本發(fā)明屬于生化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技術(shù)：

N-乙酰氨基葡萄糖是一種有較高甜度的還原性單糖，是生物體內(nèi)許多重要多糖的基本組成單位。研究顯示，N-乙酰氨基葡萄糖具有抑制腫瘤細胞生長的作用；在臨床上可作為風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥物，N-乙酰氨基葡萄糖能夠刺激軟骨細胞合成蛋白多糖，促進軟骨的修復(fù)；同時也能夠治療胃腸道炎癥、功能紊亂以及胃潰瘍等腸胃疾??；N-乙酰氨基葡萄糖具有免疫活性和良好的保健機能作用，可作為嬰幼兒食品添加劑和食品的抗氧化劑，也可作為糖尿病患者的甜味劑來使用，在食品、化工、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

目前生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的工藝主要有三種：化學(xué)合成法、酶解法和微生物發(fā)酵法。

化學(xué)合成法是以D-氨基葡萄糖鹽酸鹽為原料，通過乙?；磻?yīng)制得N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品?；瘜W(xué)合成法工藝中會使用到有毒有機溶劑，有一定的危險性。

酶解法是甲殼素通過酶解反應(yīng)制得N-乙酰氨基葡萄糖。酶解法工藝較簡單，反應(yīng)溫和，單一酶反應(yīng)時間太長水解率太低，一般采用復(fù)合酶，但是酶價格昂貴，而且反應(yīng)時間較長，水解不完全，工業(yè)化生產(chǎn)成本太高。

微生物發(fā)酵法是通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖。申請專利201610064158.4中，首先通過發(fā)酵得到N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液進行滅菌，滅菌后通過陶瓷膜或板框過濾除去菌體等固體雜質(zhì)，濾液中加入殼聚糖絮凝除蛋白，加入活性炭脫色后過濾，再經(jīng)過離子交換混床，料液中加入酒精低溫濃縮結(jié)晶，再用95％以上的乙醇進行漂洗，得到N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)率高的N-乙酰氨基葡萄糖的制備方法。

本發(fā)明的實施例提供了一種純化N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括如下步驟：

(1)加入活性炭對料液進行脫色處理；其中，料液中包括N-乙酰氨基葡萄糖；

(2)對脫色后的料液進行過濾處理，得到的濾液通過電滲析法脫鹽除雜，除去鹽離子以及帶有電荷的有機物，包括蛋白及氨基酸；

(3)將脫鹽后的溶液45-60℃真空濃縮至溶液飽和；

(4)向濃縮后的溶液中加入10％-50％體積的乙醇，降溫至20-25℃，結(jié)晶8-12h，經(jīng)過過濾或離心得到晶體物料；

(5)將得到的晶體物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗后，過濾或離心得到白色固體物料；

(6)將得到的白色固體物料在50-80℃條件下干燥3-5h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為純化N-乙酰氨基葡萄糖。

進一步，步驟(2)中，電滲析法脫鹽包括：采用致密型均相離子交換膜，淡化室與濃縮室體積比控制為3-5:1，脫鹽后溶液的最終電導(dǎo)率控制在300μs/cm以下，工作電壓控制在20-40V，流速控制在18-25L/h。

進一步，步驟(1)中，脫色處理的條件為：在40-60℃條件下攪拌30-60min。

進一步，步驟(1)中，N-乙酰氨基葡萄糖與活性炭的質(zhì)量比為：1:0.03-0.1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是：針對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖，采用電滲析法脫鹽除雜，能夠得到收率75％以上，純度98％以上的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品，產(chǎn)品色澤好，品質(zhì)高，符合相關(guān)質(zhì)量標準。電滲析法脫鹽除雜能量消耗低，對料液適應(yīng)性強，結(jié)構(gòu)緊湊，操作簡單易于實現(xiàn)自動化，水的利用率高，能夠節(jié)約70％左右的水，基本無污染，真正意義上做到了清潔化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面通過各實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但應(yīng)當說明的是，這些實施方式并非對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)這些實施方式所作的功能、方法、或者結(jié)構(gòu)上的等效變換或替代，均屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本實施例提供了一種純化N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括如下步驟：

(1)滅菌、過濾：發(fā)酵液經(jīng)95℃滅菌2h后，通過陶瓷膜過濾除去菌體等雜質(zhì)，并水洗至菌體殘渣中N-乙酰氨基葡萄糖含量低于0.2％，得到澄清濾液。95℃滅菌兩小時是為了使發(fā)酵液中微生物全部滅活不再生長，不影響發(fā)酵液中的N-乙酰氨基葡萄糖的質(zhì)量，也不會再產(chǎn)生新的雜質(zhì)；采用陶瓷膜過濾是為了除掉菌體等固體雜質(zhì)和一些大分子蛋白等可溶性雜質(zhì)，有利于下一步的操作。

