們?cè)诠夂献饔弥衅鹞占皞鬟f光能的作用。作為膽紅素的衍生物，藻藍(lán)膽素目前已被證明具有抗氧化(Hirata，Τ.， Tanaka, Μ.，Ooike，Μ.，Tsunomura，Τ.，and Sakaguchi, Μ. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina ρlatensis J Appl Phycol 12，2000， 435-439.)、清除羥自由基以及氧自由基、保護(hù)生物膜免受氧化傷害(Hirata，Τ.，Tmiaka， Μ.，Ooike, Μ.，Tsunomura，Τ.，and Sakaguchi, Μ. Radical scavenging activities of phycocyanobilin prepared from a cyanobacterium， Spirulina platensis， Fisheries Sci 1999,65,971-974.) ^ 以及消炎(Bhat，V. B.，and Madyastha，K. Μ. Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis protection against oxidative damage to DNA, Biochem Biophys Res Commun 2001，285，262-266.)等多種功效。最新研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)膽素在細(xì)胞內(nèi)可以被血 紅素還原酶還原而轉(zhuǎn)化為膽紅素，進(jìn)而反饋抑制由氧化損傷引起的NADPH氧化酶的 過量表達(dá)，對(duì)于糖尿病、Gilbert綜合癥等由氧化損傷引起的疾病起到很好的療效 (McCarty，Μ. F.，Barroso-Aranda, J.，and Contreras，F(xiàn).NADPH oxidase mediates glucolipotoxicity-induced beta cell dysfunction—clinical implications， Med Hypotheses 2010，74，596—600 ；McCarty, Μ. F.，Barroso—Aranda，J.，and Contreras， F. Oral phycocyanobilin may diminish the pathogenicity of activated brain microglia in neurodegenerative disorders，Med Hypotheses 2010，74，601-605.) 0 美 國食品醫(yī)藥局(FDA)已批準(zhǔn)將藻藍(lán)蛋白(藻藍(lán)膽素與脫輔基蛋白結(jié)合在一起)用于皮膚 癌、乳腺癌的光敏治療(范曉，海藻化學(xué)研究的展望，海洋科學(xué)，1996，(2) :24)。同時(shí)藻 藍(lán)蛋白用于動(dòng)脈粥樣硬化的光敏治療也已申請(qǐng)專利(US4886831)。同時(shí)藻藍(lán)膽素可以作 為熒光探針及天然色素，在生物檢測(cè)以及功能食品制備方面具有廣闊的用途(Wu，S. H.， McDoweΙΙ,Μ. Τ. ,and Lagarias, J. C. Phycocyanobilin is the natural precursor of the phytochrome chromophore in the green alga Mesotaenium caldariorum, J Biol Chem 1997，272，25700-25705.)。現(xiàn)有的藻藍(lán)膽素的提取技術(shù)主要是從螺旋藻中天然提取。它包括一系列長周期、 高成本、復(fù)雜的工藝過程。主要包括藻細(xì)胞的培養(yǎng)、離心收集，藻體的破碎和藻藍(lán)膽素的抽 提、精制等。其中藻藍(lán)膽素的分離純化方法主要有熱甲醇裂解法和甲醇兩步抽提法。熱甲醇裂解法是利用熱甲醇(70-75°C )緩慢打開藻藍(lán)膽素和脫輔基蛋白之間的硫醚鍵，從而 抽提得到2/3左右的自由藻藍(lán)膽素。但由于螺旋藻中還含有葉綠素和類胡蘿卜素等多種色 素，這種方法往往只能得到純度不高的藻藍(lán)膽素。而甲醇兩步抽提法是先用冷乙醇抽提，去 除大部分的葉綠素和類胡蘿卜素，此時(shí)藻藍(lán)膽素不溶于冷乙醇，然后再用熱甲醇抽提，這樣 可以獲得純度較高(80%左右)的藻藍(lán)膽素(0' Carra, P.，Murphy, R. F.，and Killilea， S. D. The native forms of the phycobilin chromophores of algal biliproteins.A clarification, Biochem J 1980，187，303-309.)。更高純度的藻藍(lán)膽素需要進(jìn)一步的薄層 層析或制備性高效液相色譜純化方可得到。盡管藻藍(lán)膽素在螺旋藻中含量豐富(約占藻體干重的左右)，螺旋藻大規(guī)模 培養(yǎng)技術(shù)也已比較成熟，但由于螺旋藻培養(yǎng)周期較長，生長密度較低，需要占用大面積土 地，且高純度自由藻藍(lán)膽素的天然提取工藝較復(fù)雜(McCarty，M. F. Clinical potential of Spirulina as a source of phycocyanobilin, J Med Food 2007,10,566-570.),導(dǎo)致市 場(chǎng)上高純度藻藍(lán)膽素價(jià)格較高(作為光敏劑高純度藻藍(lán)膽素的價(jià)格約為150-180美元/毫 克)，目前主要依賴于從美國進(jìn)口，尚不適合作為醫(yī)療保健品廣泛應(yīng)用。因此開發(fā)工藝簡(jiǎn)單、 成本低廉的藻藍(lán)膽素規(guī)模制備技術(shù)，將為藻藍(lán)膽素作為高效抗氧化劑和食用色素的廣泛應(yīng) 用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、低成本的重組藻藍(lán)膽素制備方法，及其在抗 氧化藥物及功能食品等方面的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種重組藻藍(lán)膽素制備方法，包括如下步驟由藻類中克隆出血紅素氧化酶基因hoi和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA，將上 述hoi基因和pcyA基因(藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因)克隆到表達(dá)載體上，而后導(dǎo)入大腸桿 菌中進(jìn)行異源表達(dá)，生產(chǎn)重組藻藍(lán)膽素。上述方法中還進(jìn)一步包括以下步驟將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌破碎、氯仿萃取和凝膠 過濾層析，獲得所述的重組藻藍(lán)膽素。所述藻類選自藍(lán)藻(Cyanobacteria)、紅藻(Rhodophyta)、隱藻(Cryptomonas)、 甲藻(Pyrrophyta)或原綠球藻(Prochloroccus marinus)，優(yōu)先選自集胞藻 (Synechocystis)、聚球藻(Synechococcus)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtiii)或 嗜熱藍(lán)藻(Thermosynechococcus elongates)。所述的血紅素氧化酶基因hoi優(yōu)選自Genebank中編號(hào)為sllll84、syc2236_c、 SYNW0171、CHLREDRAFT_152591或tll0365的hoi基因；所述鐵氧還蛋白氧化還原酶基因 pcyA 優(yōu)選自 Genebank 中編號(hào)為 slr0116、syc0325_d、SYNW1084、CHLREDRAFT_156256 或 tll2308 的 pcyA 基因。所述的表達(dá)載體為普通大腸桿菌表達(dá)載體，優(yōu)選自pETDuet-1、pET28a_l、 pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1。所述的大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21。本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述方法制備的重組藻藍(lán)膽素在藥物或食品中的應(yīng)用，優(yōu)選 用于抗氧化藥物或抗氧化食品。