本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種環(huán)金屬化釕配合物，還涉及該環(huán)金屬化釕配合物的合成方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是當(dāng)今世界直接危及人類生命的一種常見疾病，尋找高效低毒、能作用于特定靶標(biāo)的新型抗腫瘤藥一直是人類不懈奮斗的目標(biāo)。

例如，順鉑為治療多種實體瘤的一線用藥，與VP－16聯(lián)合(EP方案)為治療SCLC或NSCLC一線方案，聯(lián)合MMC、IFO(IMP方案)，或NVB等方案為治療NSCLC常用方案，以DDP為主的聯(lián)合化療亦為晚期卵巢癌、骨肉瘤及神經(jīng)母細胞瘤的主要治療方案，與ADM、CTX等聯(lián)用對多部位鱗狀上皮癌、移行細胞癌有效，如頭頸部、宮頸、食管及泌尿系腫瘤等。然而，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)鉑類抗癌藥物在使用過程中會導(dǎo)致腫瘤細胞逐漸累積耐藥性，造成該藥物對腫瘤細胞的殺傷作用降低，從而使得藥物逐漸失效。

隨著科研的進展，大多數(shù)報告發(fā)現(xiàn)了一系列釕抗腫瘤藥物，其中所采用的釕配合物對正常細胞的毒性小、易于被腫瘤組織吸收，并且對轉(zhuǎn)移瘤具有明顯的效果；國際上也普遍認(rèn)為，釕配合物將成為最有前途的抗腫瘤藥物之一。

目前研究發(fā)現(xiàn)釕配合物可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤死亡，如：抑制端粒酶活性，抑制血管形成，線粒體通路，周期阻止等。隨著對釕配合物抑制腫瘤細胞增值作用機制研究的深入，再加上越來越多各種類型的具有抗腫瘤活性的釕配合物被報道，為配合機制性研究，以獲得易跨膜、高靶向、低毒性的結(jié)構(gòu)修飾也成為一項非常重要的研究內(nèi)容。

環(huán)金屬化釕配合物(Cyclo-Ru)應(yīng)用于抗腫瘤研究起步較晚，近年來，相關(guān)的研究報道日漸增多，例如，Pfeffer課題組于2007年合成了19個Cyclo-Ru，通過活性篩選發(fā)現(xiàn)以phpy(2-phenylpyridine)作為C-N環(huán)金屬化配體的RDC11具有較好的抗腫瘤活性。隨后該課題組又設(shè)計合成了一系列雙齒C-N型，三齒N–C–N和N–N–C型的Cyclo-Ru。體外活性測試表明這一系列Cyclo-Ru均具有非常理想的抗腫瘤活性，其中的一部分配合物的IC50值達到納摩爾級別。中山大學(xué)巢暉教授課題組設(shè)計合成了一系列結(jié)構(gòu)相似的多吡啶類Cyclo-Ru，與對應(yīng)的多吡啶釕配合物比較，前者脂溶性增加，靶向細胞核，抗腫瘤活性顯著提高。

異喹啉及其衍生物是一類具有雜環(huán)氮結(jié)構(gòu)的生物堿，廣泛存在于自然界中，具有多種生理活性，如：抗癌、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。異喹啉類生物堿可以通過多種途徑抑制腫瘤的增殖，遷移，侵襲；如：周期阻滯；誘導(dǎo)細胞凋亡；抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)的活性；抑制端粒酶及拓撲異構(gòu)酶的活性等。近年來，越來越多的研究表明異喹啉類生物堿還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥性；所以，異喹啉及其衍生物是一種用于釕配合物的有效配體之一。

因此，如何設(shè)計出一種新型的環(huán)金屬化釕配合物并加以適當(dāng)修飾，使得其既具有優(yōu)異的抗腫瘤活性，也具有易跨膜、高靶向、低毒性的優(yōu)點，成為當(dāng)今醫(yī)藥研發(fā)人員的研究重點之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案基于環(huán)金屬化釕配合物的優(yōu)勢及異喹啉配體的優(yōu)越功能，擬實施一個高靶向性的配合物設(shè)計策略；據(jù)此，發(fā)明人成功地將異喹啉及其衍生物與環(huán)金屬化的概念相結(jié)合，設(shè)計并合成出新型釕類配合物。

