本發(fā)明具體涉及用于病毒熒光標(biāo)記與活體成像的化合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

熒光成像作為在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平理解生命過程的重要工具，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。選擇合適的熒光標(biāo)記方法是得到理想熒光圖像的重要因素。目前，在生命科學(xué)研究過程中普遍采用熒光蛋白、染料及小分子標(biāo)記等方法。但現(xiàn)有方法都存在一定的缺陷，例如：在生物分子的基因組中插入綠色熒光蛋白GFP或紅色熒光蛋白R(shí)FP的基因，來表達(dá)帶標(biāo)簽的融合蛋白，該方法通常適用于較大的生物分子，由于GFP或RFP蛋白較大可能會(huì)對(duì)所要標(biāo)記的生物分子活性造成一定的影響(Schaferling,M.,The art of fluorescence imaging with chemical sensors.Angew Chem Int Ed Engl,2012.51(15)：p.3532-54)；各種熒光染料是生命科學(xué)中最常用的成像方法，然而熒光染料在成像過程中淬滅嚴(yán)重，容易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，不適合長時(shí)間觀察，并且染料只適用于標(biāo)記特定的細(xì)胞部位，不具有普遍適用性(Lakadamyali,M.,et al.,Visualizing infection of individual influenza viruses.Proc Natl Acad Sci U S A,2003.100(16)∶p.9280-5)；還有一些化學(xué)小分子的標(biāo)記方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的糖類、脂類和蛋白質(zhì)進(jìn)行特定修飾，但是該方法普遍存在的問題在于反應(yīng)效率不高，穩(wěn)定性差，因此需要很高的化合物濃度，容易引起細(xì)胞毒性，并且標(biāo)記過程會(huì)影響生物分子的產(chǎn)率(Spokoyny,A.M.,et al.,A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling.J Am Chem Soc,2013.135(16)∶p.5946-9；Kung,K.K.,et al.,Cyclometalated gold(II)complexes for chemoselective cysteine modification via ligand controled C-S bond-forming reductive elimination.Chem Commun(Camb),2014.50(80)∶p.11899-902)。病毒作為重要的生物分子，是人們長期以來的重要研究對(duì)象。病毒是引起人類眾多疾病的元兇，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅，例如，流感病毒、肝炎病毒和艾滋病毒等在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，每年引起大量死亡。對(duì)病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記研究其動(dòng)態(tài)生命周期是一種常見的生物學(xué)方法，傳統(tǒng)插入GFP或RFP等熒光標(biāo)簽及熒光小分子標(biāo)記等方法可能引起病毒結(jié)構(gòu)及感染能力的下降，還有一些親脂性染料可以特異的與病毒表面的囊膜結(jié)合，但不適用于無囊膜病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供式I所示化合物：

上述式I中，i-Pr表示異丙基，Cy表示環(huán)己基。

上述式I所示化合物是按照包括下述步驟的方法制備得到的：

在惰性氣體保護(hù)下，將式4所示化合物與RuPhos和式6所示化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到含式I所示化合物的體系。

上述式6中，TMS表示三甲基硅烷基。

其中，RuPhos為2-雙環(huán)已基膦-2',6'-二異丙氧基聯(lián)苯。

所述反應(yīng)在攪拌下進(jìn)行。

所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，具體可為18小時(shí)。

所述反應(yīng)在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。

所述有機(jī)溶劑具體可為THF。

上述方法還可進(jìn)一步包括從所述含式I所示化合物的體系中分離得到式I所示化合物的步驟。具體操作為：向所述體系中加入正戊烷，冷凍，將所得混懸液過濾，收集固體，即得式I所示化合物。其中，所述冷凍溫度-25--15℃，具體可為-20℃，所述冷凍的時(shí)間可為2.5-4小時(shí)，具體可為3小時(shí)。

上述式I所示化合物在熒光標(biāo)記表面含有半胱氨酸的生物分子中的應(yīng)用，或式I所示化合物在制備熒光標(biāo)記表面含有半胱氨酸的生物分子的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

