專利名稱：基于過氧化氫的井岡霉素優(yōu)化發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程與技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于過氧化氫的井 岡霉素優(yōu)化發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
在1970年日本武田株式會社農(nóng)藥研發(fā)部門的Iwasa等人通過篩選對瘟枯病病原 菌絲核菌的抑制作用獲得了能夠產(chǎn)生抗水稻紋枯病代謝物的鏈霉菌菌株，經(jīng)鑒定為吸水 Ι β^ τβ^ Ψ (Streptomyces hygroscopicus var. Iimoneus T—7545) 。ι^Ι^ Ι 了有效霉素的Α，B組分，并且較為系統(tǒng)的研究了該菌株的生長特性，并初步探索了生產(chǎn)抗 生素的條件。我國上海農(nóng)藥所在1973年在井R山地區(qū)篩選到吸水鏈霉菌的一個亞種，研 究表明該菌能夠產(chǎn)生一種與有效霉素理化性質(zhì)類似的新型抗生素，取名吸水鏈霉菌井岡 變種，并于1975年成功的開發(fā)了農(nóng)藥制劑，我國獨立研發(fā)的這種抗生素被稱為井網(wǎng)霉素 (Jinggangmycin)。隨后的研究證明井網(wǎng)霉素與有效霉素具有相同的組分和化學性質(zhì)。有效霉素并非一個單一組分，1988年報道了有效霉素Α，B, C，D，Ε，F(xiàn)等組分的結(jié) 構(gòu)，隨后又報道了 G和H，他們都是在相同的骨架結(jié)構(gòu)上進行的一系列衍生，其中A組分的抗 菌活性最強，Α，B兩個組分占全部同系物的79%以上。井R霉素自發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外對井R霉素的菌種選育，培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)酵條件調(diào) 控，分離純化以及制劑研究等方面都做了大量的卓有成效的研究。隨后經(jīng)過20多年的不斷 選育和優(yōu)化，工業(yè)產(chǎn)量不斷提高。通過菌種選育可以大幅度的提高抗生素的產(chǎn)量，井R霉素 產(chǎn)生菌同樣也表現(xiàn)出了巨大的增產(chǎn)潛力。從1973年產(chǎn)有效霉素出發(fā)菌的數(shù)百單位的產(chǎn)量， 經(jīng)過一年的篩選便達到了 1萬個單位。30年來通過各種方法不斷進行的選育，目前的有效 霉素高產(chǎn)菌株發(fā)酵穩(wěn)定在2萬單位效價左右。發(fā)酵培養(yǎng)基也是影響抗生物生產(chǎn)的重要因 素，在國內(nèi)利用吸水鏈霉菌井網(wǎng)變種生產(chǎn)有效霉素的研究與實踐中，科研人員逐步探索出 了一系列經(jīng)過優(yōu)化的高產(chǎn)培養(yǎng)基。發(fā)酵溫度會直接或間接影響培養(yǎng)細胞的生理生化，從而 最終影響發(fā)酵目標產(chǎn)物的生產(chǎn)量。我們研究發(fā)現(xiàn)在高溫發(fā)酵條件下會在發(fā)酵前期帶來快速 的蛋白合成，快速的糖消耗，快速的PH上升，而這三者恰好與最快速的有效霉素產(chǎn)生階段 相互重合。這說明高溫發(fā)酵對細胞的整個代謝造成了全局性的影響，其中包括對有效霉素 合成的巨大提高。細胞在收到氧化壓力刺激下，會產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧可作為信號分子進一 步激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)了細胞的多個過程。在植物細胞中已報道通過各種方法 刺激活性氧的產(chǎn)生，活性氧作為信號分子促進了代謝產(chǎn)物的大量合成。微生物細胞也可通 過以下壓力相應(yīng)的sigma因子調(diào)節(jié)相應(yīng)的基因表達，從而促進次級代謝產(chǎn)物的合成。而在 氧化壓力下，細胞還可以改變其代謝流的流向，使代謝流由糖酵解途徑流向戊糖磷酸途徑。 而井R霉素合成的前體7-磷酸景天庚酮糖正是戊糖磷酸途徑中的中間代謝物。因此，我們 通過外源添加過氧化氫策略的優(yōu)化提高了井R霉素的產(chǎn)量。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，在野油菜黃單孢菌中次氯酸的添加誘導了活性氧的產(chǎn)生對黃原膠的產(chǎn)量起到了促進作用，黃原膠產(chǎn)率有210%的提高，總產(chǎn)量也有20%以上 的提高。目前該技術(shù)尚未見其應(yīng)用到井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程。吸水鏈霉菌5008是一株有 潛力的井R霉素生產(chǎn)菌株，但目前其產(chǎn)量還較低，發(fā)酵周期較長。