一株產(chǎn)井岡霉素的黃麻鏈霉菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一株產(chǎn)井岡霉素的黃麻鏈霉菌 (Streptomyces corchorusii)，本發(fā)明還設及該菌株的應用。
【背景技術】
[0002] 井岡霉素是一種農(nóng)用抗生素，能有效防治紋枯病，是"防效高、無藥害、無污染"的 環(huán)保型農(nóng)藥，是當今產(chǎn)量和使用面積最大的農(nóng)用抗生素。井岡霉素屬于氨基糖巧類，主要由 A、B、C、D、E、F等組分組成，后來又發(fā)現(xiàn)G和H等成份，但只有A組分對紋枯病的防治作用最強， 高含量井岡霉素 A不僅可W作為農(nóng)藥使用，還可W作為生產(chǎn)醫(yī)藥的中間體，其應用前景十分 廣闊。然而目前采用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)的井岡霉素雜質(zhì)含量較高，尤其是井岡霉素 B的含 量較高，產(chǎn)品質(zhì)量普遍較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是通過對黃麻鏈霉菌株進行人工誘變，從而獲得一株不僅能用于生 產(chǎn)井岡霉素，而且能提高井岡霉素 A含量，降低井岡霉素 B含量的黃麻鏈霉菌。
[0004] 申請人W黃麻鏈霉菌化N-11)為出發(fā)菌株，將其采用lOOOGy劑量60C0- 丫射線進行 第一輪誘變，獲得一株KN-16菌株，該菌株比出發(fā)菌株的效價(產(chǎn)井岡霉素 A的含量）高出 21%，然后再用紫外線對腳-16菌進行第二輪誘變，獲得一株剛-162菌株，比腳-16的效價提 高9.8%。將KN-162菌株進行再一次抗性篩選，用高純度、雜質(zhì)含量低的自身代謝物處理該 菌株，殺死或抵制絕大多細胞的繁殖，選出有大量產(chǎn)生該代謝物的抗反饋突變株，得到1株 正突變KN-1625菌株，該菌株產(chǎn)井岡霉素 A的含量比KN-162菌株高18%，產(chǎn)井岡霉素 B/A的 含量比1^-162菌株低約37.56%。
[0005] 該菌株經(jīng)鑒定為黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii)，命名為KN-1625,申請 人于2015年11月26日將該菌保藏于位于湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏 中屯、(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015710。
[0006] 為驗證KN-1625菌生產(chǎn)井岡霉素的性能，申請人將KN-1625菌株投入生產(chǎn)并進行了 兩批次的中試研究，首先將KN-1625菌株進行活化，活化后的菌懸液進行二級種子培養(yǎng)，培 養(yǎng)液再進入發(fā)酵罐進行發(fā)酵，放罐后用高效液相色譜法對發(fā)酵液進行檢測，結果表明：發(fā)酵 液中井岡霉素 A的含量高達3.065%，井岡霉素 B與井岡霉素 A的含量比（B/A)僅為11.52%， 與出發(fā)菌株化N-11)相比，井岡霉素 A含量提高了47.00%，B/A降低了37.56%，且井岡霉素 產(chǎn)量穩(wěn)定在300(K)yg/mLW上，比CK菌株也有所提高。試驗結果還表明，KN1625菌株的遺傳穩(wěn) 定性好，傳至四代產(chǎn)井岡霉素水平與第一代相當。
【具體實施方式】
[0007] W下結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。
[000引實施例1菌株的誘變和篩選
[0009] 1.利用60C0- 丫射線處理菌懸液W得到突變菌株
[0010] 取黃麻鏈霉菌KN-11的斜面細胞或抱子適量，置于含有玻璃珠的無菌水中，使其細 胞或抱子濃度在106~108個/毫升，充分搖勻打散。由于丫射擊線穿透能力很強，對細胞致 死作用比一般化學誘變劑更為強烈。誘變劑量掌握在致死率90-99%為宜，WKN-16為出發(fā) 菌株，將其抱子菌懸液用不同劑量60C0-丫射線福照，劑量為300Gy、500Gy、700Gy、1000Gy、 130067、150067時，分別致辭死率為75.7%、85.3%、89.1%、95.0%、98.2%、99.10%。 300Gy內(nèi)處理抱子死亡率上升的非?？欤?00-1500Gy處理抱子死亡率變化相對緩慢。
