本發(fā)明涉及基因工程菌株技術領域，特別涉及一種銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株，還涉及此菌株的構建方法及應用。

背景技術：

銅綠假單胞菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種多功能代謝普遍存在于周圍環(huán)境中的細菌種類。它能夠寄生于各種植物及動物宿主，引起人類的機會性感染。量化基因表達水平已成為大多數(shù)分子生物學實驗室的主要生物學研究技術，通過測量細胞中RNA的含量，可以確定特定基因的表達程度。轉(zhuǎn)錄組測序是在基因轉(zhuǎn)錄水平，研究在某個時間點的組織中所有轉(zhuǎn)錄本的表達情況，根據(jù)相同部位相同時間點不同含量的個體間的分析，可以批量分析影響毒力的差異表達基因，同樣可以根據(jù)得到的差異基因來構建多基因調(diào)控網(wǎng)絡。

在分子生物學領域，很多方法都可以用來進行靶基因的定量研究。實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。cDNA芯片和差異顯示是兩種最常用的高通量篩選差異表達基因的技術。將實時熒光定量PCR和高通量方法的結果相互比較就能對這個基因是否真的存在表達差異進行確證。

基因敲除是基因打靶技術的一種，類似于基因的同源重組。指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中，令特定的基因功能喪失，并進一步研究可能對相關生命現(xiàn)象造成的影響，進而推測該基因的生物學功能。自殺質(zhì)粒(suicide plasmid)通常為R質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒，常有宿主范圍廣的特點，具有接合轉(zhuǎn)移基因。它的復制需要一種特殊的蛋白，大多數(shù)細菌不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，當進入寄主細胞時，要么不能復制，被消除，要么被整合入染色體上，和染色體一起復制。利用自殺質(zhì)粒的這個特點，將基因工程技術構建的基因缺失的DNA片斷，克隆入自殺質(zhì)粒，利用缺失基因兩端的同源片斷，定位自殺質(zhì)粒的整合位點。利用同源性DNA片斷可發(fā)生重組的原理，構建精確基因缺失菌株。銅綠假單胞菌的敲除菌株鮮有研究，特別是pyoS5基因的敲除菌株目前還未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術中銅綠假單胞菌的敲除菌株鮮有研究的問題，本申請?zhí)峁┝艘环N銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株。

根據(jù)銅綠假單胞菌強弱毒菌株的比較轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)以及熒光定量PCR驗證結果，分析相關數(shù)據(jù)庫，找出顯著性的差異表達基因。利用基因敲除的方法構建差異基因的缺失株，即構建目的基因打靶片段，引入外源性自殺質(zhì)粒，進行雙交換同源重組，通過PCR技術篩選獲得pyoS5基因被慶大霉素抗性基因Gm取代的克隆，以進行后續(xù)研究差異基因與毒力的相關性。

本發(fā)明還涉及銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株的構建方法。

本發(fā)明還涉及銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株的應用。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株，構建方法如下：

(1)從銅綠假單胞菌細菌基因組上擴增pyoS5基因的上下游同源重組臂，同時克隆到pUC19質(zhì)粒的多克隆位點區(qū)域，獲得克隆pUC19-ΔpyoS5；

(2)將從pJQ200SK質(zhì)粒上擴增得到的慶大霉素抗性基因Gm克隆到上下游同源臂間，獲得pUC19-ΔpyoS5::Gm質(zhì)粒；

(3)打靶片段上游同源臂-慶大霉素抗性基因-下游同源臂，經(jīng)亞克隆轉(zhuǎn)入自殺質(zhì)粒pCVD442，獲得打靶質(zhì)粒pCVD442-ΔpyoS5::Gm；

(4)pCVD442-ΔpyoS5::Gm轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliβ2155，獲得供體菌β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm，與受體菌11092618進行接合，經(jīng)過培養(yǎng)、篩選獲得pyoS5基因被Gm抗性基因取代的銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株11092618ΔpyoS5。構建方法技術路線如圖1所示。

本發(fā)明銅綠假單胞菌11092618菌株pyoS5基因敲除突變株具有以下特征：所述突變株屬于假單胞菌科、假單胞菌屬，屬于革蘭氏陰性菌；專性需氧，呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列，菌體的一端有單鞭毛，無芽胞；在液體培養(yǎng)基中則呈渾濁狀生長；在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長16～18h可以見到扁平、濕潤的菌落；在血瓊脂平板上生長時可以見到在菌落的周圍有溶血環(huán)，菌落呈金屬光澤。

所述的銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株，步驟(1)中所述上游同源重組臂的擴增引物堿基序列見序列表中序列1、2，下游同源重組臂的擴增引物堿基序列見序列表中序列3、4，慶大霉素抗性基因Gm的擴增引物堿基序列見序列表中序列5、6。