經(jīng)過42攝氏度的高溫發(fā) 酵，雖然其產(chǎn)量有一定提高，但高溫必然帶來大的能量消耗。如何在較低溫度下進一步提高 井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量以及縮短其發(fā)酵周期是一個亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā) 酵方法，通過過氧化氫添加時間和濃度的優(yōu)化，使井R霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高40%左右，同時發(fā) 酵周期也縮短一天，提高了設(shè)備利用率，降低了能耗。此方法應(yīng)用到調(diào)節(jié)基因突變的菌株 中，也可提高突變株的井R霉素產(chǎn)量。本發(fā)明為提高井R霉素產(chǎn)量提供了一種簡便有效的 方法，為在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明通過在吸水鏈霉菌井R變種孢子的發(fā) 酵培養(yǎng)階段滴加過氧化氫溶液實現(xiàn)產(chǎn)量優(yōu)化。所述的吸水鏈霉菌井R變種孢子是指取吸水鏈霉菌井R變種孢子的懸液劃線平 板在37攝氏度環(huán)境下培養(yǎng)5天；所述的孢子懸液為零下20攝氏度保存的吸水鏈霉菌井R變種孢子懸液所述的發(fā)酵培養(yǎng)階段是指將吸水鏈霉菌井R變種孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中并在 30攝氏度、220轉(zhuǎn)速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24小時后發(fā)酵培養(yǎng)5天；所述的接種是指以種子液發(fā)酵培養(yǎng)液為1 10 (ν/ν)的比例接種培養(yǎng)，所述的滴加過氧化氫溶液是指將質(zhì)量百分比為30%的過氧化氫稀釋到ImM并過 濾除菌后在發(fā)酵培養(yǎng)過程的8-24小時時間段內(nèi)滴加至濃度達到50微摩爾/升。經(jīng)上述方法優(yōu)化發(fā)酵得到的井R霉素產(chǎn)量提高達30%以上，并且井R霉素的最高 濃度提前到了第四天，與對照組相比提前了一天。


圖1為過氧化氫添加時間對井岡霉素產(chǎn)量的影響示意圖。圖2為過氧化氫添加濃度對井R霉素產(chǎn)量的影響示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1實驗材料采用的菌種吸水鏈霉菌井岡變種(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis5008)(菌種保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號 CGMCC4. 1026)實驗步驟
(1)菌種活化與平板培養(yǎng)取凍存的甘油孢子懸液用接種環(huán)在黃豆餅粉甘露醇固體 培養(yǎng)基平板上劃線，接種后37°C活化5天，待孢子鋪滿整個平板后備用。培養(yǎng)基配方為每升 培養(yǎng)基中含黃豆餅粉20g、甘露醇20g以及瓊脂粉20g。(2)種子培養(yǎng)將活化后的菌種用接種環(huán)挑出一環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，30°C，220rpm培養(yǎng)24小 時。種子培養(yǎng)成份為玉米粉3%、黃豆餅粉1. 1%、酵母粉0. 5%、氯化鈉0. 2%、磷酸二氫鉀 0. 08%，裝液量 50mL。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將30°C培養(yǎng)24小時的種子取5mL接種到裝有50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的搖 瓶中，于37°C培養(yǎng)220rpm培養(yǎng)5天。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米粉9%、黃豆餅粉4%、酵母粉 1%、氯化鈉0. 1%、磷酸二氫鉀0. 1%。在培養(yǎng)基配制前將不銹鋼彈簧卷曲呈環(huán)狀，置于搖 瓶底部。(4)過氧化氫添加時間的優(yōu)化將30%的過氧化氫稀釋到ImM，過濾除菌。分別在 發(fā)酵0，8和24小時添加1. 25mL到發(fā)酵搖瓶中使其終濃度為50微摩爾。(5)樣品處理及檢測方法將取好的ImL發(fā)酵液SOOOrpm離心5分鐘，上清液用于 殘?zhí)呛途甊霉素產(chǎn)量的分析，殘?zhí)怯脻饬蛩醎苯酚法測定，井R霉素產(chǎn)量用HPLC方法測定， 取0. 5mL樣品加入ImL氯仿充分振蕩使蛋白沉淀，12000rpm離心5分鐘，吸取上層水相，稀 釋5倍，用一次性濾膜過濾后用C18反相柱檢測，測定條件為流動相為0. 