專利名稱：井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方 法。
背景技術(shù)：
井網(wǎng)霉素國外又稱“有效霉素”(Validamycin)，是我國及東南亞水稻主產(chǎn)區(qū)用于 防治水稻紋枯病的最佳生物農(nóng)藥之一，施用后無耐藥現(xiàn)象，同時(shí)還是生產(chǎn)阿卡波糖(拜糖 平)和伏格列波糖(倍欣)兩種糖尿病臨床用藥的直接原料。本次采用菌株是上海農(nóng)藥所 J艮道白勺吸水鏈霄菌井_變禾中 5008 菌株(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)，該菌株能同時(shí)產(chǎn)生井R霉素和靜絲霉素兩類抗生素，其有效成分井R霉素現(xiàn)階段在 我國的年需求量超過6萬噸，年產(chǎn)值超5億元，是迄今為止我國使用最廣的一種農(nóng)用抗生
o經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，在井R霉素工業(yè)化生產(chǎn)的30多年中，人們多采用菌 種選育和培養(yǎng)基優(yōu)化來提高井R霉素發(fā)酵產(chǎn)量。1970年Iwasa首次報(bào)道了有效霉素并對吸 水鏈霉菌檸檬變種發(fā)酵生產(chǎn)有效霉素A和B進(jìn)行了探索，最終獲得的優(yōu)化后產(chǎn)量為620mg/ L。2003年陳力力和魯迎新采用微波誘變選育井R霉素生產(chǎn)菌，獲得了遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌 株，產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了 20%左右。2007年，虞龍和安肖探索使用金屬離子和氣體離子 交替注入誘變方法，得到了較高的正突變率和突變增幅，獲得了比出發(fā)菌株提高54. 4%的 遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。目前井R霉素的工業(yè)生產(chǎn)中多采用玉米粉、黃豆餅粉等廉價(jià)碳氮源外加適量鉀鈉 鹽為主要培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)該抗生素。從碳源代謝的角度來看，吸水鏈霉菌5008用于產(chǎn)次級 代謝物井R霉素的碳源比例已經(jīng)達(dá)到相對較高的水平，同時(shí)也顯示僅僅通過碳氮源優(yōu)化和 菌株誘變的方法來提高井R霉素的產(chǎn)量遇到了瓶頸。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻(xiàn)號CN101298623中記載了一種提高發(fā) 酵溫度來增加井R霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，但該技術(shù)同時(shí)存在發(fā)酵后期菌體數(shù)量下降較快影 響井R霉素總產(chǎn)量的問題。而且提高溫度必然會(huì)影響工業(yè)化發(fā)酵過程的成本。因井岡霉 素發(fā)酵結(jié)束后，會(huì)產(chǎn)生一定量的菌渣，其主要成分是未完全利用的培養(yǎng)基和發(fā)酵后剩余菌 體；另外，中國專利文獻(xiàn)號CN101134976記載了一種使用循環(huán)發(fā)酵法生產(chǎn)井網(wǎng)霉素的方法， 但其主要目的是實(shí)現(xiàn)無菌渣和無廢水排放減少環(huán)境污染，在井R霉素節(jié)能增產(chǎn)方面未見改 善。因此，在現(xiàn)有優(yōu)化后的發(fā)酵水平基礎(chǔ)上，控制能耗成本的前提下，如果能通過添加微量 的細(xì)胞刺激物影響次級代謝的水平，從而實(shí)現(xiàn)次級代謝物的高效發(fā)酵也許將會(huì)是突破井岡 霉素產(chǎn)量瓶頸的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，通過添 加微量乙醇的方法，刺激吸水鏈霉菌代謝，特別是次級代謝系統(tǒng)，使井R霉素的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。本發(fā)明的方法在不加大能耗的前提下，縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，獲得較 高的井R霉素產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟(1)將孢子懸浮液進(jìn)行菌種活化與平板培養(yǎng)制成孢子活化液，具體為將_70°C保存的吸水鏈霉菌井網(wǎng)變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含 有固體培養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養(yǎng)5-8天后取平板表面覆蓋的孢子， 制成孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井岡變種5008菌株(Str印tomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌 屬，其生物保藏信息為中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院)，菌種保藏號CGMCC4. 1026。所述的孢子懸浮液為平板培養(yǎng)5-8天的孢子，加入5-10mL 20%甘油(v/v)混勻得 到的懸浮液。所述的固體培養(yǎng)基的組分為黃豆餅粉20g/L、甘露醇20g/L以及瓊脂20g/L，余量 為蒸餾水。