其中，所述半胱氨酸可以是生物分子自身含有的半胱氨酸，或是通過人工手段引入到生物分子中的半胱氨酸。

其中，所述生物分子可以是任何想用熒光標(biāo)記的生物分子，具體可以是多肽、蛋白或病毒。

所述多肽為含有半胱氨酸的多肽，或者無半胱氨酸但可引入半胱氨酸的多肽。

所述蛋白為表面有至少一個(gè)半胱氨酸的蛋白，或者表面沒有半胱氨酸，但可引入半胱氨酸的蛋白。

所述病毒為表面具有半胱氨酸的病毒，或者表面沒有半胱氨酸，但可在其表面引入半胱氨酸的病毒。

所述病毒包括無囊膜病毒、囊膜病毒。

所述病毒具體可為腸道病毒71。

本發(fā)明的另一目的是提供一種多肽、蛋白或病毒的熒光標(biāo)記方法。

本發(fā)明所提供的多肽、蛋白或病毒的熒光標(biāo)記方法，包括下述步驟：

將具有半胱氨酸的多肽、蛋白或病毒與式I所示化合物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入3’-巰基丙酸終止反應(yīng)，即可；或在不含半胱氨酸的多肽、蛋白或病毒的表面引入半胱氨酸，將所述引入了半胱氨酸的多肽、蛋白或病毒與式I所示化合物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入3’-巰基丙酸終止反應(yīng)，即可。

所述病毒包括無囊膜病毒、囊膜病毒。

所述病毒具體可為腸道病毒71。

本發(fā)明開發(fā)了一種可以對(duì)多肽、蛋白及病毒進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，該方法可以實(shí)現(xiàn)在30分鐘內(nèi)對(duì)生物分子的標(biāo)記，效率接近100％，并且不影響病毒的產(chǎn)率和感染能力。

本發(fā)明選擇腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)為模型，應(yīng)用式I所示化合物實(shí)現(xiàn)了病毒的熒光成像。EV71是引起近年來在亞州-太平洋地區(qū)廣泛流行的手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Di sease,HFMD)的主要病原體。其感染對(duì)象主要為3歲以下免疫功能尚未成熟的兒童。EV71病毒可以引起無菌性腦膜炎、病毒性腦炎、心肌炎、馳緩性麻痹和肺水腫等，致死率較高。由于EV71病毒具有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)性，從2008年在中國安徽阜陽爆發(fā)至今，已造成接近3,000人死亡[7]。該病毒為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，由四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1、2、3、4組成的外殼和內(nèi)部的一條RNA組成。

式I所示化合物可以對(duì)病毒表面的半胱氨酸進(jìn)行特異高效的修飾，將熒光分子標(biāo)記到表面蛋白的半胱氨酸上，即使病毒表面無半胱氨酸也可以選擇不影響其生物活性的位點(diǎn)進(jìn)行突變引入半胱氨酸，再用式I所示化合物進(jìn)行修飾，從而將熒光分子標(biāo)記到半胱氨酸上。該方法可廣泛適用于各種大小的病毒，而且不影響標(biāo)記后病毒的感染能力。

附圖說明

圖1為式I所示化合物的合成路線圖。

圖2為多肽與式I所示化合物反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖。

圖3為UBXD7與式I所示化合物反應(yīng)前的質(zhì)譜圖。

圖4為UBXD7與式I所示化合物反應(yīng)后的質(zhì)譜圖。

圖5為實(shí)心和空心病毒與式I所示化合物反應(yīng)前后的滴度。

圖6為用羅丹明標(biāo)記后的病毒感染細(xì)胞，紅點(diǎn)代表標(biāo)記的病毒。

圖7為病毒隨時(shí)間推移進(jìn)入細(xì)胞直到消失的過程。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、式I所示化合物的制備

參照?qǐng)D1所示的合成路線圖制備式I所示化合物。

步驟1：

在1個(gè)25mL的圓底燒瓶中加入213mg化合物1，然后將其溶于4mL無水四氯化碳中，在攪拌的情況下加入16mg的AIBN(偶氮二異丁腈)，然后196mg的NBS(N-溴代丁二酰亞胺)緩慢加入到上述溶液中去。然后將反應(yīng)體系升溫至回流，使用TLC(薄層色譜法)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)測。當(dāng)反應(yīng)完全之后，將反應(yīng)體系降至室溫，過濾，所得濾液減壓旋蒸，殘余物通過硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯＝5/1),得到白色固體240mg(化合物2)，產(chǎn)率為82％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.83–7.72(m,3H),7.35(s,1H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.44,150.57,134.71,130.62,127.26,127.11,123.12,73.39.

步驟2：

在1個(gè)25mL圓底燒瓶中加入145mg化合物2，然后向圓底燒瓶中加入2mL去離子水。將反應(yīng)體系升溫至回流，使用TLC(薄層色譜法)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)測。待反應(yīng)完全之后，將反應(yīng)體系降至室溫，過濾，所得白色固體用乙醚洗3次，干燥即可得到目標(biāo)產(chǎn)物139mg(化合物3)，產(chǎn)率為90％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28(s,1H),7.93(s,1H),7.86(d,J＝8.1Hz,1H),7.77(d,J＝8.2Hz,1H),6.66(s,1H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ167.57,149.42,133.76,128.46,126.98,126.43,125.82,97.68

步驟3

在1個(gè)25mL圓底燒瓶中依次加入274mgN，N-二甲基間羥基苯胺、229mg化合物3、35mg對(duì)甲苯磺酸一水合物，然后向圓底燒瓶中加入4mL丙酸作為溶劑。在避光、氬氣保護(hù)的條件下將反應(yīng)體系升溫至90℃并反應(yīng)18個(gè)小時(shí)，使用TLC(薄層色譜法)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)測。待反應(yīng)完全之后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑除去，殘余物通過硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇＝8/1，并在洗脫劑中添加0.5％的乙酸)，得到玫瑰紅色固體209mg(化合物4)，產(chǎn)率為45％。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.86(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.3Hz,1H),7.32(s,1H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),6.51–6.39(m,4H),3.00(s,12H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.98,168.98,153.13,152.47,133.02,129.74,129.74,128.91,127.66,126.46,109.07,106.42,98.65,40.39.

步驟4：

在手套箱中，將315mg化合物5裝入放有磁子的25mLSchlenk瓶中，然后加入5mL乙醚。將反應(yīng)體系用橡膠塞封閉好之后，拿出手套箱，將反應(yīng)體系用Ar保護(hù)。將反應(yīng)體系置于-40℃(干冰-乙腈)中，向反應(yīng)體系中緩慢加入2.5mL的TMSCH₂MgCl溶液(1M乙醚溶液)，待滴加完畢，反應(yīng)體系在-40℃中反應(yīng)1小時(shí)，然后將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至0℃(冰水混合物)中，再反應(yīng)0.5小時(shí)。然后在0℃的條件下向反應(yīng)體系中加入0.15mL丙酮，再反應(yīng)5分鐘。之后，在反應(yīng)體系保持0℃的條件下，用一個(gè)待外接冷肼的油泵將反應(yīng)體系中的易揮發(fā)溶劑抽干，將橡膠塞打開，向Schlenk瓶中加入10mL正戊烷，所得到的混懸物通過一小段硅藻土進(jìn)行過濾，濾餅再用正戊烷洗3次。(注意，承接濾液的圓底燒瓶也要置于0℃的冰水混合物中)。通過0℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所得濾液抽干，所得到的灰白色固體在油泵上抽干(此時(shí)圓底燒瓶也應(yīng)置于0℃的冰水混合物中)，得到目標(biāo)產(chǎn)物(化合物6)300mg，產(chǎn)率為70％。

¹H NMR(400MHz,Benzene-d6)δ5.14(s,1H),2.92–1.49(m,2H),0.76(s,1H),0.33(s,4H).

¹³C NMR(101MHz,C6D6)δ112.17,29.23,11.77,3.94.

步驟5：

在手套箱中，將65mg化合物4,66mg的RuPhos和50mg的化合物6依次加入10mL的Schlenk瓶中，然后向Schlenk瓶中加入1.5mLTHF。將反應(yīng)體系用橡膠塞封好，拿出手套箱。將Schlenk瓶用Ar保護(hù)，在室溫下攪拌18小時(shí)。然后，向反應(yīng)體系中加入3mL正戊烷，再將反應(yīng)體系置于-20℃下冷凍3小時(shí)，打開塞子，將所得混懸液過濾，將所得固體用正戊烷洗3次，在油泵下抽干，得到65mg目標(biāo)產(chǎn)物(式I所示化合物)，為灰紅色固體，產(chǎn)率65％。

¹H NMR(400MHz,Methylene Chloride-d2)δ7.67(dt,J＝13.3,7.7Hz,2H),7.43(dt,J＝22.4,7.5Hz,2H),7.25(d,J＝33.9Hz,2H),7.11(s,2H),6.94–6.82(m,2H),6.69(dd,J＝25.8,8.4Hz,2H),6.52(d,J＝4.7Hz,2H),4.70–4.56(m,2H),2.23(q,J＝11.4Hz,2H),1.92–1.82(m,2H),1.66–1.40(m,29H),1.40–1.26(m,6H),1.23–1.06(m,8H),1.00(d,J＝6.1Hz,3H),0.92(t,J＝6.9Hz,2H).

³¹P NMR(162MHz,CD2Cl2)δ28.33.

