本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

花青素作為一種廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于類黃酮類物質(zhì)，存在于27個(gè)科的72個(gè)屬的開花植物中(Sarma et al.,1997)。作為一種天然色素,花青素是水溶性的并能賦予許多鮮花和水果紫色、藍(lán)色和紅色等顏色,并能促進(jìn)傳粉和種子分散(Shang et al.,2011)。許多研究證實(shí),天然花青素能保護(hù)植物免受一些生物和非生物脅迫(Ballaréet al.,2003)。另外，富含花青素的飲食對(duì)于人類健康具有明顯的保健功能?；ㄇ嗨鼐哂兄委熌承┞约膊±绺哐呛鸵种颇[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，以及提高視力的作用。

目前，影響植物花青素合成的基因主要分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因兩大類。其中結(jié)構(gòu)基因是直接編碼花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，主要包括CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UF3GT等。這些結(jié)構(gòu)基因參與了花青素合成的不同階段，其中CHS、CHI、F3H等屬于早期結(jié)構(gòu)基因，而DFR、ANS、UF3GT等屬于晚期合成結(jié)構(gòu)基因。而調(diào)控基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的，它們能夠參與調(diào)控以上結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)(Holton et al.,2015)。轉(zhuǎn)錄因子主要是一些MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合物，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合花青素合成上游相關(guān)結(jié)構(gòu)基因(PAL、C4H、CHI等)的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控其表達(dá)(Zhang et al.,2015)。bHLH則能夠與MYB互作有利于其形成的復(fù)合物激活花青素下游一些結(jié)構(gòu)基因(DFR、ANS、UF3GT等)的啟動(dòng)子并進(jìn)行表達(dá)(Xu et al.,2015)。而WD40蛋白能夠通過結(jié)合bHLH來維持MBW復(fù)合物的穩(wěn)定性。例如，擬南芥中的AtPAP1/PAP2(MYB)、AtTTG1(WD40)以及AtTT8/GL3/EGL3(bHLH)共同調(diào)控花青素結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而影響擬南芥中花青素的合成(Hichri et al.,2011)。

龍葵因具有多種生物活性被作為一種傳統(tǒng)的中藥植物廣泛種植，其具有繁殖快速，結(jié)實(shí)率高的特點(diǎn)。其植株提取物具有消炎，抗菌，抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用。龍葵中雖然含有豐富的花青素(Huang et al.,2010)，但是目前還沒有研究對(duì)龍葵中花青素的合成調(diào)控機(jī)制，及其相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。因此，根據(jù)下述原因，對(duì)龍葵中花青素合成調(diào)控基因的克隆及功能驗(yàn)證具有重大應(yīng)用價(jià)值：(1)Huang(2010)等在通過酸化處理龍葵果實(shí)0.5h后檢測(cè)其中花青素含量達(dá)到了1.28mg/g，而Gavrilova(2011)等檢測(cè)了作為花青素重要提取來源的藍(lán)莓及黑加侖中的花青素含量，由于品種不同其含量?jī)H為0.41-0.83mg/g以及0.14-1.8m g/g不等。這也暗示高花青素含量的龍葵果實(shí)可作為重要的花青素提取來源；(2)作為花青素重要的潛在提取來源，了解龍葵中花青素的合成調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘新的花青素合成相關(guān)基因，為利用這些相關(guān)基因資源培育高花青素品種植株提供重要理論參考價(jià)值。

分離克隆花青素合成調(diào)控基因是對(duì)龍葵中花青素合成機(jī)理研究的前提，但是由于龍葵基因組測(cè)序工作還未完成，其基因序列未知，使得從其中克隆分離基因會(huì)有一定難度，也因此很少有研究對(duì)于龍葵中花青素相關(guān)調(diào)控基因的克隆及功能分析進(jìn)行研究報(bào)道。因此，尋找一種龍葵花青素合成調(diào)控基因，以及其簡(jiǎn)便可靠的基因克隆方法，以及功能驗(yàn)證方法對(duì)于從龍葵中克隆花青素合成調(diào)控基因及其功能驗(yàn)證是亟待解決的問題之一，該問題的解決將會(huì)為后來發(fā)掘這些花青素合成調(diào)控基因以及利用其作為基因操控對(duì)象培育高花青素含量株系提供重要應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示,其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；發(fā)明人通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物來擴(kuò)增SnATCN基因的保守區(qū)域,然后再通過RACE-PCR的方法從龍葵cDNA中擴(kuò)增得到SnATCN基因的全長(zhǎng)DNA序列；同時(shí)發(fā)現(xiàn)龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量變化和SnATCN基因表達(dá)量變化成正相關(guān)關(guān)系，最后將SnATCN基因在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，證實(shí)其能夠激活煙草中花青素的合成，最終驗(yàn)證SnATCN基因?qū)τ邶埧ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控功能。

上述的SnATCN基因是在龍葵基因組序列未知的情況下通過RACE-PCR的方法克隆獲得，接著對(duì)于SnATCN基因的花青素正調(diào)控功能驗(yàn)證是通過將其在煙草中瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)花青素積累完成的。

發(fā)明人發(fā)明人首先設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，從龍葵中克隆得到一個(gè)保守序列，將該保守序列進(jìn)行測(cè)序如SEQ ID No.1所示；

更進(jìn)一步的，發(fā)明人從SnATCN基因保守序列設(shè)計(jì)了3’RACE以及5’RACE PCR的特異性引物，進(jìn)行SnATCN基因的5’cDNA以及3’cDNA末端的擴(kuò)增，將其序列進(jìn)行測(cè)序如SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示；

最后通過從5’cDNA以及3’cDNA末端序列設(shè)計(jì)SnATCN基因的全長(zhǎng)DNA序列特異性擴(kuò)增引物，得到了SnATCN基因的全長(zhǎng)DNA序列，如SEQ ID No.4所示,其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

在龍葵中獲得了SnATCN基因后，又對(duì)龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段中花青素含量以及SnATCN基因的表達(dá)量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)成熟，花青素含量不斷提高的同時(shí)SnATCN基因的表達(dá)量也不斷提高，相關(guān)系數(shù)r＝0.93證實(shí)二者之前存在一個(gè)明顯的正相關(guān)關(guān)系。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明人將SnATCN基因克隆到瞬時(shí)表達(dá)載體pGR106中轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)，然后在煙草葉片中注射進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SnATCN基因能夠誘導(dǎo)煙草葉片中花青素的合成，同時(shí)隨著煙草中花青素的積累，SnATCN基因的表達(dá)量也不斷提高，相關(guān)系數(shù)r＝0.97也證實(shí)二者之間存在一個(gè)明顯的正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國(guó)際上首次提供了一個(gè)龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN的DNA序列，以及SnATCN基因的分離克隆和功能驗(yàn)證方法。發(fā)明人首先利用RACE-PCR的方法從龍葵中克隆到SnATCN基因的全長(zhǎng)DNA序列，然后對(duì)SnATCN基因的表達(dá)水平及其與龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)二者正相關(guān)。最后發(fā)明人將SnATCN基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草中進(jìn)行注射，發(fā)現(xiàn)SnATCN基因能夠誘導(dǎo)煙草中花青素的合成，從而驗(yàn)證了SnATCN基因?qū)τ邶埧谢ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明通過RACE-PCR的方法克隆龍葵中SnATCN基因的膠圖；

圖中可見1-4號(hào)泳道分別是SnATCN基因的保守序列(113bp)、5’cDNA末端(564bp)、3’cDNA末端(844bp)以及全長(zhǎng)DNA序列(792bp)；

圖2為龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量與SnATCN基因表達(dá)量變化關(guān)系；

圖中可見隨著果實(shí)中花青素含量升高(圖2A,B)，SnATCN基因表達(dá)量也出現(xiàn)了類似的變化(圖2C)，相關(guān)系數(shù)r＝0.93證實(shí)二者之前存在明顯的正相關(guān)關(guān)系；

圖3為將SnATCN基因克隆到pGR106瞬時(shí)表達(dá)載體并在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)功能驗(yàn)證效果圖；

注射含SnATCN基因農(nóng)桿菌的葉片出現(xiàn)深紫色花青素積累(圖3A中右半部分葉片)，且顏色會(huì)隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)而變深，證實(shí)花青素積累越多，并且隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)花青素含量以及SnATCN基因表達(dá)量都有明顯的上升(圖3B,C)，相關(guān)系數(shù)r＝0.97證實(shí)二者之前存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，但是注射只含空載體的農(nóng)桿菌的葉片則無花青素積累(圖3A左半部分葉片)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

實(shí)施例1 目的基因克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

1.從龍葵中克隆分離SnATCN基因的保守序列

首先利用SIGMA公司的TRIZOL REAGENT提取龍葵的RNA，然后用康為世紀(jì)公司的HiFiScript cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到龍葵cDNA，上述兩步均采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)。