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明為運(yùn)用基因工程技術(shù)，將藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)體 系中，以大腸桿菌自身血紅素為底物，通過兩步酶促催化反應(yīng)生產(chǎn)藻藍(lán)膽素。這一生產(chǎn)過程 避免了藻類養(yǎng)殖這一長周期過程，同時(shí)大腸桿菌易于實(shí)現(xiàn)高密度規(guī)模培養(yǎng)，從而大大降低 生產(chǎn)成本。2.與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞容易破碎，且不含有葉綠素、類胡蘿卜素等其他光合 色素，使得下游純化過程變得更加簡(jiǎn)單，容易獲得低成本、高純度的藻藍(lán)膽素。3.本發(fā)明直接表達(dá)藻藍(lán)膽素色基，不含有脫輔基藻藍(lán)蛋白，因此不涉及色基與蛋 白間硫醚鍵的斷裂問題，所以更容易獲得結(jié)構(gòu)單一、性質(zhì)穩(wěn)定的藻藍(lán)膽素，可以建立統(tǒng)一質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)，適于大規(guī)模制備及應(yīng)用。4、本發(fā)明所優(yōu)選的表達(dá)載體 pETDuet-l、pET28a-l、pCDFDuet_l 或 pACYCDuet-Ι 能 夠促使血紅素氧化酶基因hoi和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA在大腸桿菌中高效表達(dá)。5、構(gòu)建的重組載體在大腸桿菌BL21尤其能夠高質(zhì)量表達(dá)，所生產(chǎn)的藻藍(lán)膽素質(zhì) 量不遜色于野生藻類的藻藍(lán)膽素。6、來源于集胞藻、聚球藻、萊茵衣藻或嗜熱藍(lán)藻的血紅素氧化酶基因hoi和鐵氧 還蛋白氧化還原酶基因PcyA在大腸桿菌BL21中表現(xiàn)出高表達(dá)量，更適合在大腸桿菌中表 達(dá)。


圖1為本發(fā)明表達(dá)藻藍(lán)膽素重組載體pETDuet-hol-pcyA的構(gòu)建圖。圖2為本發(fā)明表達(dá)藻藍(lán)膽素重組載體pET28a-h0l-pCyA的構(gòu)建圖。圖3為本發(fā)明表達(dá)藻藍(lán)膽素重組載體pCDFDuet-hol-pcyA的構(gòu)建圖。圖4為本發(fā)明表達(dá)藻藍(lán)膽素重組載體pACY⑶uet-hol-pcyA的構(gòu)建圖。圖5為本發(fā)明藻藍(lán)膽素抗氧化效果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。重組藻藍(lán)膽素的制備方法由藻類中克隆出藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因(血紅素氧 化酶基因hoi和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA)，將hoi和pcyA基因克隆到適當(dāng)表達(dá)載 體上，而后將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，大腸桿菌以自身血紅素為底物， 通過Hol和PcyA兩步酶促催化反應(yīng)，生產(chǎn)重組藻藍(lán)膽素。最終經(jīng)菌體破碎、氯仿萃取和凝 膠過濾層析，獲得藍(lán)色洗脫液，即得以上所述的重組藻藍(lán)膽素。所述重組藻藍(lán)膽素為藍(lán)色化 合物，溶于稀鹽溶液，分子量約為588.69g/mol。該重組藻藍(lán)膽素可以直接用作藥物、試劑、 食品添加劑、保健或功能食品有效成分等。其中所述藻類可為藍(lán)藻、綠藻、紅藻、隱藻、甲藻或原綠球藻，優(yōu)選為集胞藻(所 述hoi和pcyA基因分別為S111184和slr0116)、聚球藻(所述hoi和pcyA基因分別為 syc2236_c 和 syc0325_d)、萊茵衣藻(所述 hoi 和 pcyA 基因分別為 CHLREDRAFT_152591 和 CHLREDRAFT_156256)或嗜熱藍(lán)藻(Thermosynechococcus elongatus，所述 hoi 禾口 pcyA 基 因分別為 tll0365 和 tll2308)。
各種載體選自大腸桿菌(E.coli)的 pETDuet-1、pET28a_l、pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1等載體系列。特別應(yīng)指出的是在下列實(shí)施例中，使用的DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、表達(dá)載體構(gòu)建 和轉(zhuǎn)化、大腸桿菌的培養(yǎng)、溶劑萃取及色譜純化以及抗氧化性分析等技術(shù)除特別說明外均 是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并可在諸如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)、《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F. M.奧斯伯，R.E.金 斯頓等著，馬學(xué)軍等譯，科學(xué)出版社，2005年版)、《溶劑萃取手冊(cè)》(汪家鼎，陳家鏞等著，化 學(xué)工業(yè)出片反社，2001 年片反)、Improved DPPH determination for antioxidant activity spectrophotometric assay, Chemical Papers，2007，60 (3) :214_216.等參考文獻(xiàn)中找到， 在這里整體引用。實(shí)施例1(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BA000022)。根據(jù)Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血紅素氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基 因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合 成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為sllll84和slr0116。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，并插 入到pETDuet-Ι質(zhì)粒(購自Novagen，Germany)的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)處(BamH I和Sac I 酶切位點(diǎn)，下文用相同表述方式表達(dá))，得到重組載體pETDuet-hol。在基因pcyA兩端分別 加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pETDuet-hol的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載 體pETDuet-h0l-pCyA(如附圖1所示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物Pl 5，-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 :5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 組DNA作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試 劑盒(Omega公司)純化。將所得hoi和pcyA基因片段與pETDuet-Ι載體分別用相應(yīng)適當(dāng) 的核酸內(nèi)切酶37°C消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體 3 1混合，在T4DNA連接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用含 100ug/ml氨芐青霉素的LB平板篩選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重 組表達(dá)載體pETDuet-hol-pcyA。