因此，本發(fā)明的第一方面，提供了一種環(huán)金屬化釕配合物，其化學(xué)通式為：[Ru(L)₂(PhIQ-R)](PF₆)，其中，PhIQ-R作為主配體，當(dāng)R＝H時，PhIQ-R為1-苯基-異喹啉(即1-phenylisoquinoline)，當(dāng)R＝Me時，PhIQ-R為1-對甲苯基-異喹啉(即1-(p-tolyl)isoquinoline)；其中，L為輔助配體。

優(yōu)選地，在上述環(huán)金屬化釕配合物中，所述輔助配體選自2,2-聯(lián)吡啶(bpy)或鄰菲羅啉(phen)。其中，所述2,2-聯(lián)吡啶的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，所述鄰菲羅啉的結(jié)構(gòu)式如下：

進一步優(yōu)選地，在上述環(huán)金屬化釕配合物中，所述環(huán)金屬化釕配合物中的陽離子具有式Ⅰ或式Ⅱ或式III或式IV所示的結(jié)構(gòu)：

顯然，所述環(huán)金屬化釕配合物[Ru(L)₂(PhIQ-R)](PF₆)中的陰離子均為PF₆^-。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的環(huán)金屬化釕配合物的合成方法，包括以下步驟：

S1：在弱堿存在下，將苯乙胺與對甲苯磺酰氯反應(yīng)，生成N-Ts-β-苯乙胺；

S2：在惰性氣體保護下，先將N-Ts-β-苯乙胺與苯甲醛或?qū)谆郊兹┓磻?yīng)，生成中間體，再加入強堿與非質(zhì)子極性溶劑回流反應(yīng)，制得1-苯基-異喹啉或1-對甲苯基-異喹啉；

S3：在惰性氣體保護下，將cis-[Ru(L)₂Cl₂]·2H₂O與1-苯基-異喹啉或1-對甲苯基-異喹啉回流反應(yīng)，后處理，滴加KPF₆，靜置重結(jié)晶，制得最終產(chǎn)品[Ru(L)₂(PhIQ-R)](PF₆)。

優(yōu)選地，在上述合成方法中，所述cis-[Ru(L)₂Cl₂]·2H₂O為cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O或cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O。

優(yōu)選地，在上述合成方法中，所述[Ru(L)₂(PhIQ-R)](PF₆)選自以下任一種：

[Ru(bpy)₂(PhIQ-H)](PF₆)，在本說明書中簡稱為Ru1；

[Ru(bpy)₂(PhIQ-Me)](PF₆)，在本說明書中簡稱為Ru2；

[Ru(phen)₂(PhIQ-H)](PF₆)，在本說明書中簡稱為Ru3；

[Ru(phen)₂(PhIQ-Me)](PF₆)，在本說明書中簡稱為Ru4。

優(yōu)選地，在上述合成方法中，所述弱堿為三乙胺，所述惰性氣體為氬氣，所述強堿為氫氧化鈉，所述非質(zhì)子極性溶劑為DMSO。

具體地，所述Ru1～Ru4的優(yōu)選合成方法的操作步驟分別詳述如下：

(1)環(huán)金屬化釕配合物Ru1的合成包括以下步驟：

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

將苯乙胺、三乙胺，溶于二氯甲烷中，然后在-8～-15℃下慢慢加入對甲苯磺酰氯，恢復(fù)室溫，攪拌4～6h，后處理，析出白色沉淀，靜置抽濾，得N-Ts-β-苯乙胺。

②1-苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1-phenyl-2-tosyl-1,2,3,4-tetrahydr oisoquinoline)的合成

在氬氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺、苯甲醛溶于甲苯中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑，在60～70℃下攪拌回流，反應(yīng)完全后制得1-苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉，即S2中所述的中間體，可不經(jīng)純化直接進行下步反應(yīng)。

③1-苯基-異喹啉的合成

將1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉溶于DMSO中，接著加入25～35％的NaOH水溶液，在120～150℃下攪拌回流，反應(yīng)完全后，得到1-苯基-異喹啉。

④cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O的合成(亦可直接購買)

將RuCl₃·nH₂O、bpy溶于DMF，加入過量的LiCl，氬氣保護下，逐步升溫至140℃，然后攪拌回流8h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸去除大部分DMF，加入丙酮，攪拌、靜置、抽濾得粗產(chǎn)品，純化粗產(chǎn)品得cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O。