優(yōu)選上下游同源重組臂間以Sph I位點相連，慶大霉素抗性基因Gm克隆到上下游同源臂間的Sph I位點。

優(yōu)選步驟(4)中篩選時對所得菌株進行鑒定，PCR引物的堿基序列見序列表中序列7、8、9、10、11和12。

所述的銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株，其生長曲線與pyoS5基因敲除前無顯著差異，其毒力低于pyoS5基因敲除前的原始菌株。

所述的銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株在制備銅綠假單胞菌減毒疫苗中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:(1)本發(fā)明運用同源重組的原理，構建中間為慶大霉素抗性基因，兩側為pyoS5基因上下游同源序列的基因敲除載體pCVD442::pyoS5，將構建的pCVD442::pyoS5基因敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliβ2155感受態(tài)細胞中，與銅綠假單胞菌致病株11092618接合后，通過體內(nèi)同源重組，經(jīng)PCR電泳，RT-PCR和測序鑒定，成功獲得突變株，命名為11092618ΔpyoS5；(2)本發(fā)明對pyoS5基因敲除突變株的相關生物學特性和致病性進行了分析，明確了pyoS5基因與銅綠假單胞菌11092618菌株致病性的關系，11092618ΔpyoS5較野生株相比，到達對數(shù)生長期時間和生長速率沒有明顯差異；突變株不轉(zhuǎn)錄pyoS5基因；小鼠的致病性試驗結果表明突變株11092618ΔpyoS5的毒力明顯下降，表明pyoS5基因參與了致病過程，是一種重要的毒力相關因子，該突變菌株為弱毒疫苗的制備提供了重要基礎，可應用于銅綠假單胞菌減毒疫苗的開發(fā)；(3)本發(fā)明構建的11092618ΔpyoS5，為進一步研究銅綠假單胞菌的致病機制奠定了基礎，為更有效的防控銅綠假單胞菌引起的肺炎相關性疾病提供了技術支持；(4)本發(fā)明成功構建的11092618的pyoS5基因敲除突變株11092618ΔpyoS5，突變株不轉(zhuǎn)錄pyoS5基因；在不同攻毒劑量的小鼠致病性實驗中，突變株的毒力顯著下降；在相同攻毒劑量的水貂致病性實驗中，突變株的致死率也較野生株降低，這都說明pyoS5基因是銅綠假單胞菌的一個重要毒力因子，為該菌弱毒疫苗的研制奠定了部分基礎。

本發(fā)明的突出優(yōu)點：

1、本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌11092618菌株pyoS5基因敲除突變株經(jīng)DNA測序沒有突變且可以穩(wěn)定遺傳，可以用于銅綠假單胞菌致病性研究及其弱毒疫苗研發(fā)的候選菌株；

2、本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌11092618菌株pyoS5基因可編碼產(chǎn)生綠膿菌素，其產(chǎn)生的一種藍色有活性的氧化還原次級代謝產(chǎn)物，不僅能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉(zhuǎn)運、打斷細胞呼吸鏈、過量產(chǎn)生氧自由基導致細胞死亡，而且容易在銅綠假單胞菌感染的肺囊性纖維化(CF)患者痰中大量復原，與該菌的毒力直接相關，可用于后續(xù)該基因的毒力及其功能性研究。

附圖說明

圖1為基因敲除菌株構建方法技術路線圖；

圖2為菌液PCR鑒定上游同源臂及部分抗性基因，隨機挑取24個菌落，

M:DNA分子量標準，1，5，6，7，9，12，13，14，15：825bp；

圖3為菌液PCR鑒定下游同源臂及部分抗性基因，隨機挑取24個菌落，

M:DNA分子量標準，1，5，6，7，9，12，13，14，15：1422bp；

圖4為菌液PCR鑒定內(nèi)側敲除基因，上游和下游同源臂及部分抗性基因鑒定為陽性的菌落，

M:DNA分子量標準。P1、P2、P3：陽性對照；10，11，12，13，15，16無擴增；

圖5為野生菌株和敲除菌株的生長曲線。

具體實施方式

材料：

pfu DNA polymerase(Thermo Fisher公司產(chǎn)品，中國上海)；EcoR I、BamH I、Hind III等限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher公司產(chǎn)品，中國上海)；質(zhì)粒pJQ200SK、pUC19、pCVD442；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(OMEGA公司產(chǎn)品，美國)；Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(愛思進生物技術公司產(chǎn)品，中國杭州)；菌株DH5αλpir、β2155；銅綠假單胞菌臨床致病分離株11092618(本實驗室保存)；酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid公司產(chǎn)品，英國)；LB液體培養(yǎng)基：稱取酵母提取物0.5g，胰蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，溶于100mL去離子水中，高壓蒸氣滅菌；LB固體培養(yǎng)基：每100mL液體LB培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂粉，高壓蒸氣滅菌；蔗糖(國藥集團化學試劑有限公司，中國上海)；凝膠成像儀(BIO-RAD，美國)；電穿孔儀(BTX，美國)；PCR儀(Eppendorf，德國)。