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-hol-pcyA， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)(索萊寶科技有限公司，下同)，得到能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下 高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌菌株P(guān)1。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩 選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002 年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)l單菌 落于5mL含lOOug/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素lOOug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)至OD600 = 0 . 5 0. 7時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn) 速200r/min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體用IXPBS緩 沖液(常用生物試驗(yàn)試劑)洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的 IXPBS緩沖液中。超聲波破碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程 中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維 素膜過濾后，加入等體積的氯仿，顛倒均勻lh。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含藻藍(lán)膽 素的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO(二甲基亞砜，下同)重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin 除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare, Sweden)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接 著用PBS緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20 %乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl 和A369，收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例2(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BA000022)。根據(jù)Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血紅素氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基 因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合 成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為sllll84和slr0116。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上Nde I和EcoR V酶切位點(diǎn)，并插 入到pET28a-l質(zhì)粒(Novagen，Germany)的多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pET28a_hol。在 基因pcyA兩端分別加上EcoR V和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pET28a-hol的下游位點(diǎn)處， 得到重組載體pET28a-h0l-pCyA(如附圖2所示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物Pl 5，-TACATATGTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGATATCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTGATATCATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 :5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 組DNA作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試 劑盒(Omega公司)純化。將所得hoi和pcyA基因片段與pET28a_l載體分別用相應(yīng)適當(dāng) 的核酸內(nèi)切酶37°C消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體 3 1混合，在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。利用含 50ug/ml卡那霉素的LB平板篩選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組 表達(dá)載體pET28a-h0l-pCyA。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-hol-pCyA，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得到能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌 菌株P(guān)2。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。
(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)2單菌 落于5mL含50ug/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37°C， 轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含卡那 霉素50ug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 5 0. 7 時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/ min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體1 XPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例3(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BA000022)。根據(jù)Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血紅素氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基 因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合 成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為sllll84和slr0116。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)， 并插入到P⑶FDuet-I質(zhì)粒(Novagen，Germany)的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體 pCDFDuet-hol。