本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

牛丙酮酸脫氫酶β亞基(Pyruvate dehydrogenaseβsubunit，PDHB)基因催化丙酮酸成為乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，是將糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝途徑連接起來的關(guān)鍵酶。研究表明PDHB基因的表達(dá)水平與IMF含量成正相關(guān)。通過對大理石紋含量高和低的兩組牛骨骼肌進(jìn)行差顯PCR(ddPCR)分析，發(fā)現(xiàn)PDHB基因的表達(dá)存在顯著差異(Sasaki,Nagai et al.2006)。在對豬IMF的研究中，也發(fā)現(xiàn)PDHB基因的表達(dá)水平與IMF成正相關(guān)(Serao,Veroneze et al.2011)。在對瘦肉型和脂肪型北京鴨的肝臟進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究發(fā)現(xiàn)，PDHB基因的蛋白表達(dá)量存在顯著差異(Zheng,Chang et al.2014)。我們的前期研究中也發(fā)現(xiàn)：在瘦肉型(長白豬)和脂肪型(藍(lán)塘豬)豬中的PDHB基因的蛋白表達(dá)量存在顯著差異(Bernard,Torbati et al.2013)。因此，我們推測PDHB基因可能在肌內(nèi)脂肪的形成過程中起著重要的作用。我們還對牛PDHB基因的啟動(dòng)子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPβ)和肌細(xì)胞生成素(Myogenin，MYOG)很可能是調(diào)控該基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Li,Zhang et al.2016)。通過構(gòu)建牛PDHB基因腺病毒干擾載體，能夠有效解決在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中持續(xù)敲低PDHB基因的表達(dá)，為研究牛PDHB基因的功能提供有效的技術(shù)支撐。

綜上所述，現(xiàn)有的牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中PDHB基因的表達(dá)持續(xù)敲低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體構(gòu)建及其鑒定方法，旨在解決現(xiàn)有的牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中PDHB基因的表達(dá)持續(xù)敲低的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體，所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的序列為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法，所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟一，載體用BamH I，EcoR I雙酶切；

步驟二，酶切完成后膠回收；

步驟三，目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得：

步驟四，處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)；

步驟五，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:DH5a；

步驟六，轉(zhuǎn)化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時(shí)，將菌液送測序公司測序。

進(jìn)一步，所述酶切體系如下。

進(jìn)一步，所述酶切完成后膠回收具體包括：

1)DNA電泳結(jié)束后，用潔凈刀片在紫外線燈下切出相應(yīng)片段；

2)含DNA的瓊脂糖膠塊裝入1.5ml離心管，估算其體積；加入500μl(<150μl凝膠)或3～4倍(>150μl凝膠)凝膠體積的Buffer PS溶膠結(jié)合液；

3)離心管置于50℃～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混懸震蕩10sec，至瓊脂糖凝膠完全溶解，室溫放置5min冷卻；

4)將少于700μl融化膠液轉(zhuǎn)移至插入套管的離心柱內(nèi)，于臺(tái)式離心機(jī)上高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，再將離心柱插入套管；

5)多于700μl的剩余融化膠液，加入同一離心柱內(nèi)，重復(fù)步驟4)；

6)向離心柱內(nèi)加入Buffer PW洗滌液)700μl，高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，將離心柱插入套管；

7)高速離心1～2min后，取出離心柱，棄去套管；

8)將離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管，在離心柱內(nèi)硅膠膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer洗脫液；室溫放置2～5min，高速離心1min，離心管中即得純化的DNA溶液；

9)獲得的DNA溶液，可直接應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，所述目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得包括：

退火程序：

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:DH5a具體包括：

1)吸取連接產(chǎn)物(體積≤10uL)于50-100uL感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻，在冰上放置30min；

2)將離心管放到42℃水浴中，熱激90s，取出后迅速放于冰上，冷卻1-2min；

3)向離心管中加入5倍體積的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45-60min；

4)8,000rpm離心30s，去部分上清，留100uL左右培養(yǎng)液，移液槍吸打均勻后，用三角涂布棒涂布在選擇性LB平板上；

5)倒置培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)12-16h，待單菌落長出后，挑取單菌落。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由所述牛PDHB基因腺病毒干擾載體構(gòu)建的重組腺病毒的PDHB shRNA。

本發(fā)明對構(gòu)建的重組腺病毒PDHB shRNA進(jìn)行鑒定，腺病毒PDHB shRNA侵染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞48h，shRNA1、shRNA2和shRNA3對PDHB基因的干擾效率分別為：95.12％、12.69％和97.76％。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP干擾載體圖譜。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的酶切完成后膠回收示意圖；