ESI-MS:陽離子模式

Exact mass:m/z＝957.36

Found：m/z＝957.3634

實(shí)施例2、式I所示化合物在多肽上的熒光標(biāo)記

首先將該化合物在含有半胱氨酸的多肽上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)過程如下：

在Ep管中加入47μl H₂O，4μl 150μM的多肽，多肽序列為：GTSWCYNQKRHDGP，加入1μl乙腈和6μl 1M Tris-HCl pH 7.5，混勻；

加入2μl 600μM的式I所示化合物，混勻；

室溫反應(yīng)30min；

加入6.3μl，0.05μl/ml的3’-巰基丙酸，室溫終止反應(yīng)5min；

質(zhì)譜鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。

圖2為多肽與式I所示化合物反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖。

質(zhì)譜圖中550.24924的峰為反應(yīng)前的多肽，計(jì)算出的分子量為：1647.75，678.62907的峰為反應(yīng)后的產(chǎn)物，分子量為：2032.88，兩者分子量相差385.14，正好是熒光分子羅丹明的分子量。

由此可見通過式I所示化合物在所述多肽上成功的標(biāo)記上了熒光分子羅丹明。

實(shí)施例3、式I所示化合物在蛋白上的熒光標(biāo)記

我們選取了表面有一個(gè)半胱氨酸的蛋白UBXD7進(jìn)行標(biāo)記，如果蛋白表面沒有半胱氨酸，也可以對(duì)表面位點(diǎn)進(jìn)行突變，反應(yīng)過程如下：

在離心管中加入5ml 20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5，加入0.5μM的UBXD7蛋白，加入25μl 2mM的化合物，混勻；

室溫反應(yīng)30min；

加入250μl，2mM的3’-巰基丙酸，室溫終止反應(yīng)5min；

濃縮后，質(zhì)譜鑒定反應(yīng)產(chǎn)物。

圖3為UBXD7與式I所示化合物反應(yīng)前的質(zhì)譜圖，UBXD7的分子量為：9507.07。

圖4為UBXD7與式I所示化合物反應(yīng)后的質(zhì)譜圖，反應(yīng)后分子量為：9891.23，兩者相差385.15，正好是羅丹明的分子量。

由此可見通過式I所示化合物在所述蛋白上成功的標(biāo)記上了熒光分子羅丹明。

實(shí)施例4、病毒的熒光成像

該病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的分子機(jī)制還不甚清楚，我們發(fā)展的熒光標(biāo)記方法可以很好的觀察到病毒吸附到宿主細(xì)胞表面，隨后進(jìn)入細(xì)胞的過程。

實(shí)驗(yàn)過程如下：

RD細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至滿度為70％時(shí)，加入感染劑量為MOI＝0.5的EV71病毒，感染1h后，移走培養(yǎng)基，換成含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)36h后收集病毒。

病毒上清經(jīng)過12000rpm離心20min，去除細(xì)胞碎片后，用0.2μm濾器抽濾。

在離心管底部墊8ml 30％蔗糖，將病毒液加到離心管中，160,000g離心4h。

收集病毒沉淀，用緩沖液重懸后用15％-45％的蔗糖連續(xù)梯度，進(jìn)行密度梯度離心，3,6000rpm，離心4h。

離心后可以觀察到病毒分為上下兩層，上層為感染性低的空心病毒，下層為感染性強(qiáng)的實(shí)心病毒。

分別收集兩個(gè)層的病毒，濃縮換液至20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5。

將實(shí)心和空心病毒分別與式I所示化合物反應(yīng)，測定反應(yīng)前后病毒的滴度。

圖5為實(shí)心和空心病毒與式I所示化合物反應(yīng)前后的滴度。

圖5表明空心和實(shí)心病毒反應(yīng)前后病毒仍保持感染活性。

用標(biāo)記后的實(shí)心病毒感染RD細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過程如下：

RD細(xì)胞在平皿中37℃培養(yǎng)過夜。

將培養(yǎng)基換成PBS，加入100μl標(biāo)記后病毒，冰上孵育1h，使病毒吸附在細(xì)胞表面。

用4％多聚甲醛固定細(xì)胞10min。

在confocal下觀察。

從圖6中我們可以看到標(biāo)記的病毒吸附在RD細(xì)胞膜上。

我們將標(biāo)記的病毒在冰上處理使其吸附到細(xì)胞表面，隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到37℃，病毒會(huì)進(jìn)入細(xì)胞直到外殼解聚，confocal下觀察這一動(dòng)態(tài)過程如圖7所示。

圖7為病毒隨時(shí)間推移進(jìn)入細(xì)胞直到消失的過程。