在基因pcyA兩端分別加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pCDFDuet-hol 的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體ρ⑶FDUet-hol-pCyA(如附圖3所示)。具體操作方 法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物Pl 5，-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGG TGGCGAG-3，。pcyA 的正向引物 P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTAAGTTTGACC-3，，反向弓I 物 P4 5’-TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因 組DNA作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試 劑盒(Omega公司)純化。將所得hoi和pcyA基因片段與ρ⑶FDuet-Ι載體分別用相應(yīng)適 當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶37°C消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載 體3 :1混合，在T4DNA連接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用含 50ug/ml壯觀霉素的LB平板篩選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組 表達(dá)載體pCDFDuet-hol-pcyA。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pCDFDuet-hol-pcyA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得到能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸 桿菌菌株P(guān)3。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)3單菌 落于5mL含50ug/mL壯觀霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37°C， 轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含壯觀 霉素50ug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 5 0. 7 時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/ min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體IXPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例4(1)集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BA000022)。根據(jù)Genebank中公布的集胞藻 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)血紅素氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基 因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)基因 組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合 成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為sllll84和slr0116。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位 點(diǎn)，并插入到pACY⑶uet-Ι質(zhì)粒(Novagen，Germany)的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組 載體pACY⑶uet-hol。在基因pcyA兩端分別加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到 pACYCDuet-hol的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pACYCDuet-hol-pcyA(如附圖4所 示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物Pl 5，TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3，，反向引物 P2 :5，-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGT GGCGAG-3，。pcyA的正向引物P3 5，-TTCATATGATGGCCGTCACTGATTTMGTTTGACC-3，，反向引物 P4 :5’ -TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAGAC-3’。以 Synechocystis sp. PCC 6803 基因組 DNA作為PCR反應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試劑盒 (Omega公司)純化。將所得hoi和pcyA基因片段與pACY⑶uet-Ι載體分別用相應(yīng)適當(dāng)?shù)暮?酸內(nèi)切酶37°C消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體3 1混合，在T4 DNA連接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。利用含50ug/ ml克拉霉素的LB平板篩選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載 體pACYCDuet-hol-pcyA。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-hol-pcyA，轉(zhuǎn)化 感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得到能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌 菌株P(guān)4。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)4單菌 落于5mL含50ug/mL克拉霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37°C， 轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含克拉 霉素50ug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 5 0. 7 時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/ min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體IXPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例5(1)聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank中免費(fèi)獲得其基因序列(Genebank編號(hào)為AP008231)。根據(jù)Genebank中公布的 聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301血紅素氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化 還原酶基因(PcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以聚球藻Synechococcus elongatus PCC 6301基因組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。 