(2)將孢子活化液接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行初步培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，具體為將種子培養(yǎng)基和孢子活化液按照體積比為1000 1的比例配比后接種到種子培 養(yǎng)基中，接種后于37°C下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)15-30h ；所述的種子培養(yǎng)基的組分為玉米粉30g/L、黃豆餅粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2P040. 8g/L，余量為蒸餾水。(3)將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)井R霉素的發(fā)酵生產(chǎn)， 具體為將發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)液按照體積比為10 1的比例配比后接種到發(fā)酵 培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)5-30h時(shí)加入微量乙醇使其在培養(yǎng)基中濃度達(dá)到 0. 01-0. 5% (每100mL培養(yǎng)基中添加0. 01-0. 5mL無水乙醇)，繼續(xù)培養(yǎng)72_108h后發(fā)酵結(jié) 束，進(jìn)行井R霉素測定。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為玉米粉100g/L、黃豆餅粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl lg/L以及KH2P041. 5g/L，余量為蒸餾水。本發(fā)明利用微生物生長外源刺激物酒精可以抑制或激活某些次級代謝物分泌的 規(guī)律，使用了添加低濃度乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)基來提高井R霉素的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)速率。本發(fā) 明確定了乙醇的最適添加時(shí)間為發(fā)酵開始12h，最適添加濃度為0. 05%,96h發(fā)酵培養(yǎng)后井 岡霉素的絕對積累量從12g/L提高到了約20g/L，降低了生產(chǎn)成本。而且為獲得井R霉素可 在96h終止發(fā)酵，使發(fā)酵提前一天結(jié)束，縮短了發(fā)酵時(shí)間，獲得了更高的相對效價(jià)。


圖1為實(shí)施例中乙醇的添加時(shí)間對井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)影響圖。圖2為實(shí)施例中乙醇的添加濃度對井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)影響圖。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇添加時(shí)間對井R霉素產(chǎn)量的影響考察，選擇3個(gè)時(shí)段種子液 接種前即Oh、發(fā)酵開始后12h、發(fā)酵開始后24h，分別添加不同濃度乙醇進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。實(shí)施 步驟和結(jié)果如下1.實(shí)施步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養(yǎng)基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養(yǎng) 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養(yǎng)5-8天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。 往孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動(dòng)平板表面覆蓋的孢子，使 其懸浮于無菌水中。(2)種子培養(yǎng)將不銹鋼彈簧卷曲成環(huán)狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養(yǎng)基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養(yǎng)基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn) 速220rpm培養(yǎng)24h，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。(3)發(fā)酵培養(yǎng)對照組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉(zhuǎn) 接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移 到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到 24h、48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。乙醇添加組設(shè)置了三個(gè)乙醇添加時(shí)間0h、12h、24h，設(shè)置相對較寬的添加濃度范 圍0. 001 %,0. 01 %、0. 1 %。Oh添加組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝 入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后直接加入不同劑量的乙醇(0. 001%,0.01%,0. )，因 0. 001 %組乙醇添加量較少，可先無菌水稀釋10倍后添加，另兩個(gè)濃度組可直接添加分析 純乙醇。每個(gè)劑量組至少3個(gè)平行樣，然后將9個(gè)搖瓶轉(zhuǎn)接種子液。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平 行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖 瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到24h、48h、72h、96h、 120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。