實施例1線性基因打靶片段的構建

(1)引物設計

pyoS5基因及上下游序列見序列表中序列13。根據(jù)銅綠假單胞菌基因組DNA序列設計PCR引物，堿基序列如下：

線性基因打靶引物pyoS5-1F/1R、pyoS5-2F/2R：

pyoS5-1F:5'-ATATCTAGAGAGCTCAGCATGGCGAATGGCCTGCCACTGTGT-3'(序列表中序列1)

pyoS5-1R:5'-CATGCATGCTTAGACTTCTCCATTGGTGAGTGTGGTACAGAA-3'(序列表中序列2)

(引物序列中加入Xba I-Sac I以及Sph I的酶切位點，擴增上游同源臂675bp)

pyoS5-2F:5'-CATGCATGCAACCAAGCAAGGCCTCGTTAAATCCTACGAG-3'(序列表中序列3)

pyoS5-2R:5'-GCGAAGCTTGAGCTCCGACCACGATGGGCGACTCCAGCGTGCTGA-3'(序列表中序列4)

(引物序列中加入Sac I-Hind III以及Sph I的酶切位點，擴增下游同源臂1274bp)引物pyoS5-1F/1R、pyoS5-2F/2R用于構建線性打靶片段。

(2)PCR擴增：以質(zhì)粒pJQ200SK為模板，用引物Sph I-Gm-F/R進行PCR，擴增含有慶大霉素抗性基因的線性基因打靶片段；

Sph I-Gm-F:5'-ATAGCATGCAGAAATGCCTCGACTTC-3'(序列表中序列5)

Sph I-Gm-R:5'-ATAGCATGCTTGAGACAATTTACCGAACAAC-3'(序列表中序列6)

(擴增慶大霉素抗性基因907bp)

將上游同源臂、慶大霉素抗性、下游同源臂三個片段連在一起克隆到pUC19載體上，得到pUC19-Δ pyoS5::Gm質(zhì)粒，打靶片段構建完畢，序列見序列表中序列14。

實施例2打靶片段再經(jīng)亞克隆轉(zhuǎn)入自殺質(zhì)粒pCVD442，獲得打靶質(zhì)粒(或稱打靶載體)pCVD442-ΔpyoS5::Gm

劃線接種DH5αλpir/pCVD442菌種到LB/Amp平板，30℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆入3mL LB/Amp培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過夜。按照試劑盒說明書(OMEGA Plasmid Mini Kit I)提取pCVD442質(zhì)粒。

限制性內(nèi)切酶酶切反應：pCVD442質(zhì)粒和pUC19-ΔpyoS5::Gm質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切后，取載體和克隆片段進行連接和電轉(zhuǎn)化，得到打靶質(zhì)粒(或稱打靶載體)pCVD442-ΔpyoS5::Gm。

在雙抗性平板上，隨機挑選15個克隆，分別挑入20μL LB培養(yǎng)基，取1μL菌液行PCR檢測。樣品送測序公司測序，結果比對分析，確定無堿基突變即可繼續(xù)實驗。

實施例3β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm供體菌與銅綠假單胞菌11092618受體菌進行接合實驗

β2155菌株的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化：

β2155菌種，劃線接種LB平板(不含抗生素，含0.5mM DAP二氨基庚二酸)，30℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆接種2mL LB(不含抗生素)，30℃培養(yǎng)過夜。吸取0.5mL過夜菌加入30mL LB(250mL搖瓶)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.5。取出搖瓶，置冰浴15min。在預冷的40mL圓底離心管中倒入30mL菌液，于4℃、1000g離心15min沉淀細菌，棄上清。細菌沉淀用30mL冰冷的三蒸水懸?。挥?℃、1000g離心15min沉淀細菌，棄液體。三蒸水重復洗兩次。細菌沉淀用10mL冰冷的10％甘油(三蒸水配制)懸浮，于4℃、1000g離心15min沉淀細菌，棄液體，小心保留沉淀。細菌沉淀用50μL10％甘油(三蒸水配制)充分懸浮，轉(zhuǎn)移入一支預冷的0.5mL離心管即為可以使用的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。取5μL打靶載體連接產(chǎn)物(pCVD442-ΔpyoS5::Gm，異丙醇沉淀后溶解于去離子水)加入50μL β2155感受態(tài)細胞，輕輕混勻，冰上放置1min，轉(zhuǎn)移入預冷的2mm電轉(zhuǎn)杯(Eppendorf)，迅速擦干電轉(zhuǎn)杯外表水分，放入電極進行電擊轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)化儀：BTX ECM399；電壓＝2500V)；電擊后立即向電轉(zhuǎn)杯中加入1mL LB，吹打懸浮，全部轉(zhuǎn)移入新的無菌1.5mL離心管，37℃、220rpm培養(yǎng)復蘇1h。取200μL轉(zhuǎn)化菌鋪LB平板(含慶大霉素25μg/mL，0.5mM DAP)，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm單克隆形成。