其中藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因ho 1和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為syc2236_c和 syc0325_do(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，并插 入到pETDuet-Ι質(zhì)粒的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pETDuet-hol。在基因pcyA兩 端分別加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pETDuet-hol的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到 重組載體pETDuet-h0l-pCyA(如附圖1所示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物P5 5 ，-TAGGATCCTATGGGCGCGAATCTAGCA-3，，反向引物 P6 :5，-TTGAGCTCTTATTCGGCTGCAGTTG-3’。 pcyA 的正向引物 P7 5，-TTCATATGATGTCCTCCAGCACGCGAG-3，，反向引物 P8 5，-TGCTCGAGTCA ATCACTGGGCAAATC-3，。以 Synechocystis sp. PCC 6301 基因組 DNA 作為 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試劑盒(Omega公司)純化。將所 得hoi和pcyA基因片段與pETDuet-Ι載體分別用相應(yīng)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶37°C消化6h。酶 切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體3 1混合，在T4DNA連接酶作 用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用含氨芐青霉素的LB平板篩選，挑 取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體pETDuet-hol-pcyA。用堿變 性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-hol-pcyA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得到 能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌菌株P(guān)5。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn) 化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂 等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)5單菌 落于5mL含lOOug/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含 氨芐青霉素lOOug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)至OD600 = 0 . 5 0. 7時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn) 速200r/min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體IXPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS緩沖液洗去 雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28t^PA369，收集洗脫峰， 從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例6(1)聚球藻Synechococcus sp. WH 8102全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從Genebank免 費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BX548020)。根據(jù)Genebank中公布的血紅素氧化酶基因(hoi)和 鐵氧還蛋白氧化還原酶基因(PcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以Synechococcus sp. WH 8102基因組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻 藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為SYNW0171和SYNW1084。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，并 插入到pETDuet-Ι質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pETDuet-hol。在基因pcyA兩端 分別加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pETDuet-hol的下游位點(diǎn)處，得到重組載體 pETDuet-h0l-pCyA(如附圖1所示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物P9 5 ，-TAGGATCCTATGTCTGTCGCTCTGGCTAC-3，，反向引物 PlO :5，-TTGAGCTCTCAGGCCGCCGCAG-3’。 pcyA 的正向引物 P11 5，-TTCATATG ATGCAGTCCCCGCCGTC-3，，反向引物 P12:5，-TGCTCGAGTCAACCTGGAGGCAAAGG-3，。以 Synechococcus sp. WH 8102 基因組 DNA 作為 PCR 反應(yīng)擴(kuò)增模 板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試劑盒(Omega公司)純化。 將所得hoi和pcyA基因片段與pETDuet-Ι載體分別用相應(yīng)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶37°C消化6h。 酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體3 1混合，在T4DNA連接酶 作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用氨芐青霉素的LB平板篩選，挑 取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體pETDuet-hol-pcyA。用堿變 性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-hol-pcyA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得到 能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌菌株P(guān)6。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn) 化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培堂 等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)6單 菌落于5mL含50ug/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含 氨芐青霉素50ug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)至OD600 = 0 . 