圖中：左：回收載體pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP；右：DNA Marker；(Marker從上至下依次為：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的干擾效率檢測結(jié)果示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒Ad-shRNA2侵染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的序列為：

牛-PDHB shRNA1的序列為：SEQ ID NO：1

AATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATGGGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTG。

牛-PDHB shRNA2的序列為：SEQ ID NO：2

AATTCGCTGCAACAGTACTGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTG。

牛-PDHB shRNA3的序列為：SEQ ID NO：3

AATTCGCCTCAGGTTAAGGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTG。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的牛PDHB基因腺病毒干擾載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

S101:載體用BamH I，EcoR I雙酶切；

S102：酶切完成后膠回收；

S103：目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得：

S104：處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)；

S105：轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:DH5a；

S106：轉(zhuǎn)化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時(shí)，將菌液送測序公司測序。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

一、腺病毒載體構(gòu)建

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)試劑

載體及目的基因信息

pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP干擾載體圖譜如圖2。

首先用EcoR I，BamH I酶切載體，切掉Scramble序列獲得骨架，之后把目的序列插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子之后來調(diào)控其表達(dá)，該腺病毒載體中含有CMV啟動(dòng)子調(diào)控的GFP基因表達(dá)。

干擾序列設(shè)計(jì)如下：

SiRNA1序列：GAGGATCATAGATACTCCCATATCT

shRNA1序列：

SiRNA2序列：GCTGCAACAGTACTGTCTAAA

shRNA2序列：

SiRNA3序列：CCTCAGGTTAAGGACATCATATTTG

shRNA3序列：

1.2實(shí)驗(yàn)流程

B-PDHB shRNA的構(gòu)建

1.2.1引物由上海桑尼生物合成PAGE膠純化的oligo序列，分別稀釋至100uM

1.2.2載體用BamH I，EcoR I雙酶切，酶切體系如下。

1.2.3酶切完成后膠回收，如圖3所示。

1)DNA電泳(建議使用TAE緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳)結(jié)束后，用潔凈刀片在紫外線燈下切出相應(yīng)片段。仔細(xì)將膠塊中無DNA部分去除掉。

2)含DNA的瓊脂糖膠塊裝入1.5ml離心管，估算其體積。加入500μl(<150μl凝膠)或3～4倍(>150μl凝膠)凝膠體積的Buffer PS(溶膠結(jié)合液)。

3)離心管置于50～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混懸震蕩10sec，至瓊脂糖凝膠完全溶解，室溫放置5min冷卻。

4)將少于700μl融化膠液轉(zhuǎn)移至插入套管的離心柱內(nèi)，于臺(tái)式離心機(jī)上高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，再將離心柱插入套管。

5)多于700μl的剩余融化膠液，加入同一離心柱內(nèi)，重復(fù)步驟4。

6)向離心柱內(nèi)加入Buffer PW(洗滌液)700μl，高速離心1min，棄去套管內(nèi)廢液，將離心柱插入套管。

7)此步驟可省略，直接進(jìn)行步驟8。向離心柱內(nèi)加入Buffer PW(洗滌液)200μl，高速離心1～2min。

8)高速離心1～2min后，小心取出離心柱，不要沾上套管內(nèi)的廢液。棄去套管。

9)將離心柱插入一個(gè)新的1.5ml離心管，在離心柱內(nèi)硅膠膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer(洗脫液)，不要觸及硅膠膜；室溫放置2～5min，高速離心1min，離心管中即得純化的DNA溶液。

10)獲得的DNA溶液，可直接應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4目的片斷利用3’和5’的單鏈退火獲得：

退火程序：

1.2.5處理好的目的片段與載體連接反應(yīng)體系：

以上連接液在

16℃過夜。

1.2.6轉(zhuǎn)化(感受態(tài)細(xì)胞:DH5a)，具體步驟：

1)吸取連接產(chǎn)物(體積≤10uL)于50-100uL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混合均勻，在冰上放置30min；

2)將離心管放到42℃水浴中，熱激90s(嚴(yán)格控制熱擊時(shí)間)，取出后迅速放于冰上，冷卻1-2min；

3)向離心管中加入5倍體積的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45-60min；

4)8,000rpm離心30s，去部分上清，留100uL左右培養(yǎng)液，移液槍吸打均勻后，用三角涂布棒涂布在選擇性LB平板(含相應(yīng)抗生素)上；

5)倒置培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)12-16h，待單菌落長出后，挑取單菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。

抗性:Amp；37℃，培養(yǎng)過夜

1.2.7轉(zhuǎn)化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14小時(shí)，將菌液送測序公司測序。

1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

B-PDHB shRNA1測序結(jié)果：(下劃線區(qū)域?yàn)槟康男蛄?TGAATTACGATCTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATGGGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGGCGACGTAACGGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCG

B-PDHB shRNA2測序結(jié)果：(下劃線區(qū)域?yàn)槟康男蛄?

TGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCTGCAACAGTACTGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCC

B-PDHB shRNA3測序結(jié)果：(下劃線區(qū)域?yàn)槟康男蛄?

ACCCGAGCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCCTCAGGTTAAGGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGGCAGTGCTTCAG

二、重組腺病毒PDHB shRNA腺病毒的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)流程

2.1材料

人胚腎細(xì)胞系HEK293cell由漢恒生物公司長期保存；DMEM購于Hyclone公司；LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品；胎牛血清、胰酶購于Hyclone公司；60mm培養(yǎng)皿、10cm培養(yǎng)皿、96孔板、移液管(5ml,10ml)、15ml及50ml離心管均購自NEST公司；雙抗購自invitrogen公司；濾膜濾器購自Millipore公司。

2.2方法

2.2.1大量制備重組質(zhì)粒

1)將對數(shù)生長期的菌液2ml加入100mL含100ug/ml Amp的LB培養(yǎng)基中；

2)37℃300rpm震蕩搖菌過夜；

3)用康為世紀(jì)中提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒；

2.2.2重組腺病毒載體的包裝，收毒及擴(kuò)增；

2.2.2.1鋪細(xì)胞：

轉(zhuǎn)染前一天，將293細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置37℃含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

2.2.2.2轉(zhuǎn)染

待細(xì)胞生長至底面積的長滿到70～80％時(shí)，取重組腺病毒載體質(zhì)粒PDHB shRNA及骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟為：

a.轉(zhuǎn)染前2小時(shí)更換完全培養(yǎng)基。取2ug重組腺病毒載體質(zhì)粒PDHB shRNA，4ug骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG。用300μl的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min。

b.取15ul的LipofiterTM，用300μl的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，室溫放置5min。

c.將兩者混和，室溫避光放置20min。然后將混合物加入到60mm培養(yǎng)皿中，8字搖晃后置于37℃含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注：LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考LipofiterTM說明書。

2.2.2.3換液

轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.2.2.4收毒(P1)：

每天觀察細(xì)胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒。將60mm培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞及培養(yǎng)液收于15ml離心管中。

2.2.2.5凍融：

打開恒溫水浴鍋至37℃，將15ml離心管在液氮及37℃水浴反復(fù)凍融三次。3000rpm離心5分鐘，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為Ad-PDHB shRNA第一代毒種(P1)，將作為隨后大量病毒擴(kuò)增的毒種。

三、重組腺病毒PDHB shRNA干擾效率檢測

3.1材料

本試驗(yàn)用到的牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分離自出生3日齡的秦川公牛背最長??；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25％EDTA均購自美國invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

3.2方法

當(dāng)牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞生長到80％左右時(shí)，分別侵染高滴度病毒Ad-PDHB和Ad-EGFP。侵染48h后觀察綠色熒光表情況，收集細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測檢測PDHB基因的表達(dá)情況。定量引物為PDHB-RT-F：TCTGAGATGGGCTTTGCTGG，PDHB-RT-R：TGACCTGGTCGATGGCTTGC，PCR產(chǎn)物大小為109bp。以牛GAPDH基因(Accession No.NM_001034034)作為內(nèi)參，引物為：GAPDH-RT-F：CCAACGTGTCTGTTGTGGAT，GAPDH-RT-R：CTGCTTCACCACCTTCTTGA，PCR產(chǎn)物大小為80bp。

3.3結(jié)果

如圖4所示，腺病毒PDHB shRNA侵染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞48h，shRNA1、shRNA2和shRNA3對PDHB基因的干擾效率分別為：95.12％、12.69％和97.76％。

如圖5所示，腺病毒Ad-shRNA2侵染牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞48h，檢測到熒光表達(dá)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120> 一種牛PDHB基因腺病毒干擾載體及其構(gòu)建方法

<160> 3

<210>1

<211> 71

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATGGGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTG

<210>2

<211> 63

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGCTGCAACAGTACTGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTG

<210>3

<211> 72

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGCCTCAGGTTAAGGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTG