本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，具體涉及生物分子的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和生物分子的電化學(xué)發(fā)光分析檢測。

背景技術(shù)：

在生物分析檢測領(lǐng)域，電化學(xué)發(fā)光免疫是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫之后的新一代微量標(biāo)記免疫分析技術(shù)，其具有檢測靈敏度高（可以達(dá)到飛摩爾量級）、選擇性好、檢測時間快、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床應(yīng)用、食品安全等領(lǐng)域。目前成功商業(yè)化的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子主要是三聯(lián)吡啶釕衍生物，但其具有明顯的缺點(diǎn)，如：發(fā)光顏色比較單一，發(fā)光量子效率低，發(fā)光波長很難通過分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)等弊端。

現(xiàn)有技術(shù)公開了一些環(huán)金屬化合物，理論上具有較好的電化學(xué)發(fā)光性能；但是不具反應(yīng)性，無法與生物分子形成偶聯(lián)，導(dǎo)致其無法實(shí)際應(yīng)用，即不可用于生物分子標(biāo)記，而且現(xiàn)有應(yīng)用體系都為有機(jī)相，由于生物分子在有機(jī)相中生物活性喪失，進(jìn)一步導(dǎo)致其無法實(shí)際應(yīng)用；另外化合物本身的電性質(zhì)對其能否作為生物分子標(biāo)記物以及標(biāo)記效果有著極其重要的影響。因此，開發(fā)新型高效的生物分子電化學(xué)發(fā)光信號標(biāo)記物對于電化學(xué)發(fā)光生物分析檢測技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一類新型高效的生物分子電化學(xué)發(fā)光信號標(biāo)記物。該類電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的可以通過配體結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)電化學(xué)發(fā)光發(fā)射波長從紅到藍(lán)綠色的調(diào)節(jié)，同時具有較高的電化學(xué)發(fā)光效率，利用其所修飾的羧酸官能團(tuán)可以快速實(shí)現(xiàn)與生物分子的共價偶聯(lián)，化學(xué)穩(wěn)定性高。本發(fā)明可以有效克服傳統(tǒng)電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的弊端，具有巨大的市場應(yīng)用前景和良好的經(jīng)濟(jì)社會效益。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種環(huán)金屬銥配合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

其中二齒配體為第一配體，為第二配體；所述環(huán)金屬銥配合物屬于離子型化合物，X為對離子，可以為氯離子（Cl^-）、六氟磷酸根（PF₆^-）和四氟硼酸根（BF₄^-）。

上述技術(shù)方案中，二齒配體為第一配體，可以為以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式中的一種：

其中，R為氫、甲基、甲氧基、硝基、氰基或者鹵素等；

為第二配體，可以選用以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式中的一種：

其中，n可以是1到9中的任意整數(shù)。

優(yōu)選的，所述環(huán)金屬銥配合物的結(jié)構(gòu)式為以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式中的一種:

本發(fā)明公開了上述環(huán)金屬銥配合物作為生物分子電化學(xué)發(fā)光信號標(biāo)記物的應(yīng)用；所述生物分子包括蛋白質(zhì)分子、多肽分子、脫氧核糖核酸分子、核糖核酸分子；本發(fā)明的環(huán)金屬銥配合物修飾的羧基具有良好的反應(yīng)性，可以與生物分子進(jìn)行反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對生物分子的標(biāo)記。現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為烷烴鏈段由于具有碳碳鍵，比苯環(huán)或者雜環(huán)更容易振動，從而更容易吸收電能而轉(zhuǎn)化為熱能，從而削弱電化學(xué)發(fā)光，這對生物標(biāo)記十分不利；本發(fā)明通過結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，創(chuàng)造性的公開的環(huán)金屬銥配合物帶有羧基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)與生物分子的共價偶聯(lián)，化學(xué)穩(wěn)定性高；同時具有電化學(xué)發(fā)光效率高的優(yōu)點(diǎn)，參見本發(fā)明實(shí)施例，同等條件下，本發(fā)明金屬銥標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于現(xiàn)有成熟的金屬釕配合物；取得了意想不到的技術(shù)效果。

