專利名稱：藤霉素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及藥理學(xué)活性免疫抑制劑和抗微生物三環(huán)類大環(huán)內(nèi)酯，特別是回收和純化藤霉素(tacrolimus)(I)的方法。
發(fā)明背景藤霉素(I)即(17-烯丙基-1，14-二羥基-12-[2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮雜三環(huán)-[22.3.1.04，9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮)是一種由鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的三環(huán)大環(huán)內(nèi)酯，其用于治療移植物排斥危機(jī)、自身免疫疾病、感染性疾病等。
EP 0184162公開了通過發(fā)酵和化學(xué)合成制備藤霉素及其衍生物的方法。具體而言，除了藤霉素外，用鏈霉菌屬(Streptomyces sp)發(fā)酵還產(chǎn)生17-乙基衍生物(II)即(17-乙基-1，14-二羥基-12-[2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮雜三環(huán)-[22.3.1.04.9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮)，通常稱為FK520
以及17-丙基衍生物(III)即(17-丙基-1，14-二羥基-12-[2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮雜三環(huán)-[22.3.1.04.9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮) 除了藤霉素及其副產(chǎn)物的化學(xué)物理特征外，EP 0184162還公開了其萃取、純化和回收方法。具體而言，從發(fā)酵培養(yǎng)液回收產(chǎn)物借助已知萃取技術(shù)實(shí)現(xiàn)，如使用常規(guī)溶劑從發(fā)酵培養(yǎng)液或培養(yǎng)基(mycelium)提取活性物質(zhì)；用離子交換陰離子和陽離子樹脂和非離子吸附樹脂進(jìn)行吸附/洗脫；在常規(guī)色譜載體如硅膠、氧化鋁和纖維素上進(jìn)行純化；用活性炭脫色、結(jié)晶和重結(jié)晶。
根據(jù)EP 0184162，從發(fā)酵培養(yǎng)液萃取和回收藤霉素及其副產(chǎn)物如下進(jìn)行-用溶劑(如丙酮和甲醇)從培養(yǎng)基和/或發(fā)酵培養(yǎng)液中提取；-通過非離子吸附樹脂(特別是HP-20)純化；
-將經(jīng)純化的溶液蒸發(fā)為油；-通過硅膠純化(特別是來自Fuji Devison Co.的12級硅膠)；重復(fù)兩或三次以獲得粉末；-通過制備型HPLC純化，以分離上述雜質(zhì)。
使用非離子吸附樹脂的純化步驟以及使用硅膠的那些純化步驟可除去發(fā)酵培養(yǎng)液中含有的絕大部分化合物(即由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)、無機(jī)鹽和自原料衍生的物質(zhì))，其中雜質(zhì)(II)和(III)通過制備型HPLC除去，這在工業(yè)規(guī)模上的產(chǎn)率和應(yīng)用性的確較差。
US 6492513教導(dǎo)了通過用銀鹽(特別是硝酸銀)預(yù)處理的離子交換陽離子樹脂凈化藤霉素的雜質(zhì)(II)和(III)。使用銀鹽分離具有相同碳原子數(shù)的不飽和脂肪酸的順-反異構(gòu)體由文獻(xiàn)中已知(J.Chromatography，149(1978)417)。銀鹽與不飽和化合物形成π-絡(luò)合物，因此根據(jù)它們的構(gòu)象分離。US6492513的方法允許將藤霉素(其具有17-烯丙基側(cè)鏈)與具有17-飽和側(cè)鏈的兩種雜質(zhì)分離，因?yàn)橛捎谛纬摄y絡(luò)合物，藤霉素較其他兩種雜質(zhì)在陽離子型離子交換樹脂上更易保留。
US 6576135教導(dǎo)了借助非離子吸附樹脂、特別是具有以下部分結(jié)構(gòu)的非離子吸附樹脂分離藤霉素分雜質(zhì)(II)和(III)， 其中R為氫或鹵素原子。
由文獻(xiàn)中已知衍生自藤霉素的若干降解產(chǎn)物(Y.Namiki等人，Cromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月)。
這些降解產(chǎn)物已經(jīng)存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中，并且取決于工作條件可在各萃取階段中增加。