⑤[Ru(bpy)₂(PhIQ-H)](PF₆)的合成

在氬氣保護下，將cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O與1-苯基-異喹啉按摩爾比1：1溶于無水乙醇中，然后在78℃下攪拌回流7～9h；反應(yīng)結(jié)束后過濾、旋干、硅膠柱層析，得Ru1粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得最終產(chǎn)品[Ru(bpy)₂(PhIQ-H)](PF₆)，即Ru1。

(2)環(huán)金屬化釕配合物Ru2的合成包括以下步驟：

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

同Ru1的合成步驟①。

②1-對甲苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1-(p-tolyl)-2-tosyl-1,2,3,4-tetr ahydroisoquinoline)的合成

在氬氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺、對甲基苯甲醛溶于甲苯中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑，在60～70℃下攪拌回流，反應(yīng)完全后制得1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉，即S2中所述的中間體，可不經(jīng)純化直接進行下步反應(yīng)。

③1-對甲苯基-異喹啉的合成

將1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉溶于DMSO中，接著加入25～35％的NaOH水溶液，在120～150℃下攪拌回流，反應(yīng)完全后，得到1-對甲苯基-異喹啉。

④cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O的合成(亦可直接購買)

同Ru1的合成步驟④。

⑤[Ru(bpy)₂(PhIQ-Me)](PF₆)的合成

在氮氣保護下，將cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O與1-對甲苯基-異喹啉按摩爾比1：1溶于無水乙醇中，然后在78℃下攪拌回流7～9h；反應(yīng)結(jié)束后過濾、旋干、硅膠柱層析，得Ru2粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得最終產(chǎn)品[Ru(bpy)₂(PhIQ-Me)](PF₆)，即Ru2。

(3)環(huán)金屬化釕配合物Ru3的合成包括以下步驟：

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

同Ru1的合成步驟①。

②1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1-phenyl-2-tosyl-1,2,3,4-tetrahydr oisoquinoline)的合成

同Ru1的合成步驟②。

③1-苯基-異喹啉的合成

同Ru1的合成步驟③。

④cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O的合成(亦可直接購買)

將RuCl₃·nH₂O、phen溶于DMF，加入過量的LiCl，氮氣保護下，逐步升溫至140℃，然后攪拌回流8h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸去除大部分DMF，加入丙酮，攪拌、靜置、抽濾得粗產(chǎn)品，純化粗產(chǎn)品得cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O。

⑤[Ru(phen)₂(PhIQ-H)](PF₆)的合成

在氮氣保護下，將cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O與1-苯基-異喹啉按摩爾比1：1溶于無水乙醇中，然后在78℃下攪拌回流7～9h；反應(yīng)結(jié)束后過濾、旋干、硅膠柱層析，得Ru3粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得最終產(chǎn)品[Ru(phen)₂(PhIQ-H)](PF₆)，即Ru3。

(4)環(huán)金屬化釕配合物Ru4的合成包括以下步驟：

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

同Ru1的合成步驟①。

②1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1-(p-tolyl)-2-tosyl-1,2,3,4-tetr ahydroisoquinoline)的合成

在氮氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺、對甲基苯甲醛溶于甲苯中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑，在60～70℃下攪拌回流，反應(yīng)完全后制得1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉，即S2中所述的中間體，可不經(jīng)純化直接進行下步反應(yīng)。

③1-對甲苯基-異喹啉的合成

同Ru2的合成步驟③。

④cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O的合成(亦可直接購買)

同Ru3的合成步驟④。

⑤[Ru(phen)₂(PhIQ-Me)](PF₆)的合成

在氬氣保護下，將cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O與1-對甲苯基-異喹啉按摩爾比1：1溶于無水乙醇中，然后在78℃下攪拌回流7～9h；反應(yīng)結(jié)束后過濾、旋干、硅膠柱層析，得Ru4粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得最終產(chǎn)品[Ru(phen)₂(PhIQ-Me)](PF₆)，即Ru4。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的環(huán)金屬化釕配合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，在上述應(yīng)用中，所述的腫瘤包括肝癌腫瘤、乳腺癌腫瘤、肺癌腫瘤及肺癌耐藥細胞株。