005摩爾的pH7. 0 的磷酸鹽緩沖液與甲醇比例98. 5 1. 5，流速lml/min，檢測波長210nm。(6)結(jié)果表明，不同時間添加過氧化氫后井R霉素產(chǎn)量均有提高，當在第8h添加 時效果最好，與對照相比有35%左右的提高。實施例2采用的菌種同實施例1菌種活化及種子培養(yǎng)同實施例1發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1過氧化氫添加時間的優(yōu)化將30%的過氧化氫分別稀釋到0. 4mM, ImM, 2mM,過濾 除菌。分別加1. 25mL到發(fā)酵8小時后的50mL的搖瓶中，使其終濃度為10、25以及50 μ Μ。樣品處理及檢測方法同實施例1結(jié)果表明當不同濃的過氧化氫添加后井R霉素產(chǎn)量與對照相比均有較大提高，當 過氧化氫添加濃度為25 μ M時效果最好井R霉素產(chǎn)量有37%左右的提高。實施例3采用的菌種吸水鏈霉菌井岡變種(Sti^ptomyces hygroscopicus var jingganggensis 5008)及其調(diào)節(jié)基因valPQ缺失及回補菌株。valPQ是井岡霉素合成基因 簇中的調(diào)節(jié)基因，當它缺失后井R霉素產(chǎn)量與對照相比會有所提高。本發(fā)明通過在該突變 株中添加過氧化氫，以期望進一步提高井R霉素的產(chǎn)量。菌種活化及種子培養(yǎng)同實施例1發(fā)酵培養(yǎng)同實施例1過氧化氫的添加將30%的過氧化氫稀釋到ImM，過濾除菌。在發(fā)酵8小時分別添 加1. 25mL到吸水鏈霉菌井R變種野生菌株及valPQ缺失突變及回補菌株中，使其終濃度為25微摩爾。樣品處理及檢測方法同實施例1 (結(jié)果見表1)。結(jié)果如表1所示在野生型菌株中井網(wǎng)霉素產(chǎn)量有近40%的提高，在valPQ缺失 突變株中井R霉素產(chǎn)量又會有21%的提高。表1 在吸水鏈霉菌井R變種5008野生型及valPQ缺失突變及回補突變菌株中添
加過氧化氫對井R霉素合成的影響。
權(quán)利要求
一種基于過氧化氫的井岡霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征在于，通過在吸水鏈霉菌井岡變種孢子的發(fā)酵培養(yǎng)階段滴加過氧化氫溶液實現(xiàn)產(chǎn)量優(yōu)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征是，所述的 吸水鏈霉菌井R變種孢子是指取吸水鏈霉菌井R變種孢子的懸液劃線平板在37攝氏度 環(huán)境下培養(yǎng)5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征是，所述的 孢子懸液為零下20攝氏度保存的吸水鏈霉菌井R變種孢子懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征是，所述的 發(fā)酵培養(yǎng)階段是指將吸水鏈霉菌井R變種孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中并在30攝氏度、220 轉(zhuǎn)速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24小時后發(fā)酵培養(yǎng)5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征是，所述的 接種是指以種子液發(fā)酵培養(yǎng)液為1 ο (ν/ν)的比例接種培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于過氧化氫的井R霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，其特征是，所述的 滴加過氧化氫溶液是指將質(zhì)量百分比為30%的過氧化氫稀釋到ImM并過濾除菌后在發(fā)酵 培養(yǎng)過程的8-24小時時間段內(nèi)滴加至濃度達到50微摩爾/升。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的基于過氧化氫的井岡霉素優(yōu)化發(fā)酵方法，通過在吸水鏈霉菌井岡變種孢子的發(fā)酵培養(yǎng)階段滴加過氧化氫溶液實現(xiàn)產(chǎn)量優(yōu)化。本發(fā)明通過過氧化氫添加時間和濃度的優(yōu)化使井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量提高40％左右，同時發(fā)酵周期也縮短一天，提高了設(shè)備利用率，降低了能耗。
文檔編號C12P19/46GK101914600SQ201010264100
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者白林泉, 鄧子新, 鐘建江, 魏振華 申請人:上海交通大學