(2)脫色：加入活性炭對料液進行脫色處理，加熱至40-60℃，在攪拌轉(zhuǎn)速200-400rpm/min條件下持續(xù)攪拌30-60min，完成脫色，趁熱過濾。其中N-乙酰氨基葡萄糖和活性炭的質(zhì)量比為1:0.03-0.1。加入活性炭的目的是脫除發(fā)酵液中的顏色和部分雜質(zhì)。這對下一步脫鹽除雜的時間有影響，若脫色效果不好，會延長脫鹽除雜的時間，脫色效果不好也會增加醇洗過程的乙醇用量，影響產(chǎn)品的外觀。

(3)過濾、脫鹽：脫色后的料液經(jīng)膜過濾器或板框進行過濾，得到的濾液通過電滲析法脫鹽除雜，除去鹽離子以及帶有電荷的有機物——蛋白、氨基酸等可溶性雜質(zhì)，時間為1h左右。電滲析法所采用的膜為致密型均相離子交換膜，這款膜在有效除去鹽離子以及帶有電荷的有機物——蛋白、氨基酸等可溶性雜質(zhì)的同時，能減少N-乙酰氨基葡萄糖透過膜，從而減少脫鹽除雜過程中N-乙酰氨基葡萄糖的損失；脫鹽除雜過程中，淡化室與濃縮室體積比為3-5:1，這一條件下脫鹽除雜的效果最好，脫鹽除雜時間較短、處理量較大且N-乙酰氨基葡萄糖的損失率最??；脫鹽至溶液的電導(dǎo)率達到300μs/cm以下，蛋白及氨基酸的去除率達到96％以上，工作電壓控制在20-40V，流速控制在18-25L/h。

(4)濃縮：將脫鹽后的溶液直接進行真空濃縮，在真空度大于0.9MPa條件下，溫度控制在45-60℃，真空濃縮至溶液達到飽和。脫鹽后的溶液不加入乙醇直接進行真空濃縮，雖然加入乙醇能夠降低溶液的沸點使得溶液中的水更容易蒸發(fā)出來，但是加入乙醇濃縮會使得晶體容易析出且析出速度較快，這會影響下一步結(jié)晶過程N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品的品質(zhì)，而且加入乙醇也會使得整個成本提高。

(5)結(jié)晶：向濃縮后的溶液中加入10％-50％體積的乙醇，降溫至20-25℃，結(jié)晶8-12h，經(jīng)過過濾或離心得到晶體物料。降溫至20-25℃結(jié)晶和低溫結(jié)晶相比，N-乙酰氨基葡萄糖的收率和品質(zhì)基本一致，采用低溫結(jié)晶能耗高，提高了生產(chǎn)成本。

(6)醇洗：將得到的固體物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗，乙醇的體積為固體物料的1-1.5倍，攪拌速度100-200rpm/min，過濾或離心得到白色固體物料，重復(fù)醇洗3次。采用無水乙醇進行醇洗是因為N-乙酰氨基葡萄糖的水溶性特別好，若不采用無水乙醇，會降低N-乙酰氨基葡萄糖的收率。

(7)烘干：將得到的白色固體物料在50-80℃條件下干燥3-5h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

通過本實施例的方法制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)品色澤佳，質(zhì)量更好，收率更高。整個工藝過程簡單、能耗低、基本無污染，不僅節(jié)約了資源，降低了生產(chǎn)成本，而且綠色環(huán)保。

下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

(1)取3L發(fā)酵液在90℃條件下加熱2h，然后通過陶瓷膜過濾除去菌體等雜質(zhì)，并水洗至菌體殘渣中N-乙酰氨基葡萄糖含量低于0.2％，得到3.5L澄清濾液，濾液中N-乙酰氨基葡萄糖含量為65g/L。

(2)向上述濾液中加入10g活性炭，加熱至40℃，在攪拌轉(zhuǎn)速200rpm/min條件下持續(xù)攪拌30min，完成脫色。

(3)上述脫色后的溶液通過抽濾得到清澈濾液，得到的濾液通過電滲析法脫鹽除雜，淡化室與濃縮室體積比為3:1，工作電壓控制在30V，流速控制在25L/h，脫鹽至溶液電導(dǎo)率達到200μs/cm，蛋白及氨基酸的去除率達到97.3％。

(4)將上述脫鹽后的溶液，在真空度0.92MPa、溫度60℃條件下，真空濃縮至溶液達到飽和。

(5)向上述濃縮后的溶液中加入20％體積的乙醇，降溫至20℃，結(jié)晶8h，經(jīng)過過濾得到晶體物料。

(6)將上述得到的物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗，乙醇的體積為固體物料的1.5倍，攪拌速度100rpm/min，過濾得到白色固體物料，重復(fù)醇洗3次。

(7)將上述得到的白色固體物料在70℃條件下干燥3h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

產(chǎn)品的收率為81.55％，純度為99.6％。

實施例2

(1)取5L發(fā)酵液在95℃條件下加熱2h，然后通過陶瓷膜過濾除去菌體等雜質(zhì)，并水洗至菌體殘渣中N-乙酰氨基葡萄糖含量低于0.2％，得到6.2L澄清濾液，濾液中N-乙酰氨基葡萄糖含量為72g/L。