本發(fā)明還公開了上述環(huán)金屬銥配合物在生物分子電化學(xué)發(fā)光檢測中的應(yīng)用；所述生物分子，可以是蛋白質(zhì)分子，多肽，脫氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）等，優(yōu)選蛋白質(zhì)分子和脫氧核糖核酸分子。環(huán)金屬銥配合物標(biāo)記生物分子后，電化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生體系為水相體系，可以是含有電化學(xué)發(fā)光共反應(yīng)物的磷酸鹽緩沖溶液，三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖溶液和4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖溶液。水相體系是實(shí)現(xiàn)生物分子電化學(xué)檢測的必要條件，現(xiàn)有環(huán)金屬化合物大都在有機(jī)相具有良好的電化學(xué)發(fā)光，但是無法應(yīng)用在水相；本發(fā)明的環(huán)金屬銥配合物克服了現(xiàn)有技術(shù)難題，可以在緩沖液中對生物分子進(jìn)行標(biāo)記，然后在水相體系中進(jìn)行電化學(xué)檢測，具有優(yōu)于現(xiàn)有成熟的金屬釕配合物的技術(shù)效果。

本發(fā)明還公開了一種生物分子電化學(xué)發(fā)光檢測的方法，以上述環(huán)金屬銥配合物為標(biāo)記物，以叔胺化合物為共反應(yīng)物，在水相體系中，實(shí)現(xiàn)生物分子電化學(xué)發(fā)光檢測；所述生物分子包括蛋白質(zhì)分子、多肽分子、脫氧核糖核酸分子、核糖核酸分子。環(huán)金屬銥配合物在生物分析標(biāo)記中，羧酸基團(tuán)需要首先轉(zhuǎn)化為-N-羥基琥珀酰亞胺酯，然后再與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)。所述水相體系為磷酸鹽緩沖溶液體系、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液體系或者4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液體系；所述叔胺類化合物為正-三丙胺或者三乙胺。

本發(fā)明還公開了上述環(huán)金屬銥配合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）環(huán)醚溶劑中，化合物A與強(qiáng)堿反應(yīng)；然后加入溴腈化合物，繼續(xù)反應(yīng)，得到化合物B；然后將化合物B在濃酸中回流反應(yīng)，得到二齒配體；所述化合物A的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為以下化學(xué)結(jié)構(gòu)式的一種：

（2）三氯化銥與二齒配體在乙二醇乙醚中反應(yīng)，得到過渡金屬氯橋化合物，然后將氯橋化合物與二齒配體反應(yīng)得到環(huán)金屬銥配合物。

上述技術(shù)方案中，所述強(qiáng)堿為二異丙基氨基鋰；所述溴腈化合物為溴丙腈或者溴丁腈；所述濃酸為濃硫酸。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明公開的環(huán)金屬銥配合物作為電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，波長可以實(shí)現(xiàn)從藍(lán)光到紅光的調(diào)節(jié)，有利于開發(fā)多通道的免疫分析設(shè)備和產(chǎn)品，提高檢測的效率；并且電化學(xué)發(fā)光效率高；克服了現(xiàn)有技術(shù)中電化學(xué)發(fā)光化合物發(fā)光顏色單一，發(fā)光量子效率低的缺陷；具有巨大的市場應(yīng)用前景和良好的經(jīng)濟(jì)社會效益；

（2）本發(fā)明公開的環(huán)金屬銥配合物具有羧酸基團(tuán)，可以快速實(shí)現(xiàn)與生物分子的共價偶聯(lián)，且化學(xué)穩(wěn)定性高；尤其是解決了現(xiàn)有含烷烴鏈段的化合物由于碳碳鍵振動導(dǎo)致的電化學(xué)性能削弱的問題，得到的環(huán)金屬銥配合物具有高效的電化學(xué)發(fā)光效率；

（3）本發(fā)明公開的環(huán)金屬銥配合物適用水相體系，在生物分析檢測領(lǐng)常采用的水相體系中，與傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物相比，同等條件下，具有更高的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，從而可以提高對生物分子的檢測靈敏度，而且適于實(shí)際應(yīng)用。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光信號圖；