綜上所述，本發(fā)明所提供的環(huán)金屬化釕配合物[Ru(L)₂(PhIQ-R)](PF₆)具有比順鉑更優(yōu)越的抗腫瘤活性，并且，其易于被合成；本發(fā)明所述的環(huán)金屬化釕配合物既具有優(yōu)異的抗腫瘤活性，也具有易跨膜、高靶向、低毒性的優(yōu)點，適于制備各種抗癌藥物或DNA插入試劑，從而具有良好的臨床應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述Ru1的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明所述Ru2的合成路線圖；

圖3為本發(fā)明所述Ru3的合成路線圖；

圖4為本發(fā)明所述Ru4的合成路線圖；

圖5為Ru1的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)圖；

圖6為Ru2的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)圖；

圖7為Ru3的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)圖；

圖8為Ru4的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)圖；

圖9為Ru1～Ru4的紫外可見吸收光譜圖；

圖10為彗星實驗檢測Ru1誘導(dǎo)A549細胞核發(fā)生濃縮斷裂圖；

圖11為彗星實驗檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞核發(fā)生濃縮斷裂圖；

圖12為Hoechst33342染色檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生染色體濃縮、DNA斷裂圖；

圖13為DCFH-DA染色(顯微鏡觀察)檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞內(nèi)活性氧水平圖；

圖14為DCFH-DA染色(流式細胞儀觀察)檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞內(nèi)活性氧水平圖；

圖15為JC-1(流式細胞儀)檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞線粒體膜電位圖；

圖16為Annexin V-FITC/PI雙染檢測Ru1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡的散點圖；

圖17為Annexin V-FITC/PI雙染檢測Ru3誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡的散點圖；

圖18為Ru3對DNA損傷相關(guān)蛋白表達的影響圖；

圖19為Ru3對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實施例1

環(huán)金屬化釕配合物Ru1的合成

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

將苯乙胺(12.1g,100mmol)、三乙胺(30.3g，300mmol)，溶于85ml二氯甲烷中，然后在-15℃下慢慢加入對甲苯磺酰氯(18.05g，95mmol)，滴加完畢后，撤去冷凍，恢復(fù)室溫(25℃)，攪拌6h，TLC檢測原料點消失(苯乙胺)，表示反應(yīng)完全；然后，加100ml水洗，用25ml 1M的HCl溶液洗滌至溶液呈弱酸性，旋干溶劑，得油狀物，再向其中加入10ml的乙醇溶解，70℃熱水浴溶解；接著加入50ml水，攪拌，析出白色沉淀，放入4℃的冰箱中靜置，抽濾，得N-Ts-β-苯乙胺，收率為90％。

②1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1-phenyl-2-tosyl-1,2,3,4-tetrahydr oisoquinoline)的合成

在氬氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺(1.37g，5mmol)、苯甲醛(0.54g，5.1mmol)溶于15ml甲苯中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑(1.065g，7.5mmol)，先于室溫氬氣保護下，攪拌20min，接著在70℃下攪拌回流8小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫；加入15ml水，劇烈攪拌，分出有機層，水層用甲苯(2x6ml)萃取2次；合并有機相，飽和食鹽水10ml洗滌，無水MgSO₄干燥，蒸干溶劑得固體粗產(chǎn)物，最后用乙醇：水＝9:1重結(jié)晶得白色固體，即1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉，收率89％。

③1-苯基-異喹啉的合成

將1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(2mmol，0.73g)溶于6ml DMSO中，接著加入25％的NaOH水溶液0.8ml，在130℃下攪拌加熱回流3h，TLC檢測反應(yīng)完全后，降至室溫，加入30ml水，攪拌，靜置，抽濾，濾液用HCl中和，再用乙酸乙酯萃取(2x20ml)，合并有機相，旋干得油狀物；硅膠柱層析，得白色固體，即1-苯基-異喹啉，收率92％，其作為主配體。

④cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O的合成

將RuCl₃·nH₂O(0.6g,2mmol)、bpy(0.624g,4mmol)溶于10ml DMF，一并加入過量的LiCl(1.26g，30mmol)，氬氣保護下，先于室溫下攪拌均勻，充分溶解，再逐步升溫：60℃，30min；70℃，30min；90℃，60min；110℃，30min；直至升溫至140℃，然后攪拌回流8h，反應(yīng)結(jié)束后，降至室溫，轉(zhuǎn)移入單口燒瓶，80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大多數(shù)的DMF，剩余物自來水沖涼，再加入30ml丙酮，充分?jǐn)嚢瑁湃氡?℃靜置過夜，抽濾，5ml冰水洗，真空干燥，即得cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O，收率86％。

