本發(fā)明涉及一種由玄參為原料提取制備可作為對(duì)照品的高純度哈巴苷的制備方法。

背景技術(shù)：

玄參為玄參科草本植物(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)的根莖，味甘、苦、咸，性微寒，有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)的功效，玄參作為常用中藥材，對(duì)于其化學(xué)成分研究日益劇增。

目前針對(duì)哈巴苷提取方法有溶劑直接提取法，水提醇沉和微波提取等方法。傳統(tǒng)工藝采用水以及水醇混合溶液提取，再以大孔吸附樹脂的方法處理，此法脫色效果差，洗脫線性不佳。例如，CN104327127A公開了一種利用高速逆流色譜分離純化制備安哥拉苷C、桃葉珊瑚苷和哈巴苷的方法，其包括以下步驟：(1)將玄參藥材粉碎成粗粉，加入體積分?jǐn)?shù)30％的乙醇溶劑中，加熱至回流提取1-3次，提取液趁熱過濾，冷卻，濾液減壓除去溶劑，得到乙醇提取物；(2)將乙醇提取物加入填充有大孔吸附樹脂的色譜柱中，用水和乙醇的混合溶劑梯度洗脫，分別收集含有安哥拉苷C的洗脫液、含有桃葉珊瑚苷和哈巴苷的洗脫液，減壓回收乙醇，干燥、分別得到安哥拉苷C粗提物、桃葉珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物；(3)將安哥拉苷C粗提物進(jìn)行高速逆流色譜分離，以體積比為4：6：10的正丁醇、乙酸乙酯、水組成高速逆流溶劑體系，將所述高速逆流溶劑體系混合充分后靜置，按上下兩相分開，取上相為固定相，下相為流動(dòng)相，將固定相充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，設(shè)定高速逆流色譜儀，在500～1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.5～5ml/min的流速注入流動(dòng)相，以波長190-380nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取安哥拉苷C粗提物，用上相、下相體積比1：1的混合溶劑溶解后進(jìn)樣，根據(jù)紫外檢測(cè)器光譜圖的峰形收集含安哥拉苷C的流出液，濃縮、干燥，制得安哥拉苷C粗品；(4)將安哥拉苷C粗品用中低壓制備色譜進(jìn)行純化，用水、甲醇體積比1：1的混合溶劑進(jìn)行等度洗脫，流速35mL/min，根據(jù)波長210nm的紫外檢測(cè)器的光譜圖的峰形收集含安哥拉苷C的洗脫液、減壓濃縮，冷凍干燥，制得安哥拉苷C純品；(5)將桃葉珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物進(jìn)行高速逆流色譜分離，以體積比為2:7:8:8的正丁醇、乙醇、硫酸銨飽和溶液、水組成高速逆流溶劑體系，將所述高速逆流溶劑體系混合充分后靜置，按上下兩相分開，取下相為固定相，上相為流動(dòng)相，將固定相充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，設(shè)定高速逆流色譜儀，在500～1000r/min轉(zhuǎn)速下，以0.5～5ml/min的流速注入流動(dòng)相，以波長190-380nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，當(dāng)明顯有流動(dòng)相流出時(shí)，取桃葉珊瑚苷和哈巴苷混合粗提物，用上相、下相體積比1：1的混合溶劑溶解后進(jìn)樣，定時(shí)收集流出液，用HPLC檢測(cè)，合并相同成分的流出液，分別得到含桃葉珊瑚苷的流出液和含哈巴苷的流出液，濃縮、干燥，分別制得桃葉珊瑚苷粗品A、哈巴苷粗品；(6)將桃葉珊瑚苷粗品A通過中低壓制備色譜分離，用水和甲醇的混合溶劑梯度洗脫，流速35mL/min，波長210nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，定時(shí)收集洗脫液，用HPLC檢測(cè)，合并相同成分的洗脫液，收集得到含桃葉珊瑚苷的洗脫液，濃縮，干燥，制得桃葉珊瑚苷粗品B；(7)桃葉珊瑚苷粗品B再通過制備液相色譜進(jìn)行純化，以甲醇、水體積比5:95的混合溶劑等度洗脫，流速3mL/min，根據(jù)波長210nm的紫外檢測(cè)器的光譜圖的峰形收集含桃葉珊瑚苷的洗脫液，濃縮，干燥，制得桃葉珊瑚苷純品；(8)取步驟(5)得到的哈巴苷粗品，通過制備液相色譜進(jìn)行純化，以甲醇、水體積比12:88的混合溶劑等度洗脫，流速3mL/min，根據(jù)波長210nm的紫外檢測(cè)器的光譜圖的峰形收集含哈巴苷的洗脫液，濃縮，干燥，制得哈巴苷純品。