在LB平板上劃線接種受體菌銅綠假單胞菌11092618，37℃培養(yǎng)至單克隆形成。

分別在平板上挑β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm單克隆入3mL LB(含氨芐青霉素50μg/mL，慶大霉素25μg/mL，0.5mM DAP)；挑11092618單克隆入3mL LB，37℃，220rpm培養(yǎng)過夜。

分別將供體菌β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm(LB液體中只加0.5mM DAP)和受體菌11092618的單克隆過夜培養(yǎng)菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基(300mL搖瓶)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.8-1.0。

取500μL供體菌β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm菌液與500μL受體菌11092618菌液混合后涂布慶大霉素的LB平板，30℃培養(yǎng)24h。此過程中通過單次交換于基因組上一側手臂處插入整個打靶質(zhì)粒的一次重組克隆，在慶大霉素抗性平板上隨機挑選21個克隆入12％蔗糖液體培養(yǎng)基搖菌12h，傳代二次。將第二次傳代菌液劃線接種慶大霉素(25μg/mL)抗性平板30℃培養(yǎng)24h，蔗糖誘導發(fā)生二次重組。

實施例4通過PCR以及DNA測序技術進行銅綠假單胞菌11092618敲除pyoS5基因突變株的篩選與鑒定

PCR擴增鑒定敲除pyoS5基因突變株引物序列如下：

pyoS5-Gm-ST-F：5'-AGCATGGCGAATGGCCTGCCACTGTGT-3'(序列表中序列7)

pyoS5-Gm-ST-R：5'-GTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCT-3'(序列表中序列8)

(擴增pyoS5基因上游同源臂及慶大霉素抗性一部分825bp)

pyoS5-Gm-XT-F：5'-GATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGA-3'(序列表中序列9)pyoS5-Gm-XT-R：5'-CGACCACGATGGGCGACTCCAGCGTGCTGA-3'(序列表中序列10)

(擴增pyoS5基因上游同源臂及慶大霉素抗性一部分1422bp)

pyoS5-inF：5'-CAAGATGGAATCTGATCTTGAAGG-3'(序列表中序列11)

pyoS5-inR：5'-CATCCTTGTGTTTTTCAAACGAATTG-3'(序列表中序列12)

(擴增pyoS5基因部分DNA序列800bp)

鑒定引物pyoS5-Gm-ST-F/R橫跨上游同源臂及慶大霉素抗性的一部分，pyoS5-Gm-XT-F/R橫跨下游同源臂及慶大霉素抗性的一部分，pyoS5-inF/R位于目的基因pyoS5的內(nèi)側可用來鑒定目的基因的敲除情況。

隨機挑選兩管菌液劃線慶大霉素抗性平板各一個。每個板子隨機挑選24個克隆，分別挑入20μL LB培養(yǎng)基，取1μL菌液行pyoS5-Gm-ST-F/R、pyoS5-Gm-XT-F/R及pyoS5基因內(nèi)側引物三對驗證引物PCR檢測，進行初篩，見圖2、3。

為了保證敲除株穩(wěn)定遺傳，連續(xù)劃線慶大霉素(25μg/mL)抗性平板三次，每個平板挑8個單克隆，同樣用pyoS5-Gm-ST-F/R、pyoS5-Gm-XT-F/R及pyoS5基因內(nèi)側引物三對驗證引物PCR檢測(如圖4)，確定46株敲除株，并將驗證準確的菌株送華大測序，最終確定可穩(wěn)定遺傳的敲除株，命名為11092618ΔpyoS5。將敲除菌株保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

實施例5生長特性檢測實驗

在相同培養(yǎng)條件下，取-80℃保存菌株11092618、11092618ΔpyoS5接種LB液體3mL(15mL離心管)37℃搖床12h；菌液劃線LB平板，37℃溫箱培養(yǎng)14h；分別挑單菌落接種LB液體3mL(15mL離心管)37℃搖床220rpm 12h；分別將菌液接種LB液體100mL(300mL錐形瓶)37℃搖床220rpm，分別按照下邊的時間點取樣測定OD₆₀₀，前3.75h 15min取樣一次，接著每隔30min取樣一次，最后每隔2h取樣一次，做生長曲線。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD₆₀₀值為縱坐標，繪制突變株和野生株生長曲線(如圖5)，結果發(fā)現(xiàn)突變株的生長速率與野生株沒有顯著性差異，提示了pyoS5基因與菌株的生長特性關系不大。

實施例6小鼠致病性實驗

4周齡雌性BALB/c小鼠91只，隨機分為13組，每組7只，1-6組每只分別腹腔注射10^11.0，10^10.0，10^9.0，10^8.0，10^7.0和10^6.0CFU的11092618菌株于0.1mL PBS，7-12組，每只分別腹腔注射10^11.0，10^10.0，10^9.0，10^8.0，10^7.0和10^6.0CFU的11092618ΔpyoS5菌株于0.85％生理鹽水，第13組每只注射0.85％生理鹽水做對照。其中腹腔注射的方法如下：保定小鼠使腹面朝上，頭低尾高，取腹中線的一側，使注射器針孔向上，針尖以小于20°方向刺入皮下，貼腹壁向小鼠頭部方向稍推進針頭，再以45°方向刺入腹腔，回抽確認沒有刺入血管或腸道后緩慢推出藥液。觀察并記錄攻毒后1周內(nèi)小鼠的臨床癥狀，記錄死亡情況，并將死亡小鼠解剖，重新分離致病菌。

根據(jù)不同劑量下小鼠的死亡情況，使用Reed-Muench法計算半數(shù)致死量，其中野生菌株11092618對BABL/c小鼠的最小致死量為1.58×10⁶CFU，敲除菌株11092618ΔpyoS5對BABL/c小鼠的最小致死量為4.35×10⁷CFU。兩株菌對BALB/c小鼠的最小致死量差別較大，野生型菌株毒力明顯高于pyoS5基因敲除菌株。

表1.野生菌株與敲除菌株對BALB/c小鼠的毒力測定結果

對野生菌株和敲除菌株不同攻毒劑量下死亡的小鼠進行解剖，觀察臟器變化，并從心、肝、脾、肺、腎5個臟器中分別無菌取樣重新接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基(NAC平板)，并經(jīng)PCR檢測致病菌株的重新分離情況，均能分離到與原始接種菌株形態(tài)和理化特性相同的細菌，說明是人為感染引起的。且通過LD₅₀的比較，敲除菌株的毒力比野生菌株顯著下降。該突變菌株可應用于銅綠假單胞菌減毒疫苗的開發(fā)。

實施例7水貂致病性實驗

7月齡水貂30只，平均分為3組，每組10只，1組為野生菌株組，每只水貂注射11092618，4×10^7.0CFU菌液1mL；2組為敲除菌株組，每只水貂注射11092618ΔpyoS5，4×10^7.0CFU菌液1mL。試驗結果顯示相同攻毒劑量下，敲除菌組死亡數(shù)量小于野生菌組，進一步驗證了pyoS5基因敲除后銅綠假單胞菌11092618的毒力降低。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>銅綠假單胞菌pyoS5基因敲除突變株及構建方法及應用

<160> 14

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ATATCTAGAG AGCTCAGCAT GGCGAATGGC CTGCCACTGT GT 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

CATGCATGCT TAGACTTCTC CATTGGTGAG TGTGGTACAG AA 42

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

CATGCATGCA ACCAAGCAAG GCCTCGTTAA ATCCTACGAG 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

GCGAAGCTTG AGCTCCGACC ACGATGGGCG ACTCCAGCGT GCTGA 45

<210> 5

<211>

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

ATAGCATGCA GAAATGCCTC GACTTC 26

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

ATAGCATGCT TGAGACAATT TACCGAACAA C 31

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400>7

AGCATGGCGA ATGGCCTGCC ACTGTGT 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

GTTACCACCG CTGCGTTCGG TCAAGGTTCT 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<400>9

GATCTACGTG CAAGCAGATT ACGGTGACGA 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<400>10