[0011] 誘變劑量不同，對KN-11的突變率也不同。誘變劑量過大，正突變很低，將700Gy、 1000Gy、1300Gy、1500Gy誘變后的菌懸液稀釋進行平板計數(shù)，在誘變后的菌斑上加入2毫升 無菌水，浸泡0.5小時，用1毫升移液器反復吹洗菌斑數(shù)次后轉移至無菌試管中，W此管為 10-1管，依次做10倍稀釋涂布。28°C恒溫培養(yǎng)5天，觀察長勢，挑選菌落直徑大、長勢快、吸水 快的、菌苔飽滿中間凸起的菌落進行搖瓶篩選，在lOOOGy誘變劑量中獲得一株KN-16菌株， 產(chǎn)量與出發(fā)菌株化N-11)相比，效價高出21%。
[0012] 2.利用紫外線誘變處理篩選突變菌株，W得到少數(shù)性能優(yōu)良的菌株
[0013] 經(jīng)過60C0-丫射線誘變后的菌株，大多數(shù)細胞死亡，但有少數(shù)細胞中的DNA發(fā)生突 變，將運些突變后的菌株再次進行紫外誘變，可W影響DNA損傷的修復作用，使之出現(xiàn)更多 的差錯，提高誘變率，其誘變頻率高且不易回復，紫外線可引起微生物菌體的DNA突變，形成 喀晚二聚體。光照會斷開二聚體，所W紫外線誘時要避光條件下進行。W前認為致死率在 90-99.9%效果好。但是目前的報道認為致死率在70-80%有利于正突變型的產(chǎn)生，且篩選 的菌株遺傳穩(wěn)定性好。
[0014] 將KN-16菌制成10X108個/ml單抱子懸液，取2ml到直徑為90mm的無菌平板中，在 磁力攬拌下進行紫外線誘變(波長253.7皿，功率15W，照射距離30cm)，照射時間分別為0,2， 5，8，10，15，20，25min，然后取經(jīng)過不同劑量照射的菌懸液0.1 mL到平板培養(yǎng)基上28°C恒溫 培養(yǎng)5天，待菌落長出后進行活菌計數(shù)，并繪制致死曲線，在得到致死曲線后，用致死率在 80-90%的照射時間照射菌株，再次28°C恒溫培養(yǎng)5天。將致死率在90-95%的菌株稀釋并涂 布到含有最大耐受井岡霉素 A濃度的菌株上，28°C恒溫培養(yǎng)5天，將長出的菌落編號搖瓶測 定井岡霉素 A的含量及B組分的含量，獲得一株KN-162菌株，搖瓶比KN-16菌株產(chǎn)井岡霉素 A 含量高9.8%。
[00巧]3.通過抗性篩選得至崎產(chǎn)井岡霉素 A、B組份低的菌株
[0016]井岡霉素 A為氨基糖巧類抗生素，是放線菌的次級代謝產(chǎn)物，其代謝途徑復雜，研 究表明，抗生素發(fā)酵受反饋抑制非常明顯，特別是氨基糖巧類抗生素。次級代謝產(chǎn)物是某些 生物為了避免在初級代謝過程中某些中間產(chǎn)物積累所造成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利 于生存的代謝類型。由于次級代謝和初級代謝有共同的分差中間體，既可W合成初級代謝 產(chǎn)物，又可W合成次級代謝產(chǎn)物。當菌體生長的環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)不均衡時，即某些營養(yǎng)過 剩、某些營養(yǎng)缺乏，菌體不能有效的攝入營養(yǎng)，在代謝系統(tǒng)的作用下，其生長繁殖速率下降， 并通過代謝途徑的改變將過剩的營養(yǎng)物質(zhì)轉變成與生長繁殖無關的次級代謝產(chǎn)物。因此， 在篩選菌株時，我們就W消除初級代謝產(chǎn)物對那些共同中間體的反饋調(diào)節(jié)，使之大量積累， 運樣就有利于井岡霉素 A的合成，降低雜質(zhì)含量。
[0017]將KN-162菌株進行再一次抗性篩選，用64A高純度、B/A為18%雜質(zhì)含量低的自身 代謝物井岡霉素 A(標準品）按不同濃度(有效含量0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.