5 0. 7時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn) 速200r/min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體IXPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例7(1)嗜熱藍(lán)藻Thermosynechococcus elongatus BP-1全基因組已經(jīng)測(cè)序完成， 可從Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為BA000039)。根據(jù)Genebank中公布的血紅素 氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以 Thermosynechococcus elongatus BP-1基因組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽 素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編 號(hào)分別為tll0365和tll2308。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，并插 入到pETDuet-Ι質(zhì)粒的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pETDuet-hol。在基因pcyA兩 端分別加上Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pETDuet-hol的另一個(gè)多克隆位點(diǎn)處，得到 重組載體pETDuet-h0l-pCyA(如附圖1所示)。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物P13 5，-TAGGATCCTATGACAACGTCTCTAGC-3’,反向引物 P14 :5，-TTGAGCTCTTAGTCGGCGGTGG-3’。 pcyA 的正向引物 P15 :5，-TTCATATGATGTCTTTGCGTCAACAC-3，，反向引物 P16 :5，-TGCTCGAG CTACACCGGGGGGACAT-3，。以 Thermosynechococcus elongatus BP-1 基因組 DNA 作為 PCR 反 應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試劑盒(Omega公司) 純化。將所得hoi和pcyA基因片段與pETDuet-1載體分別用相應(yīng)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶37°C消 化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體3 1混合，在T4DNA連 接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用含氨芐青霉素的LB平板篩 選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體pETDuet-hol-pcyA。用 堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-hol-pcyA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)， 得到能在1~7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌菌株P(guān)7。上述質(zhì)粒提取、連接、 轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培 堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)7單菌 落于5mL含lOOug/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度 37°C，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含 氨芐青霉素lOOug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)至OD600 = 0 . 5 0. 7時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-th iogalactopyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn) 速200r/min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體IXPBS洗緩 沖液滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例8(1)萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii全基因組已經(jīng)測(cè)序完成，可從 Genebank免費(fèi)獲得(Genebank編號(hào)為ABCN00000000)。根據(jù)Genebank中公布的血紅素 氧化酶基因(hoi)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因(pcyA)的基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，以 Chlamydomonas reinhardtii基因組DNA為模板，采用基因工程方法，克隆藻藍(lán)膽素合成關(guān) 鍵酶基因hoi和pcyA。藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因hoi和pcyA在Genebank中的編號(hào)分別為 CHLREDRAFT_152591和 CHLREDRAFT_156256。(2)應(yīng)用基因工程方法，在hoi基因兩端分別加上Nde I和EcoR V酶切位點(diǎn)，并插 入到pET28a_l質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處，得到重組載體pET28a-hol。在基因pcyA兩端分別加 上EcoR V和Xho I酶切位點(diǎn)，并克隆到pET28a-hol的下游位點(diǎn)處(如附圖2所示)，得到重組載體pET28a-h0l-pcyA。具體操作方法如下根據(jù)Genebank中所公布的hoi和pcyA基因序列設(shè)計(jì)引物。hoi的正向引物P17 5，-TACATATGTATGTCGGATGCA-3’,反向引物 P18 :5，-TTGATATCCGTGTGCGGCAAAGCAGCA-3’。 pcyA 的正向引物 P19 5，-TTGATATCATGCGCTGCTGAGGCGCATT-3，，反向引物 P20:5，-TGCTCGAG TGCCGACAGCGGAGCTAA-3，。以萊茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtii 基因組 DNA 作為 PCR 反 應(yīng)擴(kuò)增模板。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle pure試劑盒(Omega公司) 純化。將所得hoi和pcyA基因片段與pET28a-l載體分別用相應(yīng)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶37°C消 化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，基因片段與載體3 1混合，在T4DNA 連接酶作用下16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。利用含卡那霉素的LB平板篩 選，挑取陽性克隆，利用PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體pET28a-h0l-pCyA。