⑤[Ru(bpy)₂(PhIQ-H)](PF₆)的合成

在氬氣保護下，將cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O(0.052g，0.1mmol)與三氟甲磺酸銀(0.064g，0.25mmol)溶于10ml無水乙醇中(分子篩干燥的)，于80℃加熱回流3h；然后加入1-苯基-異喹啉(0.0205g，0.1mmol)溶于無水乙醇中，并向其中加入四甲基氫氧化銨10％的甲醇溶液(0.012g，0.13mol)，在78℃下攪拌回流9h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氯化銀，5ml乙醇洗，合并濾液，旋干，硅膠柱層析(乙腈:甲苯＝1:2)，風(fēng)干，得Ru1粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得配合物Ru1，收率98％；Ru1分子式：C₃₅H₂₆F₆N₅PRu，元素分析理論值：C，55.12％；H，3.44％；N，9.18％；元素分析實驗值：C，55.23％；H，3.41％；N，9.20％。ESI-MS(CH₃CN)：C₃₅H₂₆F₆N₅PRu⁺[M-PF₆]m/z理論值618.12，實驗值617.95。

實施例2

環(huán)金屬化釕配合物Ru2的合成

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

將苯乙胺(12.1g,100mmol)、三乙胺(30.3g，300mmol)，溶于80ml二氯甲烷中，然后在-10℃下慢慢加入對甲苯磺酰氯(18.05g，95mmol)，滴加完畢后，撤去冷凍，恢復(fù)室溫(25℃)，攪拌5h，TLC檢測原料點消失(苯乙胺)，表示反應(yīng)完全；然后，加100ml水洗，用25ml 1M的HCl溶液洗滌至溶液呈弱酸性，旋干溶劑，得油狀物，再向其中加入10ml的乙醇溶解，70℃熱水浴溶解；接著加入50ml水，攪拌，析出白色沉淀，放入4℃的冰箱中靜置，抽濾，得N-Ts-β-苯乙胺，收率為88％。

②1-對甲苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1-(p-tolyl)-2-tosyl-1,2,3,4-tetr ahydroisoquinoline)的合成

在氬氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺(0.687g，2.5mmol)、對甲基苯甲醛(0.36g，3mmol)溶于8ml甲苯(分子篩干燥)中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑(0.5325g，3.75mmol)，先于室溫氬氣保護下，攪拌20min，接著在60℃下攪拌回流8小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫；加入15ml水，劇烈攪拌，分出有機層，水層用甲苯(2x6ml)萃取2次；合并有機相，飽和食鹽水10ml洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑得固體粗產(chǎn)物，最后用乙醇：水＝9:1重結(jié)晶得白色固體，即1-對甲苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉，收率85％。

③1-對甲苯基-異喹啉的合成

將1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1.2mmol，0.4525g)溶于5ml DMSO中，接著加入30％的NaOH水溶液0.8ml，在125℃下攪拌加熱回流3h，TLC檢測反應(yīng)完全后，自然冷卻至室溫，加入30ml水，攪拌，靜置于4℃的冰箱內(nèi)一小時，抽濾，濾液用HCl中和，再用乙酸乙酯萃取(2x20ml)，合并有機相，旋干得油狀物；硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得白色固體，即1-對甲苯基-異喹啉，收率80％，其作為主配體。

④cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O的合成

同實施例1，收率88％。

⑤[Ru(bpy)₂(PhIQ-Me)](PF₆)的合成

在氮氣保護下，將cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O(0.052g，0.1mmol)與三氟甲磺酸銀(0.064g，0.25mmol)溶于10ml無水乙醇中(分子篩干燥的)，于80℃加熱回流3h；然后加入1-對甲苯基-異喹啉(0.0219g，0.1mmol)溶于無水乙醇中，并向其中加入四甲基氫氧化銨10％的甲醇溶液(0.012g，0.13mol)，在78℃下攪拌回流8h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氯化銀，5ml乙醇洗，合并濾液，旋干，硅膠柱層析(乙腈:甲苯＝1:2)，風(fēng)干，得Ru2粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得配合物Ru2，收率98％；Ru2分子式：C₃₆H₂₈F₆N₅PRu，元素分析理論值：C，55.67％；H，3.63％；N，9.02％；元素分析實驗值：C，55.60％；H，3.64％；N，9.22％。ESI-MS(CH₃CN)：C₃₆H₂₈F₆N₅PRu⁺[M-PF₆]m/z理論值632.14，實驗值631.95。