再以該cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物Degenerate-F(GAAGT(A/G/T)AG(A/G)AAAGG(A/G/T)CC(A/C)TGGA)(序列SEQ ID No.6)以及Degenerate-R(GACCAGA(A/G/T)(A/G)TC(C/T)TCCAT(A/G)CTCCA)(序列SEQ ID No.7)進(jìn)行SnATCN基因保守序列的擴(kuò)增，獲得序列如SEQ ID No.1所示。

擴(kuò)增體系如下：龍葵cDNA 50ng，簡(jiǎn)并引物Degenerate-F/R(10μmol/L)各1μL，高保真DNA聚合酶Lamp(5U/μL)0.5μL,2.5mmol/L dNTP混合液5μL,10×PCR buffer 5μL，加ddH₂O補(bǔ)充體系至50μL。其PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃3min,變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃15s，反應(yīng)循環(huán)30個(gè)，后延伸72℃5min。

2.SnATCN基因全長(zhǎng)DNA序列的獲得

(1)RACE-PCR所需第一鏈cDNA合成步驟：

反應(yīng)體系1：1–3.5μl RNA，1μl 3’SMART CDS Primer II A(12μM)引物(購(gòu)買于Takara生物公司的RACE 5’/3’Kit)，加ddH₂O補(bǔ)充體系至4.5μl。72℃反應(yīng)3min，42℃反應(yīng)2min。

反應(yīng)體系2：2μl 5X First-Strand Buffer，0.25μl DTT(100mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl SMARTer II A Oligonucleotide(12μM)(購(gòu)買于Takara生物公司的RACE 5’/3’Kit)，0.25μl RNase Inhibitor，1μl SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)，共5.5μl體系。

再將上述兩個(gè)體系混合到一起共10μl體系，42℃反應(yīng)1h，70℃反應(yīng)10min，得到第一鏈cDNA。

(2)5’RACE-PCR及3’RACE-PCR分別擴(kuò)增獲得5’-cDNA及3’-cDNA片段：

在獲得SnATCN基因保守序列后，對(duì)其測(cè)序并設(shè)計(jì)5'RACE-NEST-R(序列SEQ ID No.8)及3'RACE-NEST-F(序列SEQ ID No.9)引物分別與Universal Primer Short(UPS)(10μM)引物(購(gòu)買于Takara生物公司的RACE 5’/3’Kit)結(jié)合來擴(kuò)增SnATCN基因的5’-cDNA及3’-cDNA片段。

5’RACE-PCR擴(kuò)增體系如下：龍葵第一鏈cDNA 50ng，5'RACE-NEST-R及UPS(10μmol/L)引物各1.0μL，高保真DNA聚合酶Lamp(5U/μL)0.5μL,2.5mmol/L dNTP混合液5.0μL,10×PCR buffer 5.0μL，加ddH₂O水補(bǔ)充體系至50μL。其PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃3min,變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，反應(yīng)循環(huán)35個(gè)，后延伸72℃10min。獲得SnATCN基因的5’cDNA末端片段(564bp)序列SEQ ID No.2。

3’RACE-PCR擴(kuò)增體系如下：龍葵第一鏈cDNA 50ng，3'RACE-NEST-F及UPS(10μmol/L)引物各1.0μL，高保真DNA聚合酶Lamp(5U/μL)0.5μL,2.5mmol/L dNTP混合液5.0μL,10×PCR buffer 5.0μL，加ddH₂O水補(bǔ)充體系至50μL。其PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃3min,變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，反應(yīng)循環(huán)35個(gè)，后延伸72℃10min。獲得SnATCN基因的3’cDNA末端片段(844bp)序列SEQ ID No.3。

3.SnATCN基因全長(zhǎng)DNA序列的獲得

在獲得SnATCN基因5’cDNA及3’cDNA末端片段后，對(duì)其測(cè)序并設(shè)計(jì)SnATCN基因全長(zhǎng)DNA序列特異性擴(kuò)增引物SnATCN-F(ATGAATACTCCTATAATGTGTACGTCG)(序列SEQ ID No.10)以及SnATCN-R(TTAATTAAGTAGATTCCATAGGTCAAT)(序列SEQ ID No.11)擴(kuò)增得到了SnATCN基因的全長(zhǎng)DNA序列(792bp)，如SEQ ID No.4所示。

實(shí)施例2 SnATCN基因在龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段表達(dá)模式分析