CGACCACGAT GGGCGACTCC AGCGTGCTGA 30

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400>11

CAAGATGGAA TCTGATCTTG AAGG 24

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400>12

CATCCTTGTG TTTTTCAAAC GAATTG 26

<210> 13

<211> 5038

<212> DNA

<213> 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400>13

gatggacctg ttgagcgagc tcgacgcaga ggacaaggtg atcctgttct gcgagttcaa 60

gccgaccgtg gctgcgctga aggaactctg cgagcaggcc ggacacggct gcgtcacgct 120

ggtgggcaat gactcgctca ccaagcggca gaaggcgata gttccaatcg cgcaggatcc 180

cgactgccga gtgttcatct gcactacggc ggccgcaggg acgggcaaca acctcactgc 240

ggcgaactac gtgtttttcc tcggcctgcc ctggactccc ggtcagcagg aacaagccga 300

agaccgcgcg taccgaaacg gccagctccg catggtcgtg gtgaaaatcc cactggtcga 360

ggccacgatc gacgagcaac tgtggcaact gctcaacgcg aaacgccagg ttgcccagga 420

cctcatcgag cccgagcagg tcgacggaaa ccgcgcgctt ttagccgcaa gcctaactgg 480

ataaaaaagc cctgatcctc cgccgagtat ttcctgctga agcatggcga atggcctgcc 540

actgtgtgcc tatcatcaaa gggggcctca atgaccaggc agttgaccac tctcacgctg 600

tgcctgctgc tcgccagctg cacgacccac aaggccgagc cggccaggcc agccttcgac 660

agcagccgca atccagacct gctctctccg gacctgtacc aaaacggtgt acatccgaga 720

aatagcccca gtgcaccatg ggtgctgtgc tagatcctaa tgggccccaa ctggatggtc 780

agcacgtttt aatggcttag gtcttcgacg tgtatctccc gtttaacatg gaacgcacaa 840

aactgtctct tcgcttgcta tccctatctt cacccttgaa tggtgttgcg gatcaagtag 900

ctgaattttg cagagagcat cacataccca gcgtgaatct tgagcgcatg aactcgttat 960

tagagataca tgactcttag ggaatatccc gtgggctcag ccaatcccat tcctgaatat 1020

cgagtttaag caaccgtgct tattaccact atatcacagc gcattgacgt gccttcttag 1080

tgcattgccc acacattgaa gccatggggt tcaatttcta gagctgaatc ggcactgttt 1140

ctgtaccaca ctcaccaatg gagaagtcta aatgtccaat gacaacgaag tacctggttc 1200

catggttatt gtcgcacaag gtccagacga tcaatacgca tacgaggttc cccctatcga 1260

tagcgcggcc gttgccggga atatgtttgg cgacttgatt caaagagaca tatatctaca 1320

gaaaaacatt tattatccag tccgatccat tgttgaacaa ggaacaaaag aaaagaagga 1380

gatcaacaag aaagtatctg atcaagtcga tggcttgcta aagcagatca ctcaaggaaa 1440

aagggaggcc acaaggcaag agcgagtcga tgtcatgtcg gcagtcctgc acaagatgga 1500

atctgatctt gaaggataca aaaagacctt taccaaaggc ccattcattg actacgaaaa 1560

gcagtcaagc ctctccatct atgaggcctg ggtcaagatc tgggagaaga actcttggga 1620

agaaagaaag aagtaccctt ttcagcagct tgttagagat gaactggagc gggcggttgc 1680

ctactacaaa caagattcac tctctgaagc ggtaaaagtg ctaagacagg agctcaacaa 1740

gcaaaaagcg ctaaaggaaa aagaggacct ctctcaactg gagcgggact acaaaaccag 1800

aaaggcgaat ctcgagatga aagtacaatc cgagcttgat caagcgggaa gtgctttgcc 1860

tccattggtc agtccaacgc cagagcaatg gcttgaacgt gccacaagac tggttacgca 1920

agcaattgct gataaaaagc agctgcagac cacaaacaat actcttatca agaatgcccc 1980

aacccctcta gaaaagcaga aagccatcta caatggtgag ctacttgtgg atgagatagc 2040

cagtctacag acccgcttag ataagctgaa cgccgaaacg acacgacgca ggacagaagc 2100

agaacgcaag gcggccgagg aacaagcgtt gcaagatgct gttaaattta ctgccgactt 2160

ttataaggaa gtaactgaga aatttggcgc acgaacatca gagatggcgc accaactggc 2220

cgaaggcgcc agggggaaaa atatcaggag ttcggcggaa gcaatcaatt cgtttgaaaa 2280

acacaaggat gcgttaaata aaaaacttag ccttaaagat aggcaagcca ttgccaaagc 2340

ctttgattct ctagacaagc agatgatggc gaagagcctt gagaaattta gcaaaggctt 2400

tggagttgta ggcaaagcta ttgacgccgc cagcctgtac caagagttca agatatctac 2460