(2)向上述濾液中加入13g活性炭，加熱至60℃，在攪拌轉(zhuǎn)速400rpm/min條件下持續(xù)攪拌30min，完成脫色。

(3)上述脫色后的溶液通過板框過濾得到清澈濾液，得到的濾液通過電滲析法脫鹽除雜，淡化室與濃縮室體積比為4:1，工作電壓控制在20V，流速控制在18L/h，脫鹽至溶液電導(dǎo)率達到280μs/cm，蛋白及氨基酸去除率達到96.8％。

(4)將上述脫鹽后的溶液，在真空度0.95MPa、溫度45℃條件下，真空濃縮至溶液達到飽和。

(5)向上述濃縮后的溶液中加入10％體積的無水乙醇，降溫至20℃，結(jié)晶10h，經(jīng)過過濾得到晶體物料。

(6)將上述得到的物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗，乙醇的體積為固體物料的1.5倍，攪拌速度200rpm/min，過濾得到白色固體物料，重復(fù)醇洗3次。

(7)將上述得到的白色固體物料在65℃條件下干燥4h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

產(chǎn)品的收率為78.8％，純度為100.5％。

實施例3

(1)取10L發(fā)酵液在95℃條件下加熱2h，然后通過陶瓷膜過濾除去菌體等雜質(zhì)，并水洗至菌體殘渣中N-乙酰氨基葡萄糖含量低于0.2％，得到12L澄清濾液，濾液中N-乙酰氨基葡萄糖含量為78g/L。

(2)向上述濾液中加入70g活性炭，加熱至50℃，在攪拌轉(zhuǎn)速300rpm/min條件下持續(xù)攪拌40min，完成脫色。

(3)上述脫色后的溶液通過板框過濾得到清澈濾液，得到的濾液通過電滲析法脫鹽除雜，淡化室與濃縮室體積比為5:1，工作電壓控制在40V，流速控制在25L/h，脫鹽至溶液電導(dǎo)率達到150μs/cm，蛋白及氨基酸的去除率達到98.1％。

(4)將上述脫鹽后的溶液，在真空度0.92MPa、溫度55℃條件下，真空濃縮至溶液達到飽和。

(5)向上述濃縮后的溶液中加入50％體積的無水乙醇，降溫至25℃，結(jié)晶10h，經(jīng)過過濾得到晶體物料。

(6)將上述得到的物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗，乙醇的體積為固體物料的1倍，攪拌速度150rpm/min，過濾得到白色固體物料，重復(fù)醇洗3次。

(7)將上述得到的白色固體物料在80℃條件下干燥2h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

產(chǎn)品的收率為82.37％，純度為99.8％。

實施例4

(1)取20L發(fā)酵液在90℃條件下加熱2h，然后通過陶瓷膜過濾除去菌體等雜質(zhì)，并水洗至菌體殘渣中N-乙酰氨基葡萄糖含量低于0.2％，得到23.8L澄清濾液，濾液中N-乙酰氨基葡萄糖含量為88g/L。

(2)向上述濾液中加入209g活性炭，加熱至60℃，在攪拌轉(zhuǎn)速400rpm/min條件下持續(xù)攪拌60min，完成脫色。

(3)上述脫色后的溶液通過板框過濾得到清澈濾液，得到的濾液通過電滲析設(shè)備脫鹽，淡化室與濃縮室體積比為4:1，工作電壓控制在20V，流速控制在20L/h，脫鹽至溶液電導(dǎo)率達到85μs/cm，蛋白及氨基酸的去除率達到98.5％。

(4)將上述脫鹽后的溶液，在真空度0.95MPa、溫度50℃條件下，真空濃縮至溶液達到飽和。

(5)向上述濃縮后的溶液中加入30％體積的無水乙醇，降溫至25℃，結(jié)晶12h，經(jīng)過過濾得到晶體物料。

(6)將上述得到的物料加入到無水乙醇溶液中進行醇洗，乙醇的體積為固體物料的1.5倍，攪拌速度100rpm/min，過濾得到白色固體物料，重復(fù)醇洗3次。

(7)將上述得到的白色固體物料在50℃條件下干燥5h，得到純白色結(jié)晶粉末，即為制備得到的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品。

產(chǎn)品的收率為85.39％，純度為101.2％。

本實施例提供的純化N-乙酰氨基葡萄糖的方法，采用了陶瓷膜過濾除雜，活性炭脫色，電滲析脫除鹽離子以及帶電荷的小分子蛋白和氨基酸，濃縮結(jié)晶，洗滌烘干，避免了有毒化學(xué)試劑的使用，整個工序簡單高效，收率可達75％以上，電滲析設(shè)備能耗低，基本無污染，綠色環(huán)保，真正做到了清潔化生產(chǎn)，所得的N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品質(zhì)量好。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明。