US 6492513和US 6576135的方法允許分離藤霉素和雜質(zhì)(II)和(III)，但不能分離其他降解產(chǎn)物。
發(fā)明詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，借助C18反相硅膠，可以方便地將藤霉素作為銀絡(luò)合物(IV)純化以除去降解雜質(zhì)， 具體而言，本發(fā)明的方法包括將鏈霉菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物溶解于含有銀離子的水/有機(jī)溶劑混合物中，并在C18反相硅膠柱上洗脫溶液。
銀離子在溶液中自銀鹽釋放，優(yōu)選硝酸銀或高氯酸銀。銀離子的濃度優(yōu)選為0.05至1.30mol/1，更優(yōu)選0.20至0.30mol/1。
溶解待純化產(chǎn)物的溶劑混合物中的有機(jī)溶劑是藤霉素于其中可溶的有機(jī)溶劑，優(yōu)選選自丙酮、甲醇和乙腈。
C18反相硅膠的量是粗產(chǎn)物重量的8倍，優(yōu)選12-14倍。藤霉素-銀的π-絡(luò)合物的洗脫施使用與溶解所用相同的溶劑混合物進(jìn)行，逐漸增加有機(jī)溶劑的量并從色譜柱收集適當(dāng)?shù)募壏?。洗脫液中銀離子的濃度范圍為0.05mol/1至1.30mol/1。反相硅膠是具有不同粒度的C18硅膠，優(yōu)選5-15μm和70-230μm。用于分析洗脫級分的分析方法是文獻(xiàn)中公開的分析方法(Y.Namiki等人，Cromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月)，其中通過計(jì)算RRT可以鑒定雜質(zhì)(II)、(III)和其他降解雜質(zhì)。
本發(fā)明的方法也可包括使用非離子樹脂的色譜純化和使用正相硅膠的色譜純化，例如根據(jù)EP 0184162。這些純化步驟可在C18反相硅膠純化之前或之后進(jìn)行。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，這些進(jìn)一步的純化可在之前進(jìn)行，如下文詳細(xì)所述。
將適當(dāng)過濾的發(fā)酵培養(yǎng)液或培養(yǎng)基用藤霉素于其中可溶的有機(jī)溶劑萃取，例如酮類或醇類，優(yōu)選丙酮和甲醇；對萃取產(chǎn)物進(jìn)行非離子吸附樹脂的吸附色譜，然后進(jìn)行正相硅膠色譜，以從衍生自發(fā)酵培養(yǎng)液的其他化合物(由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)、無機(jī)鹽和子原料衍生的物質(zhì))純化藤霉素、雜質(zhì)(II)和(III)以及降解產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物溶解于水-有機(jī)溶液中并于C18反相硅膠柱上洗脫，以回收藤霉素-銀π-絡(luò)合物(IV)，將其用藤霉素于其中可溶的有機(jī)溶劑萃取，例如乙酸乙酯。將萃取產(chǎn)物濃縮并用已知方法結(jié)晶。
吸附樹脂純化使用市售可得的吸附樹脂進(jìn)行，優(yōu)選Mitsubishi化學(xué)品公司(系列號SP200 o SP800)或Rohm和Haas(XAD系列)制造的那些樹脂。優(yōu)選的溶劑是酮類和醇類，更優(yōu)選丙酮和甲醇。
正相硅膠色譜純化使用具有不同顆粒大小、優(yōu)選70-230目的市售可得的硅膠進(jìn)行。溶劑優(yōu)選為鏈烷烴、酯類、酮類和醇類，更優(yōu)選正己烷和乙酸乙酯。
萃取和結(jié)晶按照文獻(xiàn)中公開的藤霉素的溶劑萃取和回收方法進(jìn)行。優(yōu)選地，將含有經(jīng)純化的藤霉素-銀π-絡(luò)合物的溶液在真空下濃縮，以除去有機(jī)溶劑，隨后用0.5-3體積的有機(jī)溶劑、優(yōu)選乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用1體積的去離子水洗滌2-3次，隨后濃縮至小體積。將所得溶液溶解于有機(jī)溶劑、優(yōu)選乙腈后，通過加入去離子水使藤霉素沉淀為單水合物晶體。所得晶體經(jīng)表征為高純度(按照Y.Namiki等人，Chromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月所報(bào)道的方法，HPLC面積％＞99％)。
本發(fā)明的方法相對于已知方法在產(chǎn)率、雜質(zhì)分離的選擇性以及終產(chǎn)物的量方面特別有優(yōu)勢。就產(chǎn)率而言，本發(fā)明方法中每單位粗產(chǎn)物所要求的色譜載體(C18反相硅膠)的量顯著低于(約5-8倍)US 6576135中所公開的量(其中色譜載體為HP20ss)。粗產(chǎn)物與C18反相硅膠的重量百分比為5-8％，而在US 6576135的方法中，粗產(chǎn)物與色譜載體HP20ss的重量百分比為1％。每單位重量的色譜載體承載更高量的產(chǎn)物，使得能夠在工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)率和消耗方面獲得顯著改進(jìn)。終產(chǎn)物的量以及純化階段的體積同樣被減少5-8倍，因此由銀鹽(特別是硝酸銀)所致的消耗也得以降低。
