本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種犬松弛素原重組蛋白的制備方法，本發(fā)明還涉及一種犬松弛素原多克隆抗體的制備方法。

背景技術(shù)：

松弛素(Relaxin，RLX)為胰島素家族的一種短肽激素，具有廣泛的生理功能，包括生殖調(diào)控、舒張血管、抗炎及促進(jìn)炎性損傷愈合等，臨床應(yīng)用顯示松弛素用于血壓正常或升高的急性心衰患者，可改善患者呼吸困難和其它臨床癥狀。在體內(nèi)，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯首先合成前松弛素原(preprorelaxin)，犬前松弛素原基因序列全長(zhǎng)534bp，編碼177個(gè)氨基酸，包括A、B、C3個(gè)區(qū)域和1個(gè)信號(hào)肽；前松弛素原在信號(hào)肽酶作用下，切割信號(hào)肽后轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谒卦?prorelaxin)，其結(jié)構(gòu)包含B鏈、C肽和A鏈；松弛素原通過(guò)蛋白酶水解切除C肽，形成具有活性的成熟松弛素，包括AB鏈及鏈內(nèi)鏈間的三對(duì)二硫鍵。已有的研究顯示松弛素原和松弛素可在血漿中檢測(cè)到。

研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期犬松弛素的分泌量逐漸增多，犬妊娠20d-30d血清松弛素濃度顯著高于未懷孕時(shí)(未孕時(shí)其含量幾乎可忽略不計(jì))，妊娠35d血清松弛素含量最高，濃度為10ug/mL，分娩時(shí)或自發(fā)流產(chǎn)前突然降到檢測(cè)不到的水平；Steinetz等(1996年)報(bào)道孕犬血清松弛素最早在妊娠18d時(shí)檢測(cè)到，證實(shí)松弛素是犬妊娠早期的產(chǎn)物，可作為判斷犬妊娠的一個(gè)標(biāo)志；Braun等(1999年)報(bào)道妊娠期伊比利亞猞猁在妊娠32d-56d血清松弛素呈陽(yáng)性，而尿液呈陰性，將妊娠29d-46d尿液濃縮可檢出松弛素，提示可用于野生動(dòng)物妊娠診斷的一種手段。國(guó)外犬松弛素檢測(cè)的ELISA試劑盒已商業(yè)化，臨床上在妊娠21d的犬血清中可檢測(cè)到，通過(guò)檢測(cè)松弛素對(duì)犬進(jìn)行妊娠診斷已在美洲推廣使用，但在中國(guó)還未推廣使用。

松弛素可在化學(xué)合成其A肽鏈和B肽鏈的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)體外折疊獲得，但松弛素分子量較小僅6kD，難以測(cè)定其產(chǎn)物含量。利用基因工程技術(shù)克隆松弛素原基因并進(jìn)行體外表達(dá)，已被證明是松弛素制備的有效技術(shù)途徑。Reddy等(1992 年)報(bào)道豬松弛素原在大腸桿菌中成功進(jìn)行原核表達(dá)，其蛋白質(zhì)以包涵體形式在胞漿存在，占菌體蛋白的8％。Ann等(1993年)將豬松弛素cDNA在真核細(xì)胞CHO細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白質(zhì)為19kD的松弛素原，含量為250ng/ml。丁傳天等(1997年)報(bào)道人黃體松弛素原基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)，是分子量為20kD的可溶蛋白，占菌體蛋白的30％。Neumann等(2006年)將馬松弛素原基因轉(zhuǎn)染到MAC-T細(xì)胞中，得到分子量為19kD的馬松弛素原產(chǎn)物。綜上，目前對(duì)松弛素重組蛋白的研究主要集中在人、豬和馬等，商品化的松弛素重組蛋白及抗體多為人源化，國(guó)外克隆了犬前松弛素原的基因序列，但犬松弛素原重組蛋白及其抗體制備還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)，以分娩時(shí)犬胎盤組織為材料克隆犬前松弛素原基因cDNA并進(jìn)行測(cè)序，生物信息學(xué)分析顯示為犬前松弛素原基因編碼序列，進(jìn)而通過(guò)PCR擴(kuò)增犬松弛素原基因cDNA，成功構(gòu)建犬松弛素原原核表達(dá)載體pET28a-prorelaxin，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得重組蛋白，再以犬松弛素原重組蛋白作為免疫原免疫新西蘭家兔，制備犬松弛素原多克隆抗體。犬松弛素原重組蛋白的獲得，可望制成藥物，用于妊娠維持，調(diào)控分娩進(jìn)程，治療難產(chǎn)，以及用于舒張血管、抗炎、促進(jìn)組織愈合和抗纖維化等，為進(jìn)一步研究犬松弛素生理功能及更好地將犬松弛素原用于臨床打下基礎(chǔ)。通過(guò)本方法制備的犬松弛素原多克隆抗體可用于建立松弛素原檢測(cè)的各種技術(shù)，以對(duì)犬的生理機(jī)能進(jìn)行評(píng)判，如用于犬妊娠診斷，完善犬松弛素原的臨床應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前無(wú)犬松弛素原重組蛋白及多克隆抗體制備的報(bào)道，本發(fā)明的目的是提供一種犬松弛素原基因工程重組蛋白的制備方法；本發(fā)明利用原核表達(dá)易培養(yǎng)、表達(dá)量高等特點(diǎn)，將表達(dá)的重組蛋白作為免疫原免疫新西蘭家兔，得到特異性強(qiáng)、效價(jià)高的兔抗犬松弛素原多克隆抗體。