ggaaaccggg gactggaaac cattctttgt aaaagttgaa acactagctg ctggtgcggc 2520

cgccagttgg cttgtgggta ttgcatttgc cacggcaacg gccactccta taggcatcct 2580

ggggttcgca ctggtaatgg cagttaccgg ggcgatgatt gacgaaggcc ttctagaaaa 2640

agcaaacaac cttgtaatgt ccatttaaaa ccaagcaagg cctcgttaaa tcctacgagg 2700

cctttccgta tttatagaat aaaaaaatca tccccaaggg aattgaaaac aaataacaag 2760

ccaaataaaa gactgcatac aatcctgttt ttgcaggggt ttcggagaaa aaacctgtga 2820

cccagaactc tttttccgta tattttaaag cgaagtcttc aacaagcctt accgagaaag 2880

gaaacaggat agtactgaat ccagccacta ccaaggggtt aactgatgcc aggcttggaa 2940

atacggagcc tttccaagcg actaaaacaa agaagaaagc tccccagaaa aatttagccc 3000

aatagtattt aaagctcaat tagcaccccg tactgtctga cctgagttca acaaagcatt 3060

ctaaaacgat tagaacttct attttatcca tttctaacaa cgattcccac ctggctcgct 3120

ttaggcgtaa catgaaaaac cttcatcgct cctaatccgt ttcccttacg cctgcctcgc 3180

tcaccctctg cctagtcatc gagaaatccc ctcccctgtt gccgagtatt tcctgctgat 3240

gcgtggcgga tggcctgcca ctgtgtgccc catcatcaaa gggggcctca atgaccaggc 3300

agttgaccac tctcacgctg tgcctgctgc tcgccagctg cacgacccac aaggctgagc 3360

cggccaggcc agccttcgac agcagccgca atccagacct gctttctccg gacctgtatc 3420

caaacggtgt gcagccggag aaagagcccg tagtgcgcta tgggcgctac accctggtca 3480

gcacccagcc tgatgccggt caacgcgacc tgatggccca gatcatcgac gtaaccatcc 3540

cgtcgagcat gaacccgagc gtcaaggacg ccatgcagta cgtgatgagc cgctcgggtt 3600

actcgctgtg cccggcagac gccggtcatg tgaacatcct ctacacccgg ccgctgccgg 3660

cagctcagta caagctcggc ccgatgaccc tgcgcaacac cctccaggtc ctctccggcc 3720

cagcctggca ggttaaggtc gacgaggtcg cgcggcaggt ctgcttcgtg ctgcgcccgg 3780

gctatcaact tcccccggcg ccgaggccga aaccggtcca gcaactgtat gcgaagcccg 3840

ctgccccaac tccgccggcg gtagcgcaac cctcctccac ggagaaagtc agcacgctgg 3900

agtcgcccat cgtggtcgcc tcggtgccga caccggcgcc gatcacaacc agccacgctc 3960

cggccaagaa gcctgaatcc accactgtgc tccccccagc cgcaccggcc aaggatggcc 4020

acccctcttc tcctcccgcg gcttcggcac cgaccaagcc tgcggcctcc gccgtgaagt 4080

ccacgccgcc cactccaccc accgtggctt ccgccccacc ggtcaaggtg ctcacgccgc 4140

cggaaccgag ccggccgctg gcacaggcct ggtcagccga gacgggatca accctgcgcg 4200

acaccttgga agcttgggca aagcgcgcac gctggaccgt ccgctgggag ccgcaggatc 4260

tcaactatcc gatcgaggct ccactgacct tccacggctc cttcgaggac gcggtatccg 4320

agctgttccc cctgtatgac gctgccgaac ggcccttcct ggtgaacgcc agccgcccgc 4380

agtccctgat catcatcaag gagcgcaaga actgatgcgt gcccccctga agaacctctt 4440

ggcttgcctc ctgatccccg cgctggccag ttgctcggtc acgcgggtga acgagtcggc 4500

ggatcgtgtc gaagctacgg cagattccgc gtctacgatc gcagcgcagg tgcgcaacac 4560

ccgaccggat cggcgcgata cggtggtgtt ctccgacaaa ccctgggtca gcacgaaacc 4620

cctaagcgtt tcgcacacct tgtccagtga ctgcatcgtg acgtggcgcc ctgcaggcgc 4680

agcgtcgctg caggaggccg cccaggaagt catcaaccaa tgccacatgg cggtcagtat 4740

cacgcccgac gcgctgaacc cggccgcctt cgccgtgcaa cctcagcagc gcgcgagcaa 4800

cgccccgccg cccatccaag gcggccagga catggccacc atgctgtttc ctgcctccgt 4860

cgccaacggc atgtcgctcg gtgccggcgg cagcatgggg tcgagcttcg ggtcctacgg 4920

tccgcggtct ctgtacaaca tcaaatggaa cggcaaagtc agcgggttcc tcgatctcat 4980

cgccgcccga gccggcgtgt cctggcgcta caacccaacc gagaaaaggg tcgagttc 5038

<210> 14

<211>2790

<212> DNA

<213>人工序列

<400>14

agcatggcga atggcctgcc actgtgtgcc tatcatcaaa gggggcctca atgaccaggc 60

agttgaccac tctcacgctg tgcctgctgc tcgccagctg cacgacccac aaggccgagc 120