實施例3

環(huán)金屬化釕配合物Ru3的合成

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

將苯乙胺(12.1g,100mmol)、三乙胺(30.3g，300mmol)，溶于80ml二氯甲烷中，然后在-8℃下慢慢加入對甲苯磺酰氯(18.05g，95mmol)，滴加完畢后，撤去冷凍，恢復(fù)室溫(25℃)，攪拌4h，TLC檢測原料點消失(苯乙胺)，表示反應(yīng)完全；然后，加120ml水洗，用25ml 1M的HCl溶液洗滌至溶液呈弱酸性，旋干溶劑，得油狀物，再向其中加入12ml的乙醇溶解，70℃熱水浴溶解；接著加入50ml水，攪拌，析出白色沉淀，放入3℃的冰箱中靜置，抽濾，得N-Ts-β-苯乙胺，收率為92％。

②1-苯基-2-甲苯磺酰基-1,2,3,4-四氫異喹啉(1-phenyl-2-tosyl-1,2,3,4-tetrahydr oisoquinoline)的合成

在氮氣保護下，將N-Ts-β-苯乙胺(1.37g，5mmol)、苯甲醛(0.54g，5.1mmol)溶于12ml甲苯中，冰浴滴入三氟化硼乙醚催化劑(1.065g，7.5mmol)，先于室溫氬氣保護下，攪拌25min，接著在65℃下攪拌回流7小時，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫；加入15ml水，劇烈攪拌，分出有機層，水層用甲苯(2x6ml)萃取2次；合并有機相，飽和食鹽水10ml洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得固體粗產(chǎn)物，最后用乙醇：水＝9:1重結(jié)晶得白色固體，即1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉，收率88％。

③1-苯基-異喹啉的合成

將1-苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(2mmol，0.73g)溶于8ml DMSO中，接著加入35％的NaOH水溶液0.7ml，在150℃下攪拌加熱回流3h，TLC檢測反應(yīng)完全后，降至室溫，加入30ml水，攪拌，靜置，抽濾，濾液用HCl中和，再用乙酸乙酯萃取(2x20ml)，合并有機相，旋干得油狀物；硅膠柱層析，得白色固體，即1-苯基-異喹啉，收率90％，其作為主配體。

④cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O的合成

將RuCl₃·nH₂O(0.6g,2mmol)、phen(0.72g,4mmol)溶于10ml DMF，一并加入過量的LiCl(1.26g，30mmol)，氬氣保護下，先于室溫下攪拌均勻，充分溶解，再逐步升溫：60℃，30min；70℃，30min；90℃，60min；110℃，30min；直至升溫至140℃，然后攪拌回流8h，反應(yīng)結(jié)束后，降至室溫，轉(zhuǎn)移入單口燒瓶，80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大多數(shù)的DMF，剩余物自來水沖涼，再加入30ml丙酮，充分?jǐn)嚢?，放入冰?℃靜置過夜，抽濾，5ml冰水洗，真空干燥，即得cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O，收率84％。

⑤[Ru(phen)₂(PhIQ-H)](PF₆)的合成

在氮氣保護下，將cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O(0.0569g，0.1mmol)與三氟甲磺酸銀(0.064g，0.25mmol)溶于10ml無水乙醇中(分子篩干燥的)，于80℃加熱回流3h；然后加入1-苯基-異喹啉(0.0205g，0.1mmol)溶于無水乙醇中，并向其中加入四甲基氫氧化銨10％的甲醇溶液(0.012g，0.13mol)，在78℃下攪拌回流8h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氯化銀，5ml乙醇洗，合并濾液，旋干，硅膠柱層析(乙腈:甲苯＝2:1)，風(fēng)干，得Ru3粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得配合物Ru3，收率87％；Ru3分子式：C₃₉H₂₆F₆N₅PRu，元素分析理論值：C，57.78％；H，3.23％；N，8.64％；元素分析實驗值：C，57.70％；H，3.25％；N，9.60％。ESI-MS(CH₃CN)：C₃₉H₂₆F₆N₅PRu⁺[M-PF₆]m/z理論值666.12，實驗值665.91。