上述專利方法雖然最終獲得了純度大于等于95％的哈巴苷，但是操作過程非常復(fù)雜并對(duì)儀器和設(shè)備要求較高，可控性差，不適于放大生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡(jiǎn)單可控適于放大生產(chǎn)的高純度哈巴苷的制備方法。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種高純度哈巴苷的制備方法，其包括以下步驟：

(1)原料提?。簩⑿⑺幉姆鬯槌纱址?，采用水或乙醇水溶液進(jìn)行初提，并濃縮得到初提液；

(2)樹脂脫色富集純化：將所述初提液通過活化好的陽離子交換樹脂，然后依次水洗和用體積分?jǐn)?shù)為35％～45％的乙醇水溶液進(jìn)行解析得到含哈巴苷的流份，并濃縮得到哈巴苷粗品；

(3)硅膠柱層析：采用300-400目硅膠填充柱對(duì)哈巴苷粗品進(jìn)行層析并對(duì)收集液進(jìn)行濃縮獲得濃縮物，其中采用氯仿：甲醇：水三者的混合液的下層為洗脫溶劑；

(4)反相柱層析：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠層析柱，以乙腈水溶液為洗脫劑，對(duì)所述濃縮物進(jìn)行反相層析獲得收集液，經(jīng)旋干即得可作為對(duì)照品應(yīng)用的哈巴苷。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述陽離子交換樹脂的型號(hào)為XAD-8型。該型號(hào)的陽離子交換樹脂的脫色、純化以及富集效果最佳。

優(yōu)選地，步驟(2)中，將初提液以0.5～1BV的速度通過陽離子交換樹脂。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為38％～42％。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，步驟(2)實(shí)施如下：將初提液以0.5～1BV的速度通過活化好的XAD-8型陽離子交換樹脂，然后分別用1～3倍量柱體積的水洗脫除去雜質(zhì)，再用體積分?jǐn)?shù)為38～42％的乙醇溶液解析得到含哈巴苷的流份，然后63-65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/15～1/20體積。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，還將所得哈巴苷粗品與2～4倍(優(yōu)選3倍)質(zhì)量的100-200目硅膠混合均勻獲得粗品硅膠混合物，在步驟(3)中，將所述粗品硅膠混合物加入到硅膠填充柱中。

優(yōu)選地，步驟(3)中，氯仿：甲醇：水三者的體積比為60～70:30～40:10。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，氯仿：甲醇：水三者的體積比為65:35:10。

進(jìn)一步地，步驟(4)中，十八烷基硅烷鍵合硅膠層析柱的柱規(guī)格可選40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm。

優(yōu)選地，步驟(4)中，乙腈水溶液的質(zhì)量濃度為10％～20％。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來實(shí)施，優(yōu)選地，步驟(1)中，采用體積分?jǐn)?shù)為60％～70％的乙醇水溶液進(jìn)行提取。

由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明工藝在保證和進(jìn)一步提高產(chǎn)品純度的前提下，工藝步驟明顯減少，操作更加簡(jiǎn)單，對(duì)儀器和設(shè)備要求不高，可控性好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

本申請(qǐng)發(fā)明人在其長期大量研究中意外發(fā)現(xiàn)采用特定陽離子交換樹脂(XAD-8型陽離子交換樹脂)來處理玄參提取物可實(shí)現(xiàn)脫色富集純化一次完成，該樹脂既可以脫去玄參中大量黑色素樣物質(zhì)，又可以得到品質(zhì)良好的哈巴苷粗品，這對(duì)于后期處理純化有至關(guān)重要的作用。在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步提供一種良好可操控的常規(guī)提取制備方式，后續(xù)只需要少數(shù)常規(guī)2-3個(gè)步驟即可得到哈巴苷純度為98％以上的產(chǎn)物，這相對(duì)于其他方法具有良好的可控效果，且目前已成功放大到千克級(jí)別。因此本發(fā)明是相較現(xiàn)有工藝而言獲取高純哈巴苷明顯簡(jiǎn)化和有效的方法，這對(duì)于玄參相關(guān)化學(xué)成分的藥理藥效研究有重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價(jià)值。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。以下實(shí)施例中，所采用的XAD-8型陽離子交換樹脂購自sigma公司。使用前進(jìn)行活化處理，活化方法為：0.01mol/L的氫氧化鈉溶液洗脫4個(gè)柱長體積，再以蒸餾水洗脫至中性。

實(shí)施例1

一種哈巴苷對(duì)照品的高效制備方法，其包括以下步驟：

(1)將1kg玄參藥材粉碎成粗粉，按照質(zhì)量體積比1kg/L加入10倍量的體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液10L，滲濾提取3次，每次4小時(shí)，合并提取液以65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/10體積，過濾除去機(jī)械雜質(zhì)顆粒，得到初提液；