cggccaggcc agccttcgac agcagccgca atccagacct gctctctccg gacctgtacc 180

aaaacggtgt acatccgaga aatagcccca gtgcaccatg ggtgctgtgc tagatcctaa 240

tgggccccaa ctggatggtc agcacgtttt aatggcttag gtcttcgacg tgtatctccc 300

gtttaacatg gaacgcacaa aactgtctct tcgcttgcta tccctatctt cacccttgaa 360

tggtgttgcg gatcaagtag ctgaattttg cagagagcat cacataccca gcgtgaatct 420

tgagcgcatg aactcgttat tagagataca tgactcttag ggaatatccc gtgggctcag 480

ccaatcccat tcctgaatat cgagtttaag caaccgtgct tattaccact atatcacagc 540

gcattgacgt gccttcttag tgcattgccc acacattgaa gccatggggt tcaatttcta 600

gagctgaatc ggcactgttt ctgtaccaca ctcaccaatg gagaagtcta aagaaatgcc 660

tcgacttcgc tgctgcccaa ggttgccggg tgacgcacac cgtggaaacg gatgaaggca 720

cgaacccagt tgacataagc ctgttcggtt cgtaaactgt aatgcaagta gcgtatgcgc 780

tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt 840

ttcatggctt gttatgactg tttttttgta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa 900

gcgcgttacg ccgtgggtcg atgtttgatg ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag 960

caacgatgtt acgcagcagg gcagtcgccc taaaacaaag ttaggtggct caagtatggg 1020

catcattcgc acatgtaggc tcggccctga ccaagtcaaa tccatgcggg ctgctcttga 1080

tcttttcggt cgtgagttcg gagacgtagc cacctactcc caacatcagc cggactccga 1140

ttacctcggg aacttgctcc gtagtaagac attcatcgcg cttgctgcct tcgaccaaga 1200

agcggttgtt ggcgctctcg cggcttacgt tctgcccagg tttgagcagc cgcgtagtga 1260

gatctatatc tatgatctcg cagtctccgg cgagcaccgg aggcagggca ttgccaccgc 1320

gctcatcaat ctcctcaagc atgaggccaa cgcgcttggt gcttatgtga tctacgtgca 1380

agcagattac ggtgacgatc ccgcagtggc tctctataca aagttgggca tacgggaaga 1440

agtgatgcac tttgatatcg acccaagtac cgccacctaa caattcgttc aagccgagat 1500

cggcttcccg gccgcggagt tgttcggtaa attgtcacaa aaccaagcaa ggcctcgtta 1560

aatcctacga ggcctttccg tatttataga ataaaaaaat catccccaag ggaattgaaa 1620

acaaataaca agccaaataa aagactgcat acaatcctgt ttttgcaggg gtttcggaga 1680

aaaaacctgt gacccagaac tctttttccg tatattttaa agcgaagtct tcaacaagcc 1740

ttaccgagaa aggaaacagg atagtactga atccagccac taccaagggg ttaactgatg 1800

ccaggcttgg aaatacggag cctttccaag cgactaaaac aaagaagaaa gctccccaga 1860

aaaatttagc ccaatagtat ttaaagctca attagcaccc cgtactgtct gacctgagtt 1920

caacaaagca ttctaaaacg attagaactt ctattttatc catttctaac aacgattccc 1980

acctggctcg ctttaggcgt aacatgaaaa accttcatcg ctcctaatcc gtttccctta 2040

cgcctgcctc gctcaccctc tgcctagtca tcgagaaatc ccctcccctg ttgccgagta 2100

tttcctgctg atgcgtggcg gatggcctgc cactgtgtgc cccatcatca aagggggcct 2160

caatgaccag gcagttgacc actctcacgc tgtgcctgct gctcgccagc tgcacgaccc 2220

acaaggctga gccggccagg ccagccttcg acagcagccg caatccagac ctgctttctc 2280

cggacctgta tccaaacggt gtgcagccgg agaaagagcc cgtagtgcgc tatgggcgct 2340

acaccctggt cagcacccag cctgatgccg gtcaacgcga cctgatggcc cagatcatcg 2400

acgtaaccat cccgtcgagc atgaacccga gcgtcaagga cgccatgcag tacgtgatga 2460

gccgctcggg ttactcgctg tgcccggcag acgccggtca tgtgaacatc ctctacaccc 2520

ggccgctgcc ggcagctcag tacaagctcg gcccgatgac cctgcgcaac accctccagg 2580

tcctctccgg cccagcctgg caggttaagg tcgacgaggt cgcgcggcag gtctgcttcg 2640

tgctgcgccc gggctatcaa cttcccccgg cgccgaggcc gaaaccggtc cagcaactgt 2700

atgcgaagcc cgctgcccca actccgccgg cggtagcgca accctcctcc acggagaaag 2760

tcagcacgct ggagtcgccc atcgtggtcg 2790