實施例4

環(huán)金屬化釕配合物Ru4的合成

①N-Ts-β-苯乙胺的合成

同實施例2，收率91％。

②1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1-(p-tolyl)-2-tosyl-1,2,3,4-tetr ahydroisoquinoline)的合成

同實施例2，收率89％。

③1-對甲苯基-異喹啉的合成

將1-對甲苯基-2-甲苯磺?；?1,2,3,4-四氫異喹啉(1.2mmol，0.4525g)溶于8ml DMSO中，接著加入25％的NaOH水溶液0.8ml，在140℃下攪拌加熱回流3h，TLC檢測反應(yīng)完全后，自然冷卻至室溫，加入30ml水，攪拌，靜置于4℃的冰箱內(nèi)一小時，抽濾，濾液用HCl中和，再用乙酸乙酯萃取(2x20ml)，合并有機相，旋干得油狀物；硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得白色固體，即1-對甲苯基-異喹啉，收率81％，其作為主配體。

④cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O的合成

同實施例3，收率86％。

⑤[Ru(phen)₂(PhIQ-Me)](PF₆)的合成

在氮氣保護下，將cis-[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O(0.0569g，0.1mmol)與三氟甲磺酸銀(0.064g，0.25mmol)溶于10ml無水乙醇中(分子篩干燥的)，于80℃加熱回流3h；然后加入1-對甲苯基-異喹啉(0.0219g，0.1mmol)溶于無水乙醇中，并向其中加入四甲基氫氧化銨10％的甲醇溶液(0.012g，0.13mol)，在78℃下攪拌回流9h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氯化銀，5ml乙醇洗，合并濾液，旋干，硅膠柱層析(乙腈:甲苯＝2:1)，風(fēng)干，得Ru4粗品；接著，用少量的乙腈溶解，加入適量的甲苯，滴加KPF₆靜置重結(jié)晶，制得配合物Ru4，收率82％；Ru4分子式：C₄₀H₂₈F₆N₅PRu，元素分析理論值：C，58.25％；H，3.42％；N，8.49％；元素分析實驗值：C，58.20％；H，3.43％；N，8.50％。ESI-MS(CH₃CN)：C₄₀H₂₈F₆N₅PRu⁺[M-PF₆]m/z理論值680.14，實驗值679.58。

實施例5

發(fā)明人分別實施了目標(biāo)配合物Ru1、Ru2、Ru3、Ru4對腫瘤細胞A549(肺癌細胞)、A549/DDP(肺癌耐藥細胞株)、HepG-2(肝癌細胞)、MCF-7(人乳腺癌細胞)及HK-2(人腎小管上皮細胞)的體外細胞毒性實驗。

該體外細胞毒性實驗包括：采用MTT法研究了化合物的體外細胞毒性，具體操做如下：胰酶消化對數(shù)期的細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調(diào)整其濃度至5～10×10⁴/mL；取細胞懸液0.1mL種于96孔板中，然后將接種好的細胞板在37℃，5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將長滿單層細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入不同濃度的配合物，并設(shè)對照組，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌一次。每孔加入20μL 5mg/mL的MTT染色液，在37℃，5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入三聯(lián)液100μL每孔并混勻，37℃放置過夜使得形成的甲臜全部溶解，再用酶標(biāo)儀在490nm處檢測各孔的OD值；計算出半數(shù)致死率IC₅₀值，數(shù)據(jù)結(jié)果見下表1。由下表1可知，目標(biāo)配合物Ru1、Ru2、Ru3、Ru4均表現(xiàn)出比順鉑更優(yōu)越的抗腫瘤活性(作用時間48h)。