1.龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量變化

首先收集不同發(fā)育階段，分別是綠果期(Green)、變色期(Turn)、紫色期(Purple)、成熟期(Mature)的龍葵果實(shí)(圖2A自左至右)，然后通過HPLC檢測(cè)其果皮中花青素含量，HPLC檢測(cè)條件如下：采用安捷倫公司的1200高效液相色譜儀，C18(SB-C18 4.6×250mm)的色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為520nm，柱溫箱溫度為30℃。流動(dòng)相及洗脫梯度如下：流動(dòng)相A由體積分?jǐn)?shù)87％水,3％乙腈以及10％的甲酸組成；流動(dòng)相B由體積分?jǐn)?shù)40％水,50％乙腈以及10％的甲酸組成；洗脫梯度如下：0min 4％B,20min 20％B,35min 40％B,40min 60％B,45min 90％B,55min 4％B，流速為1mL/min，上述洗脫技術(shù)均采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其果皮花青素含量隨著果實(shí)成熟以及顏色的加深而增多(圖2B)。

2.SnATCN基因在龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

為檢測(cè)龍葵中SnATCN基因的表達(dá)是否與花青素含量的變化存在相關(guān)性，本發(fā)明采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析了SnATCN基因在龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)量變化。取龍葵4個(gè)發(fā)育階段的果皮抽提總RNA，1μg總RNA用DNaseI(Invitrogen,美國(guó))處理30分鐘以去除基因組DNA污染，然后使用康為世紀(jì)公司的Super-Quick RT MasterMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)在CFX96Real-Time System(C1000 thermal cycler)儀器上進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為現(xiàn)有常規(guī)條件，龍葵內(nèi)參基因SnEF1α的表達(dá)量用于RNA樣品的均一化評(píng)價(jià)，利用2^-△△CT相對(duì)定量的方法比較SnATCN基因表達(dá)量變化。

定量RT-PCR技術(shù)中的SnATCN基因以及SnEF1α基因特異引物如下：

SnEF1α-qRT-F1(TTTCACTGCCCAGGTCATCA)(序列SEQ ID No.12),

SnEF1α-qRT-R1(CAAACTTGACAGCAATGTGGGA)(序列SEQ ID No.13)，

SnATCN-qRT-F2(TCGAAACTTCTCAAACGCTAAGAA)(序列SEQ ID No.14)

以及SnATCN-qRT-R2(TGTTGCTTTCGTCATCTTTGTCTAA)(序列SEQ ID No.15)。

結(jié)果顯示，隨著果實(shí)成熟以及花青素含量的增多SnATCN基因的表達(dá)量也在轉(zhuǎn)色期(Turn)開始隨著花青素開始積累也有了明顯的提高(圖2C)?？偨Y(jié)，隨著果實(shí)成熟花青素含量和SnATCN基因的表達(dá)量變化之間存在著明顯的正相關(guān)性(r＝0.93)。這也再次證實(shí)了SnATCN基因?qū)τ邶埧谢ㄇ嗨氐暮铣善鸬秸{(diào)控作用。

實(shí)施例3 龍葵中花青素合成調(diào)控基因SnATCN的瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

利用我們?cè)O(shè)計(jì)的目的基因瞬時(shí)表達(dá)載體引物SnATCN-PGR-F(CCATCGATATGAATACTCCTATAATGTGTACGTCG)序列如SEQ ID No.16所示，以及SnATCN-PGR-R(TTGCGGCCGCTTAATTAAGTAGATTCCATAGGTCAAT)序列如SEQ ID No.17所示，并采用現(xiàn)有的常規(guī)載體構(gòu)建技術(shù)后，成功獲得了目的基因的瞬時(shí)表達(dá)載體。

具體所采用的pGR106瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建步驟如下：利用上述引物SnATCN-PGR-F和SnATCN-PGR-R擴(kuò)增目的DNA片段，經(jīng)ClaI和NotI雙酶切后利用乙醇沉淀純化回收，并與用相同酶處理的pGR106載體連接，連接體系如下：pGR106載體1uL,連接酶Buffer 1uL,T4DNA連接酶0.3uL,目的基因回收片段7.7uL，共10uL體系,16℃連接過夜。42℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑取單克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序后與原序列比對(duì)沒有發(fā)生堿基突變和缺失，說明目的基因瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

實(shí)施例4 龍葵中花青素合成調(diào)控基因SnATCN在煙草中瞬時(shí)表達(dá)功能驗(yàn)證

1.SnATCN基因在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)