12h添加組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈 簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻， 然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速 220rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12h時(shí)，將搖瓶取出在超凈臺(tái)中加入不同劑量的乙醇(0.001%、 0.01%,0. 1% )，每個(gè)劑量組至少3個(gè)平行樣，然后將9個(gè)搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220rpm 繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行12h即到達(dá)24h取樣點(diǎn)，依次在24h、48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分 別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。24h添加組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌 的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)。 培養(yǎng)進(jìn)行到24h時(shí)，將搖瓶取出在超凈臺(tái)中先取出2mL培養(yǎng)液作為井R霉素檢測樣品(24h 取樣點(diǎn))，然后搖瓶內(nèi)加入不同劑量的乙醇(0. 001%,0.01%,0. 1%)，每個(gè)劑量組至少3個(gè) 平行樣，然后將9個(gè)搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220rpm繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行一天即到達(dá)48h 取樣點(diǎn)，依次在48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。(4)井岡霉素產(chǎn)量檢測樣品處理發(fā)酵液2mL于10000g離心5min，菌體上清分離。發(fā)酵上清液0. 5mL加入 等體積的氯仿，劇烈震蕩數(shù)分鐘直至形成乳濁液。室溫靜置15min，以最大轉(zhuǎn)速離心5min， 轉(zhuǎn)移上清至新管中，稀釋5倍(200 u L+800 u L蒸餾水)，樣品0. 22 y m濾膜過濾、最大轉(zhuǎn)速 離心5min后作為HPLC上樣樣品。井岡霉素標(biāo)品處理井岡霉素配成10g/L(0. lg/10mL), 取 100ii L、200ii L、300ii L、400ii L、500ii L 加水至 lmL(濃度約 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、 5g/L，乘以標(biāo)品純度即為標(biāo)品準(zhǔn)確的實(shí)際濃度)。流動(dòng)相配置使用5mmol/L pH 7. 0的磷 酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相(磷酸鹽緩沖液色譜純甲醇=98 2體積比)，NaH2P04 2H20 0. 78g+100mL 水(取 51mL)、Na2HP04 12H20 1. 79g+100mL 水(取 49mL)，得到 100mL 混合液， 混勻定容至lOOOmL，用稀釋10倍的母液調(diào)pH 7. 0。流動(dòng)相抽濾、超聲波處理20min，液相上 磷酸鹽流動(dòng)相時(shí)先使用10%的甲醇過渡。液相檢測條件流速lmL/min，檢測波長210nm， 使用依利特Hypersil 0DS25um、4. 6mmX 250mm分析柱，控制柱溫25°C，保留時(shí)間約為8min。 根據(jù)峰面積比對標(biāo)準(zhǔn)曲線得到井R霉素含量，因樣品處理時(shí)均稀釋5倍所以比對得到的含 量乘以5得到井R霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。2.實(shí)施結(jié)果分析通過實(shí)施結(jié)果比對知乙醇添加組最高發(fā)酵產(chǎn)量形成于96h，不同處理組與對照 組乙醇不同添加時(shí)間下井岡霉素的最高產(chǎn)量分別為對照組12. 45士 1.407g/L、0. 001%濃 度下乙醇Oh添加組12. 58士 1. 743g/L、0. 001%濃度下乙醇12h添加組13. 68士 1.662g/ L、0. 001 %濃度下乙醇24h添加組13. 04 士 1. 323g/L、0. 01 %濃度下乙醇Oh添加組 13. 76士 1. 338g/L、0. 01%濃度下乙醇 12h 添加組 18. 30士 1. 617g/L、0. 01%濃度下乙醇 24h 添加組13. 03士2. 212g/L、0. 1 %濃度下乙醇Oh添加組10. 69士 1. 020g/L、0. 濃度下乙醇 12h添加組11. 76士 1. 683g/L、0. 濃度下乙醇24h添加組11. 47士2. 964g/L，由此可見在 幾種乙醇不同添加量的處理組都存在12h添加組井R霉素產(chǎn)量高的現(xiàn)象。其中乙醇添加量 在0. 01%時(shí)相對于對照組井R霉素產(chǎn)量有較大提高，所以對其在不同添加時(shí)間的動(dòng)態(tài)影響 作圖(見圖1)。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，井R霉素生產(chǎn)菌吸水鏈霉菌5008在發(fā)酵進(jìn)行到12h 時(shí)處于細(xì)胞代謝最旺盛的對數(shù)生長期，相對于Oh和24h添加乙醇，12h添加乙醇對井R霉素 的產(chǎn)量影響更為明顯，比其他時(shí)間段添加產(chǎn)量可提高40%，與對照組相比可提高50%。實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基中在12h添加乙醇可促進(jìn)井R霉素產(chǎn)量提高，接下來更加詳細(xì)地比 較了不同乙醇添加量對井R霉素產(chǎn)量的影響，先選擇4個(gè)相對較低添加濃度0. 001%, 0. 005%,0. 01%,0. 05%。實(shí)施步驟和結(jié)果如下1.實(shí)施步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)