表1 Ru1、Ru2、Ru3、Ru4及順鉑對不同細胞株的抑制活性比較

實施例6彗星實驗

發(fā)明人還采用彗星實驗(單細胞凝膠電泳)檢測了配合物Ru1和Ru3誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生的DNA斷裂，具體包括如下步驟：體外培養(yǎng)的細胞株，用胰酶消化，吹打成單細胞懸液，提前按照1:1混合低熔點瓊脂糖與細胞液；取100μL于65℃的0.5％普通熔點瓊脂糖加在載玻片上，再于其上加蓋玻片，4℃冷凝15min。取下蓋玻片，取80μL于37℃水浴中保溫的1.0％低熔點瓊脂糖與細胞懸液的混合溶液，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃冷凝10min。將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細胞裂解液中裂解90min。從裂解液中取出載玻片，平放水槽中，加入三蒸水37℃，水洗2次，每次5mn；取出該載玻片，放入電泳槽中，浸泡在電泳液中解旋20min；在室溫下，電泳30min(20V，330mA)；電泳結(jié)束后，將該載玻片浸泡于中和液中15min。取出該載玻片，置于染色架上，滴加EB(20μg/mL)，暗處染色15min。蒸餾水脫色兩次，每次10min。最后，在熒光顯微鏡下觀察拍照，結(jié)果如圖10、11所示，表明配合物Ru1和Ru3能誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生DNA濃縮斷裂。

實施例7 Hoechst33342染色實驗

Hoechst33342染色檢測Ru3引起染色體濃縮、DNA斷裂。具體步驟如下：體外培養(yǎng)的細胞株，用不同濃度的Ru3處理細胞，培養(yǎng)24h后，用PBS洗三次，加入Hoechst33342溶液(1μg/ml)，室溫，避光染色10min；棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次，添加200ulPBS，熒光顯微鏡下觀察，照相。結(jié)果如圖12所示，表明Ru3能引起A549細胞染色體濃縮、DNA斷裂。

實施例8 DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)活性氧水平

DCFH-DA染色檢測細胞內(nèi)活性氧水平。具體步驟如下：種12孔板，待細胞長到50％，加入不同濃度的Ru3配合物，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，用PBS洗三次；加入DCFH-DA工作液，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20分鐘。用顯微鏡觀察，拍照或是用流式細胞儀檢測。結(jié)果如圖13、14所示，配合物Ru3引起A549細胞內(nèi)活性氧水平升高。

實施例9 JC-1檢測線粒體膜電位

JC-1檢測線粒體膜電位變化。具體步驟如下：種12孔板，待細胞長到50％，加入不同濃度的Ru3配合物，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，胰酶消化，PBS洗三次；用250ul JC-1工作液重懸，在培養(yǎng)箱中避光孵育20min；4度200g離心5min,棄上清；用400ul預(yù)冷的PBS重懸，流式送檢檢測，結(jié)果如圖15所，紅色熒光強度在降低，綠色熒光強度在增加；這說明配合物Ru3能夠引起A549細胞線粒體膜電位下降。

實施例10 Annexin V-FITC/PI雙染實驗

發(fā)明人實施了Annexin V-FITC/PI雙染用于驗證配合物Ru1和Ru3誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡，具體包括以下步驟：用不含EDTA的胰酶消化收集細胞；加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞；加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI Staining Solution，輕輕混勻；避光，室溫染色10min。然后，加入300μL 1×Binding Buffer，混勻，用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果如圖16、17所示。其中，圖16、圖17分別為Ru1、Ru3誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡的散點圖，清晰地表明了Ru1和Ru3均能誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡。

實施例11

以配合物Ru3為例，發(fā)明人進一步考察了環(huán)金屬化釕配合物對相關(guān)蛋白表達的影響；具體地，發(fā)明人通過Western blot分析了配合物Ru3對DNA損傷相關(guān)蛋白p-Chk2、p-ATM、p-Histone和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、cleaved caspase-3以及RARP表達量的影響，主要包括以下步驟：將A549細胞培養(yǎng)于60mm的培養(yǎng)皿中，直至細胞密度達到80％后，加入不同濃度(1.0、2.0、4.0μM)的配合物Ru3繼續(xù)培養(yǎng)24h。孵育完成后，胰酶消化、收集細胞于1.5mL離心管中，然后加入適量胞漿裂解液RIPA于4℃裂解30min，將準(zhǔn)備好的蛋白樣品100℃高溫變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育(一抗分別為p-Chk2、p-ATM、p-Histone、caspase-3、cleaved caspase-3、RARP以及β-actin)，二抗孵育，蛋白檢測；此實驗結(jié)果如圖18、19所示，Ru3增加p-Chk2、p-ATM、p-Histone的表達，表明Ru3能夠引起DNA損傷；同時，Ru3降低總的caspase-3，增加cleaved caspase-3，進而導(dǎo)致了PARP的裂解，這些結(jié)果表明Ru3能引起A549細胞發(fā)生凋亡。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。