將上述SnATCN基因的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)。

具體方法(Yang,2000)如下：將分別含SnATCN基因重組質(zhì)粒和pGR106空載體的農(nóng)桿菌GV3101用10mM MgCl₂重懸，其中加入AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)以及MES(2-N-morpholino-ethanesulphonic acid)，分別調(diào)節(jié)OD₆₀₀＝1.0，28℃靜置3-5h，然后分別用注射器注射三生煙葉片的左右兩邊，將進(jìn)行過農(nóng)桿菌注射的煙草于28℃培養(yǎng)。

2.SnATCN基因在煙草中誘導(dǎo)花青素積累及其表達(dá)量變化

將注射農(nóng)桿菌的煙草葉片拍照觀察，同時(shí)將0d,2d,4d,6d,8d,10d的煙草葉片分左右兩部分剪下，然后分別提取花青素及RNA進(jìn)行含量及表達(dá)量測(cè)定，方法參考實(shí)施例2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：注射SnATCN基因的部分出現(xiàn)了明顯的花青素積累，而注射空載體的另一邊則無花青素積累(圖3A)。且花青素含量隨注射時(shí)間延長(zhǎng)而增加(圖3B)，同樣SnATCN基因表達(dá)量也出現(xiàn)了類似的趨勢(shì)(圖3C)。這些結(jié)果說明SnATCN基因?qū)埧麑?shí)中花青素合成的正調(diào)控作用，同時(shí)也暗示其在其他植物上異源表達(dá)時(shí)也表現(xiàn)出對(duì)花青素合成的正調(diào)控作用。