(2)將步驟(1)所得初提液以1BV/h速度通過活化好的XAD-8型陽離子交換樹脂處理，先水洗脫除去雜質(zhì)和糖類，再以用體積分?jǐn)?shù)為40％的乙醇溶液解析得到含哈巴苷的粗品，然后65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/20體積，加入3倍量的100-200目的硅膠，混合均勻得到粗品硅膠混合物并干燥研磨后備用；

(3)選直徑7.5cm和高度45cm的玻璃層析柱，然后以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合溶液，取下層溶液加入300-400目硅膠1千克勻漿后注入玻璃層析柱，以壓縮空氣加壓壓實(shí)至硅膠完全沉淀平整，得到硅膠填充柱，然后將步驟(2)所制備的粗品硅膠混合物注入硅膠填充柱頂，然后再以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合的混合液，取下層進(jìn)行洗脫，以TLC指導(dǎo)跟蹤合并，再以65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后得到哈巴苷粗品濃縮物；

(4)步驟(3)的濃縮物過十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(反相硅膠柱)，柱規(guī)格為40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm；并以15％的乙腈溶液洗脫，TLC/HPLC跟蹤檢測(cè)流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.21％以上純度樣品1克。

實(shí)施例2

一種哈巴苷對(duì)照品的高效制備方法，其包括以下步驟：

(1)將3kg玄參藥材粉碎成粗粉，按照質(zhì)量體積比1kg/L加入15倍量的體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液30L，滲濾提取3次，每次4小時(shí)，合并提取液，65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/10體積，過濾除去機(jī)械雜質(zhì)顆粒，得到初提液；

(2)將步驟(1)所得初提液1BV/h速度通過活化XAD-8型陽離子交換樹脂處理，水洗脫除去雜質(zhì)和糖類，再用體積分?jǐn)?shù)為40％的乙醇溶液解析得到哈巴苷粗品，然后65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/20體積。加入3倍量的100-200目的硅膠混合均勻得到粗品硅膠混合物并干燥研磨后備用，

(3)選直徑8.5和高度68cm的玻璃層析柱，然后以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合，取下層溶液加入300-400目硅膠2.5千克勻漿后注入玻璃層析柱，以壓縮空氣加壓壓實(shí)至硅膠完全沉淀平整，得到硅膠填充柱，然后將步驟(2)所得粗品硅膠混合物注入硅膠填充柱頂，然后再以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合的混合液的下層來洗脫，以TLC指導(dǎo)跟蹤合并，再以薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后得到哈巴苷粗品濃縮物；

(4)步驟(3)的濃縮物過十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(反相硅膠柱)，柱規(guī)格為40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm，以15％的乙腈溶液洗脫，TLC,HPLC跟蹤檢測(cè)流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.37％以上純度樣品3.1克。

實(shí)施例3

一種哈巴苷對(duì)照品的高效制備方法，其包括以下步驟：

(1)將10kg玄參藥材粉碎成粗粉，按照質(zhì)量體積比1kg/L加入10倍量的體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液，滲濾提取3次，每次4小時(shí)，合并提取液，65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/10體積，過濾除去機(jī)械雜質(zhì)顆粒，得到初提液；

(2)將步驟(1)所得初提液以1BV/h的速度通過活化XAD-8型陽離子交換樹脂處理，水洗脫除雜質(zhì)和糖類，再用體積分?jǐn)?shù)為40％的乙醇溶液解析得到哈巴苷粗品，然后65攝氏度薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原提取液1/20體積。加入3倍量的100-200目的硅膠混合均勻得到粗品硅膠混合物干燥研磨后備用；

(3)選直10cm徑和高度90cm的玻璃層析柱，然后以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合，取下層溶液加入300-400目硅膠18千克勻漿后注入玻璃層析柱，以壓縮空氣加壓壓實(shí)至硅膠完全沉淀平整，得到硅膠填充柱，然后將步驟(2)所得粗品硅膠混合物注入硅膠填充柱頂，然后再以氯仿：甲醇：水按體積比65:35:10混合的混合液的下層來洗脫，以TLC指導(dǎo)跟蹤合并，再以薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后得到哈巴苷粗品濃縮物；

(4)步驟(3)的濃縮物過以十八烷基硅烷鍵合硅膠(反相硅膠柱)，柱規(guī)格為40cm×10cm、40cm×9cm或30cm×10cm；以15％的乙腈溶液洗脫，HPLC跟蹤檢測(cè)流份，合并，蒸干即得哈巴苷98.46％以上純度樣品12.6克。

以上對(duì)本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。