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將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養(yǎng)基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養(yǎng) 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養(yǎng)5天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往 孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動(dòng)平板表面覆蓋的孢子，使其 懸浮于無菌水中。(2)種子培養(yǎng)將不銹鋼彈簧卷曲成環(huán)狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養(yǎng)基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養(yǎng)基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn) 速220rpm培養(yǎng)18h，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。(3)發(fā)酵培養(yǎng)對照組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉(zhuǎn) 接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移 到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到 12h、14h、18h、24h、48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。乙醇添加組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng) 基。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子 液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12h時(shí)，作為12h 取樣點(diǎn)先每瓶取出2mL發(fā)酵液，然后在超凈臺(tái)中加入不同劑量的乙醇(0.001%、0.005%、 0. 01%、0. 05% )，0. 001%和0. 005%兩個(gè)濃度組添加時(shí)先把乙醇用無菌水稀釋10倍后再 添加，0. 01 %和0. 05%兩個(gè)濃度組直接添加分析純乙醇。每個(gè)劑量組至少3個(gè)平行樣，再將 21個(gè)搖瓶放置搖床內(nèi)按371、220印111繼續(xù)培養(yǎng)，依次在1411、1811、2411、4811、7211、9611、12011每 個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。(4)井岡霉素產(chǎn)量檢測同實(shí)施例1。(5)吸水鏈霉菌5008生物量檢測樣品處理2mL樣品離心后沉淀下來的菌體用STE緩沖液(pH 8. 0)懸浮、離心、洗 滌兩次后，恢復(fù)到2mL(STE溶解)混勻，分裝2個(gè)離心管(250 y L/管+250 u LSTE)，一管加 50mg/mL溶菌酶溶液20 y L，另一管為空白對照。將處理樣、空白樣一起放入37°C水浴保溫 lh，不斷振蕩。加入lOyL 10% SDS進(jìn)一步裂解細(xì)胞并充分振蕩(低濃度條件下用對照可以 消除SDS的干擾)。12000g離心lOmin，吸取上清液根據(jù)濃度情況稀釋25倍至測定范圍內(nèi)， 利用Bradford法測定蛋白濃度。其中STE緩沖液組成為lmol/LTris-HCl (pH 8.0)2. 5mL、 0. 5mol/L EDTA 0. 5mL、5mol/L NaCl 5mL 定容至 250mL。樣品測定分別取試管，其中一支加入l.OmL空白樣，另外一支加入同體積的處理 樣，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G250搖勻放置5min，595nm處測吸光度，用測得的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲 線上查得相當(dāng)于牛血清蛋白的mg數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)(2X25)得蛋白量表征的生物量。(6)發(fā)酵培養(yǎng)基殘?zhí)菧y定樣品處理2mL發(fā)酵液離心取100 y L上清液，48h前樣品(包括48h)梯度稀釋1000倍，72h后樣品(包括72h)梯度稀釋500倍；標(biāo)品處理葡萄糖烘干1天，0. lg加水 10mL(10g/L)稀釋 100 倍(100mg/L)，取三份 200 u L.400 u L.600 u L.800 u L, 1000 u L 加 水至 lmL(濃度20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L，lOOmg/L)。