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用

<160>17

<210>1

<211>113

<212>DNA

<213>龍葵

<400>1

tggtgaagga aagtggcatc ttattcctgc tagagctggt ctaaatagat gtcggaagag 60

ctgtagactg aggtggctaa attatctaag gccacatatc aagagaggtg act 113

<210>2

<211>564

<212>DNA

<213>龍葵

<400>2

actttttttt tttttttttt ttttttttta agtcgagaat ctatcggaaa tagtgtctcc 60

atcaatgcag taaaagtaaa atctgcgtac actttaccct cttcagattt cactttgtaa 120

ttatattgta tgtactttgt tgaaaaagag tagataaaac aaaaacagca cacattaatt 180

attactcctt ccgtttaaaa aaaaatgaca ttctttcctt tttaatctgt ttcaaaaaga 240

atgatccctt tctttttttt ggtaacattt tgatttcacc ttttcacatg acatatttca 300

ggctacaaaa ttaaagaaca tttttgtata tttgacataa ctttaattta ggaccacatg 360

aagattgaaa agtctttttt attttcttaa tttctcaatc attggagttc tcttttttct 420

ttttggcgtc atatccagta ctctgacaca tataatgaat actcctataa tgtgtacgtc 480

gttgggagta aggaaaggtt catggactaa agatgaagat attctcttga gaaaatgcat 540

tcaaaaatat ggtgaaggaa agtg 564

<210>3

<211>844

<212>DNA

<213>龍葵

<400>3

attatctaag gccacatatc aagagaggtg acttcgaacc agatgaagtg gatctcattt 60

tcaggcttca taagctctta ggcaacaagt ggtcactaat tgctggtaga ctttcgggaa 120

ggacagcgaa tgatgtgaaa aactactgga acactcgcct tctaaggaag ttaaatacta 180

atactagtat tactattgct cctcaaaaga ttaacaataa gtgcgaagaa attactaaga 240

ttaataatga tcatgaaata ataagacctc aacctcgaaa cttctcaaac gctaagaaga 300

atatttctca ttggtgcaac aacaatacta tgatcacaaa cacattagac aaagatgacg 360

aaagcaacaa agaaatagta gtaaataata atatttgtga caagccaaca ggagaaaata 420

cgtcatcgtc tatagacaac gatggagttg aatggtggac aagtttactg gaaaattgca 480

atgaaattga agaagaaaat aagttgttac caaatttgtt gcatgaggaa aataattcaa 540

cactcatgca acaaggacaa aatgatggtt gggatgactt ttctgctgat attgacctat 600

ggaatctact taattaatta gtttcatcaa ttctctatta aagactatgt tgtacttgta 660

ataggggaga cattctatta tagttccgtt tgaaactttt gtaaccccaa atacaagtag 720

ccaaggaggg atctaggcta tcaataattt cgattctaag agtttttaat tatatatgaa 780

atttaagaga gttttaaatt tagctttgta aaaaaaacac aagaacatac aaaaaaaaaa 840

aagt 844

<210>4

<211>792

<212>DNA

<213>龍葵

<400>4

atgaatactc ctataatgtg tacgtcgttg ggagtaagaa aaggttcatg gactaaagaa 60

gaagatattc tcttgagaaa atgcattcaa gaatatggtg aaggaaagtg gcatcttatt 120

cctgctagag ctggtctaaa tagatgtcgg aagagctgta gactgaggtg gctaaattat 180

ctaaggccac atatcaagag aggtgacttc gaaccagatg aagtggatct cattttcagg 240

cttcataagc tcttaggcaa caagtggtca ctaattgctg gtagactttc gggaaggaca 300

gcgaatgatg tgaaaaacta ctggaacact cgccttctaa ggaagttaaa tactaatact 360

agtattacta ttgctcctca aaagattaac aataagtgcg aagaaattac taagattaat 420

aatgatcatg aaataataag acctcaacct cgaaacttct caaacgctaa gaagaatatt 480

tctcattggt gcaacaacaa tactatgatc acaaacacat tagacaaaga tgacgaaagc 540

aacaaagaaa tagtagtaaa taataatatt tgtgacaagc caacaggaga aaatacgtca 600

tcgtctatag acaacgatgg agttgaatgg tggacaagtt tactggaaaa ttgcaatgaa 660

attgaagaag aaaataagtt gttaccaaat ttgttgcatg aggaaaataa ttcaacactc 720

atgcaacaag gacaaaatga tggttgggat gacttttctg ctgatattga cctatggaat 780

ctacttaatt aa 792

<210>5

<211>263

<212>PRT

<213>龍葵

<400>5

Met Asn Thr Pro Ile Met Cys Thr Ser Leu Gly Val Arg Lys Gly Ser

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Ile Leu Leu Arg Lys Cys Ile Gln Glu Tyr

20 25 30

Gly Glu Gly Lys Trp His Leu Ile Pro Ala Arg Ala Gly Leu Asn Arg

35 40 45

Cys Arg Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro His

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asp Phe Glu Pro Asp Glu Val Asp Leu Ile Phe Arg

65 70 75 80

Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Ser Gly Arg Thr Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr Arg Leu

100 105 110

Leu Arg Lys Leu Asn Thr Asn Thr Ser Ile Thr Ile Ala Pro Gln Lys

115 120 125

Ile Asn Asn Lys Cys Glu Glu Ile Thr Lys Ile Asn Asn Asp His Glu

130 135 140

Ile Ile Arg Pro Gln Pro Arg Asn Phe Ser Asn Ala Lys Lys Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Trp Cys Asn Asn Asn Thr Met Ile Thr Asn Thr Leu Asp Lys

165 170 175

Asp Asp Glu Ser Asn Lys Glu Ile Val Val Asn Asn Asn Ile Cys Asp

180 185 190

Lys Pro Thr Gly Glu Asn Thr Ser Ser Ser Ile Asp Asn Asp Gly Val

195 200 205

Glu Trp Trp Thr Ser Leu Leu Glu Asn Cys Asn Glu Ile Glu Glu Glu

210 215 220

Asn Lys Leu Leu Pro Asn Leu Leu His Glu Glu Asn Asn Ser Thr Leu

225 230 235 240

Met Gln Gln Gly Gln Asn Asp Gly Trp Asp Asp Phe Ser Ala Asp Ile

245 250 255

Asp Leu Trp Asn Leu Leu Asn *

260 263

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(6,15)

<223>n=a或g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)

<223>n=a或g

<220>

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<222>(18)

<223>n=a或c

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gaagtnagna aaggnccntg ga 22

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<220>

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<223>n=a或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)

<223>n=t或c

<400>7

gaccagannt cntccatnct cca 23

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<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tttaccagct ctagcaggaa taagatgc 28

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<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cgaaaaagtt gtagactgag gtggttga 28

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<212>DNA

<213>人工序列

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atgaatactc ctataatgtg tacgtcg 27

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<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

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ttaattaagt agattccata ggtcaat 27

<210>12

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<212>DNA

<213>人工序列

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tttcactgcc caggtcatca 20

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<211>22

<212>DNA

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<400>13

caaacttgac agcaatgtgg ga 22

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<212>DNA

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tcgaaacttc tcaaacgcta agaa 24

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<211>25

<212>DNA

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<400>15

tgttgctttc gtcatctttg tctaa 25

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<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

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ccatcgatat gaatactcct ataatgtgta cgtcg 35

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<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ttgcggccgc ttaattaagt agattccata ggtcaat 37