因此，C18反相硅膠的單一色譜步驟提供了工業(yè)規(guī)模上高純度的終產(chǎn)物。
現(xiàn)借助一些實(shí)施例更為詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1-萃取和吸附樹脂純化將50升發(fā)酵培養(yǎng)液加至50升丙酮和1kg過濾助劑Dicalite。于室溫?cái)嚢?小時(shí)后，過濾漿液。將所得透明溶液吸附于2升吸附樹脂XAD 16(由Rohm和Haas制造)。將活性物質(zhì)用6升25/75水/丙酮洗脫。濃縮所得溶液以除去丙酮。將水相(1.5升)用1.5升乙酸乙酯萃取。分離各相，將有機(jī)相濃縮為油。
實(shí)施例2-硅膠純化將油相加至180g硅膠(0.063-0.200mm Merck)和180ml乙酸乙酯。將混合物攪拌，隨后蒸發(fā)至粉末，將其加載于含有1升硅膠(0.063-0.200mmMerck)/正己烷的柱子上。用4升正己烷、然后4升75/25正己烷/乙酸乙酯、最后用10升乙酸乙酯洗脫，以完成純化。收集洗脫的級分，并將它們各自于C18柱上通過HPLC分析，用水/乙腈作為洗脫劑。匯集富含活性物質(zhì)的級分并濃縮，得到黃白色固體(12g)。
實(shí)施例3-藤霉素-銀π-絡(luò)合物的溶解和純化將實(shí)施例2的固體(12g，含8.5g藤霉素)溶于400ml含有30g AgNO3的50/50水/丙酮溶液中。使溶液通過200ml C18反相硅膠15μm(由Grace-Amicon制造)。之后，用1000ml含有51g AgNO3的50/50水/丙酮溶液、最后用250ml 20/80水/丙酮溶液洗脫柱子。將洗脫液分為各級分，按照Y.Namiki等人，Chromatography Vol.40，N°5/6 1995年3月所報(bào)道的分析方法進(jìn)行分析。下表報(bào)告了各個(gè)C18反相硅膠純化步驟過程中藤霉素濃度的變化和雜質(zhì)的變化。
合并級分2、3、4和5并濃縮至400ml。加入400ml乙酸乙酯，然后分離有機(jī)相，用400ml去離子水洗滌3次。將有機(jī)相濃縮至小體積(10-15ml)。
實(shí)施例4-藤霉素的回收將根據(jù)實(shí)施例3所獲得的溶液加至700ml乙腈。于25℃的溫度緩慢加入(1-2小時(shí))1200ml去離子水，并將溶液冷卻至5℃，然后在該溫度靜置12-14小時(shí)。過濾后，獲得7.0g高純度藤霉素(HPLC面積％＞99％)。
表
權(quán)利要求
1.純化藤霉素(I)的方法， 包括將鏈霉菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物溶解于含有銀離子的水/有機(jī)溶劑混合物中，并在C18反相硅膠柱上洗脫溶液。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中的銀離子從銀鹽釋放。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中的銀鹽是硝酸銀或高氯酸銀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中的銀離子濃度為0.05至1.30mol/l。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中的濃度為0.20至0.30mol/l。
6.根據(jù)以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中的有機(jī)溶劑選自丙酮、甲醇和乙腈。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其還包括使用非離子樹脂的色譜純化階段和使用正相硅膠的色譜純化階段。
全文摘要
本發(fā)明涉及從鏈霉菌屬發(fā)酵培養(yǎng)液純化和回收藤霉素(I)即(17－烯丙基－1，14－二羥基－12－[2－(4－羥基－3－甲氧基環(huán)己基)－1－甲基乙烯基]－23，25－二甲氧基－13，19，21，27－四甲基－11，28－二氧基－4－氮雜三環(huán)－[22.3.1.0
文檔編號C07B63/00GK101048415SQ200580037031
公開日2007年10月3日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者W·卡布里, P·派索尼, J·羅來多, L·莫拉 申請人:安蒂比奧蒂科斯有限公司