圖2為實(shí)施例三電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光信號圖；

圖3為實(shí)施例七電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光信號圖；

圖4為實(shí)施例八DNA的電化學(xué)發(fā)光信號圖；

圖5為實(shí)施例九BSA的電化學(xué)發(fā)光信號圖；

圖6為含不同主配體結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光波長圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以正-三丙胺為共反應(yīng)物，在PBS緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，隨著正-三丙胺被氧化，檢測到最大的電化學(xué)發(fā)光信號，如圖1所示。

實(shí)施例二 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以正-三丙胺為共反應(yīng)物，在PBS緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，隨著正-三丙胺被氧化，檢測到最大的電化學(xué)發(fā)光信號。

實(shí)施例三 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以三乙胺為共反應(yīng)物，在Tris緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1.2 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，隨著共反應(yīng)物被氧化，檢測到最大的電化學(xué)發(fā)光信號，如附圖2所示。

實(shí)施例四 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以正-三丙胺為共反應(yīng)物，在Tris緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1.3 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例五 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以正-三丙胺為共反應(yīng)物，在PBS緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1.1 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例六 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以三乙胺為共反應(yīng)物，在PBS緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1.05 V-0 V循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)。

實(shí)施例七 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

以正-三丙胺為共反應(yīng)物，在Tris緩沖溶液中，在電極上施加0 V-1.1 V-0 V線性循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)，如附圖3所示。

實(shí)施例八 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

將標(biāo)記物在DMF中利用二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作為催化劑，將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為NHS酯，然后與末端氨基修飾的DNA鏈在PBS溶液中反應(yīng)1小時，然后將DNA鏈進(jìn)行純化，將未標(biāo)記的DNA鏈和其中游離的標(biāo)記物分子除去，然后用正-三丙胺做為共反應(yīng)劑，在PBS緩沖溶液中，對工作電極施加0 V-1.5 V-0 V線性循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)，如附圖4所示。

實(shí)施例九 所用的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)式如下：

將標(biāo)記物在DMF中利用二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作為催化劑，將羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為NHS酯，然后與牛血清蛋白（BSA）在PBS溶液中反應(yīng)2小時后，利用透析方法將游離的小分子標(biāo)記物去除。然后在含有正-三丙胺共反應(yīng)物的Tris緩沖溶液中，對工作電極施加0 V-1.2 V-0 V線性循環(huán)伏安掃描，隨著掃描電位逐漸增加，電極表面電流逐漸增大，檢測到的電化學(xué)發(fā)光信號逐漸增強(qiáng)。同等實(shí)驗(yàn)條件下，利用傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物三聯(lián)吡啶釕衍生進(jìn)行BSA蛋白標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)同等濃度被標(biāo)記的BSA蛋白，金屬銥標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于傳統(tǒng)的金屬釕配合物，如附圖5所示，同等濃度下，Ir標(biāo)記的蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號。

實(shí)施例十

化合物1溶于無水四氫呋喃中，-78℃低溫條件下與LDA強(qiáng)堿反應(yīng)2小時后，加入溴丙腈，繼續(xù)在室溫條件下反應(yīng)18小時，經(jīng)柱層析純化得到中間產(chǎn)物化合物2，然后將中間產(chǎn)物在濃硫酸條件下加熱回流24小時，得到目標(biāo)產(chǎn)物3。其他對應(yīng)的含不同亞甲基的羧酸，可以通過溴代氰基類化合物的碳原子數(shù)進(jìn)行改變。

化合物4溶于無水四氫呋喃中，-78℃低溫條件下與LDA強(qiáng)堿反應(yīng)2小時后，加入溴丁腈，繼續(xù)在室溫條件下反應(yīng)24小時，經(jīng)柱層析純化得到中間產(chǎn)物化合物5，然后將中間產(chǎn)物在濃硫酸條件下加熱回流12小時，得到目標(biāo)產(chǎn)物6。

三氯化銥與二齒配體在乙二醇乙醚溶劑中反應(yīng)24小時后，得到過渡金屬氯橋化合物，然后進(jìn)一步將氯橋化合物與二齒配體化合物反應(yīng)得到最終的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物環(huán)金屬銥配合物。

本發(fā)明所涉及的其他電化學(xué)發(fā)光化合物的合成路線與此類似。

圖6是含不同主配體結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光波長，圖中從左到右曲線代表的環(huán)金屬銥配合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式依次如下：

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