樣品測定加入 5%苯酚溶液 lmL,再與5mL濃H2S04混合均勻，快速加入邊加邊震蕩，放置反應(yīng)lOmin，冷卻后在488nm處 測吸光度。比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別乘以1000或500得殘?zhí)橇俊?.實(shí)施結(jié)果分析乙醇添加量在0. 05%和0. 01%時(shí)，井R霉素產(chǎn)量較對照組有較大提高(圖2)，低 濃度范圍最適添加量為0. 05%。最高產(chǎn)量出現(xiàn)在0. 05%乙醇處理組發(fā)酵96h，從12g/L提 高至約20g/L，產(chǎn)量提高了 8g/L，漲幅超過60%。在最高產(chǎn)量點(diǎn)上，乙醇處理的吸水鏈霉菌 5008的生物量沒有顯著差異(96h樣品對照組胞內(nèi)蛋白表征的生物量3. 974士0. 2474g/L， 0. 01% 乙醇處理組 3. 954士0. 09426g/L，0. 05% 乙醇處理組 3. 782士0. 6991g/L)，表明單位 細(xì)胞井R霉素的產(chǎn)量也得到了提高。工業(yè)化井R霉素生產(chǎn)過程中為防止乙醇對細(xì)胞的毒害 作用，發(fā)酵過程中沒有外源乙醇的加入，但由本實(shí)施例可以看到適量乙醇的添加對發(fā)酵生 產(chǎn)次級代謝物的刺激作用并由此可體現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基中在12h添加乙醇可促進(jìn)井R霉素產(chǎn)量提高，接下來更加詳細(xì)地比較 了不同乙醇添加量對井R霉素產(chǎn)量的影響，選擇3個(gè)相對較高的添加濃度0. 1%,0.5%, 1%。實(shí)施步驟和結(jié)果如下1.實(shí)施步驟(1)菌種活化與平板培養(yǎng)將黃豆餅粉、甘露醇、瓊脂按2%的濃度配成平板培養(yǎng)基，滅菌倒平板冷卻后待用。 將-70°C保存的井R霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液融化，將其涂布于固體培養(yǎng) 基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養(yǎng)7天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往 孢子長勢良好的平板上加入5mL無菌水，使用涂布棒輕輕刮動(dòng)平板表面覆蓋的孢子，使其 懸浮于無菌水中。(2)種子培養(yǎng)將不銹鋼彈簧卷曲成環(huán)狀，置于250mL錐形瓶底部，裝入50mL種子培養(yǎng)基(成分 玉米粉3g、黃豆餅粉2. 2g、酵母粉lg、NaCl 0. 2g、KH2P040. 08g、蒸餾水100mL)，滅菌。待培 養(yǎng)基冷卻至室溫，吸取孢子懸浮液50 y L加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn) 速220rpm培養(yǎng)30h，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。(3)發(fā)酵培養(yǎng)對照組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成 分玉米粉10g、黃豆餅粉2. 5g、酵母粉0. 5g、NaCl 0. lg、KH2P040. 15g、蒸餾水lOOmL)。轉(zhuǎn) 接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子液轉(zhuǎn)移 到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個(gè)平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到 24h、48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。乙醇添加組發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng) 基。轉(zhuǎn)接時(shí)首先將三個(gè)平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5mL移液管吸取5mL種子 液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12h時(shí)，作為12h
8取樣點(diǎn)先每瓶取出2mL發(fā)酵液，然后在超凈臺(tái)中直接加入不同劑量的分析純乙醇(0. 1%, 0.5%,1% ),每個(gè)劑量組至少3個(gè)平行樣，再將21個(gè)搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220rpm繼續(xù) 培養(yǎng)，依次在24h、48h、72h、96h、120h每個(gè)搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。(4)井岡霉素產(chǎn)量檢測同實(shí)施例1。(5)吸水鏈霉菌5008生物量檢測同實(shí)施例2。(6)發(fā)酵培養(yǎng)基殘?zhí)菧y定同實(shí)施例2。2.實(shí)施結(jié)果分析乙醇添加量在0. 1%、0.5%、1%時(shí)，井網(wǎng)霉素產(chǎn)量較對照組均無提高的現(xiàn)象(圖 2)，特別是濃度時(shí)對井R霉素產(chǎn)量已有明顯的抑制作用。殘?zhí)橇繙y定發(fā)現(xiàn)在乙醇添加量 達(dá)到0. 時(shí)，發(fā)酵初期糖代謝開始受到一定抑制a^^i0h、24h、48h、72h、96h、120h的 殘?zhí)橇糠謩e為 90. 35士0. 8763g/L、46. 50士0. 3125g/L、12. 75士2. 475g/L、8. 190士2. 812g/ L、7. 900士0. 775g/L、6. 680士3. 003g/L ;0. 1 % 乙醇組分別為 90. 35士0. 8763g/ L、56. 70 士 0. 9712g/L、32. 04 + 3. 329g/L、13. 56+ 1. 574g/L、9. 760 + 2. 278g/L、 7. 270士2. 171g/L)，相對較高濃度的乙醇(>0.1%)添加會(huì)產(chǎn)生相反的效應(yīng)，引起農(nóng)藥產(chǎn) 量的下降，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。所以在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)嚴(yán)格控制乙醇添加濃度和添加時(shí) 間，才能提高經(jīng)濟(jì)效益降低工業(yè)生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