用 堿變性法提取出構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-h0l-pCyA，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，得 到能在T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下高效表達(dá)活性藻藍(lán)膽素的大腸桿菌菌株P(guān)8。上述質(zhì)粒提取、連接、 轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克等著，黃培 堂等譯，科學(xué)出版社，2002年第三版)介紹的方法。(3)從LB固體(含1. 5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株P(guān)8單菌 落于5mL含50ug/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37°C， 轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1 100的比例接種于IL的TB培養(yǎng)基(含卡那 霉素50ug/mL)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37°C、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至 OD600 = 0 . 5 0. 7 時(shí)加入異丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)至終濃度為0. 5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。加入誘導(dǎo)劑后，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/ min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后停止。將收獲的菌液在10，OOOg條件下離心lOmin，棄上清液。收集的菌體1 XPBS緩沖 液洗滌2次后，將菌體重懸于相當(dāng)于原培養(yǎng)物1/50體積預(yù)冷的IXPBS緩沖液中。超聲波破 碎細(xì)胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計(jì)30min，破碎過程中保持細(xì)胞低溫(0°C )。破 碎后于4°C以12，OOOg離心30min，上清液用0. 45 μ m硝酸纖維素膜過濾后，加入等體積的 氯仿，顛倒均勻讓。在IOOOOg離心30min，小心吸取富含PCB的藍(lán)色沉淀。將沉淀用DMSO 重新溶解。不溶物經(jīng)IOOOOg離心IOmin除去。將上述處理獲得的藍(lán)色溶液，上樣到預(yù)先用PBS緩沖液平衡過的Desalting column (GE healthcare)，上樣體積不超過柱體積的1/3，流速為2mL/min ；然后接著用PBS 緩沖液洗去雜蛋白，最后藻藍(lán)膽素用20%乙醇溶液洗脫下來。洗脫時(shí)同時(shí)監(jiān)測(cè)A28tl和A369， 收集洗脫峰，從而得到純度較高的藻藍(lán)膽素。實(shí)施例9藻藍(lán)膽素的抗氧化作用^tM DPPH 自 ^Sif ^fe (Hirata, T. ，Tanaka, M. ，Ooike, M. ，Tsunomura, T. ，and Sakaguchi, Μ. Antioxidant activities of phycocyanobilin prepared from Spirulina platensis J Appl Phycol 12，2000，435-439.注明參考文獻(xiàn))。測(cè)定方法如下取 100 μ L 的200 μ M DPPH乙醇溶液(各組成成分如表1-1所示)和100 μ L的受測(cè)液㈧于96孔板 中，混勻，室溫下放置30min后，在517nm處測(cè)吸光度，同時(shí)測(cè)定100 μ L DPPH溶液+100 μ L 無水乙醇混合液⑶和100 μ L受測(cè)液+100 μ L無水乙醇混合液(C)在517nm下的吸光度。 按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率DPPH清除率=[I-(A-C)/B] X 100%。
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此處受測(cè)液為上述純化后的藻藍(lán)膽素溶液。我們分別以不同濃度的PCB溶液作為 受試液，混合液A組成如下表1-1所示，測(cè)定藻藍(lán)膽素抗氧化效果與濃度之間的關(guān)系。表1-1藻藍(lán)膽素抗氧化效果測(cè)定體系
權(quán)利要求
一種重組藻藍(lán)膽素制備方法，其特征在于包括如下步驟由藻類中克隆出血紅素氧化酶基因ho1和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA，將上述ho1基因和pcyA基因克隆到表達(dá)載體上，而后導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，生產(chǎn)重組藻藍(lán)膽素。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中還進(jìn)一步包括以下步驟將轉(zhuǎn)化 后的大腸桿菌破碎、氯仿萃取和凝膠過濾層析，獲得所述的重組藻藍(lán)膽素。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述藻類選自藍(lán)藻、紅藻、隱藻、甲藻或原綠 球藻。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述藻類選自集胞藻、聚球藻、萊茵衣藻或嗜 熱藍(lán)藻(Thermosynechococcus elongates)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的血紅素氧化酶基因hoi選自Genebank 中編號(hào)為 sllll84、syc2236_c、SYNW0171、CHLREDRAFT_152591 或 tll0365 的 hoi 基因; 所述鐵氧還蛋白氧化還原酶基因pcyA優(yōu)選自Genebank中編號(hào)為slr0116、syc0325_d、 SYNW1084、CHLREDRAFT_156256 或 tl 12308 的 pcyA 基因。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)載體選自pETDuet-1、 pET28a-l、pCDFDuet-1 或 pACYCDuet-1。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21。
8.權(quán)利要求1-7任一所述方法制備的重組藻藍(lán)膽素在藥物或食品中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于用于抗氧化藥物或抗氧化食品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組藻藍(lán)膽素的制備方法，具體地說是一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組藻藍(lán)膽素的方法。具體步驟包括由藻類中克隆出藻藍(lán)膽素合成關(guān)鍵酶基因(ho1和pcyA)，將關(guān)鍵酶基因克隆到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上，而后將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)體系中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)酶促催化反應(yīng)，合成重組藻藍(lán)膽素。最后經(jīng)萃取、層析等純化步驟，即得重組藻藍(lán)膽素。本發(fā)明所得重組藻藍(lán)膽素具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，可用于治療由氧化損傷所引起的多種疾病，同時(shí)還可以作為添加劑應(yīng)用于功能食品。
文檔編號(hào)C12P17/16GK101948887SQ20101026415
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者葛保勝, 黃方 申請(qǐng)人:中國石油大學(xué)(華東)