一種井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、將孢子懸浮液進(jìn)行菌種活化與平板培養(yǎng)制成孢子活化液；第二步、將孢子活化液接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行初步培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；第三步、將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)井岡霉素的發(fā)酵生產(chǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的第一步具體為 將-70°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培 養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養(yǎng)5-8天后取平板表面覆蓋的孢子，制成孢子 活化液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的吸水鏈霉菌井岡 變禾中 5008 菌株(Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008)屬于放線菌|、二、 放線菌綱、放線菌亞綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的孢子懸浮液為 平板培養(yǎng)5-8天的孢子，加入5-10mL體積比濃度為20%甘油混勻得到的懸浮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的固體培養(yǎng)基的組 分為黃豆餅粉20g/L、甘露醇20g/L以及瓊脂20g/L，余量為蒸餾水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的第二步具體為將 種子培養(yǎng)基和孢子活化液按照體積比為1000 1的比例配比后接種到種子培養(yǎng)基中，接種 后于37°C下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)15-30h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的種子培養(yǎng)基的 組分為玉米粉30g/L、黃豆餅粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2P040 . 8g/L，余量 為蒸餾水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的第三步具體為將 發(fā)酵培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)液按照體積比為10 1的比例配比后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后 于37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)5-30h時(shí)后每100mL培養(yǎng)基中添加0. 01-0. 5mL無水乙醇使其在培養(yǎng)基 中濃度達(dá)到0. 01-0. 5%，繼續(xù)培養(yǎng)72-108h后發(fā)酵結(jié)束。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的 組分為玉米粉100g/L、黃豆餅粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl lg/L以及KH2P041. 5g/L，余量 為蒸餾水。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的井岡霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，通過將孢子懸浮液進(jìn)行菌種活化與平板培養(yǎng)制成孢子活化液；再將孢子活化液接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行初步培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液；最后將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)井岡霉素的發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明使井岡霉素的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。本發(fā)明的方法在不加大能耗的前提下，縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，獲得較高的井岡霉素產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12R1/55GK101851653SQ20101017383
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者周文文, 鐘建江 申請人:上海交通大學(xué)