本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，一種犬松弛素原重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、以犬前松弛素原基因cDNA的克隆質(zhì)粒pMD19-T-preprorelaxin為材料，提取質(zhì)粒DNA，以GenBank公布的犬松弛素原基因cDNA序列設(shè)計(jì)并合成的一對(duì)上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

步驟2、構(gòu)建含有步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆載體pMD19-T-prorelaxin；

步驟3、將步驟2獲得的克隆載體pMD19-T-prorelaxin加入到冰預(yù)冷的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，接種5ml含濃度為100μg/mlAMP的LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)培養(yǎng)表達(dá)質(zhì)粒pET28a的菌株，并用BamHI與XhoI雙酶切，進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化，得到pET28a-prorelaxin表達(dá)菌；

步驟4、培養(yǎng)pET28a-prorelaxin表達(dá)菌，使用IPTG誘導(dǎo)pET28a-prorelaxin表達(dá)菌，產(chǎn)生粗重組犬松弛素原蛋白；

步驟5、采用親和層析純化粗重組犬松弛素原蛋白，在200-500mM咪唑處洗脫獲得高濃度蛋白，所述重組犬松弛素原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在上述技術(shù)方案中，步驟1中PCR擴(kuò)增引物具體為：上游引物P1：5'-GCGGATCCATGACGGATGACAA-3'，其堿基序列如SEQ ID NO：3所示；下游引物P2：5'-GCCTCGAGTCAGCATCGGCTAG-3'，其堿基序列如SEQ ID NO：4所示。

步驟2構(gòu)建pMD19-T-prorelaxin克隆載體的連接體系為：膠回收純化產(chǎn)物5.0μL，載體0.5μL，SolutionI 4.5μL。

步驟3中酶切體系為：pMD19-T-prorelaxin或pET28a 20.0μL，BamHI 5.0μL，XhoI 5.0μL，10×Kbuffer 5.0μL，ddH₂O 15.0μL，37℃作用4h。

步驟4中pET28a-prorelaxin表達(dá)菌的培養(yǎng)具體為：挑取單菌落于10mlLB培養(yǎng)基中，37℃250rpm，過(guò)夜；轉(zhuǎn)接1％過(guò)夜菌于1000mlLB培養(yǎng)基，37℃250rpm 3小時(shí)，然后加入1mM IPTG，25℃誘導(dǎo)5小時(shí)；離心收集1000ml表達(dá)目標(biāo)蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)物，超聲破菌于40ml破菌緩沖液中，離心后分別收集沉淀和上清；將沉淀用NTAU溶解，離心取溶解上清，上樣于預(yù)先平衡好的NTA純化柱，其中，NTA純化柱為5mlNTA介質(zhì)，10倍柱體積NTAU-0緩沖液平衡；樣品上樣完成以后，使用NATU-0緩沖液洗柱8-10個(gè)柱體積；順序使用NATU-X緩沖液各洗柱1個(gè)柱體積，X為不同濃度咪唑；分步收集不同組分并電泳檢測(cè)，收集得到重組犬松弛素原蛋白。

本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，一種犬松弛素原的多克隆抗體制備方法，包括以下步驟：

步驟1、采用上述方法制備重組犬松弛素原蛋白；

步驟2、以步驟1中的重組犬松弛素原蛋白為抗原，對(duì)新西蘭家兔進(jìn)行免疫處理；

步驟3、對(duì)新西蘭家兔頸動(dòng)脈取血，收集血清，血清經(jīng)ProteinA柱純化，得到特異性針對(duì)目的蛋白的抗體。

在上述技術(shù)方案中，步驟2中對(duì)新西蘭家兔進(jìn)行的免疫處理具體為：采用重組prorelaxin蛋白作為免疫抗原，分裝保存于4℃條件下，第1天，取1ml抗原加入1ml弗氏完全佐劑，乳化，頸背部皮下至少8點(diǎn)注射，免疫2只新西蘭白兔；第15天，取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐劑，乳化，頸背部皮下至少8點(diǎn)注射，免疫2只新西蘭白兔；第29天，取1ml抗原加入1ml福氏不完全佐劑，乳化,頸背部皮下至少8點(diǎn)注射，免疫2只新西蘭白兔；第43天，取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐劑，乳化，頸背部皮下至少8點(diǎn)注射，免疫2只新西蘭白兔；第53天，頸動(dòng)脈取血，將兔子處死；兔血在4度放置過(guò)夜，于4℃，10000rpm條件下離心30分鐘，收集上清，即得血清。

步驟3中血清純化具體為：血清經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾；取出protein A柱，用10倍柱體積PBS平衡，待PBS流干后，血清上樣過(guò)柱，收集流穿；5倍柱體積PBS平衡，流干后，加入5倍柱體積的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，收集洗脫液，每管1ml，預(yù)先加入90ul、1M、pH8.8的Tris溶液中和；加入10倍柱體積PBS平衡，流干后加入2倍柱體積的20％乙醇，4度保存柱子；收集的洗脫液，完成純化。

本發(fā)明所說(shuō)的犬松弛素原重組蛋白及犬松弛素原多克隆抗體在臨床上的應(yīng)用。本發(fā)明的犬松弛素原重組蛋白可制成相關(guān)制品。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：松弛素具有廣泛的生理功能：一、在妊娠或胚胎植入時(shí)，注射松弛素可抑制子宮肌收縮；二、在分娩時(shí)，注射松弛素可軟化子宮頸，促進(jìn)恥骨聯(lián)合分離。在卵泡發(fā)育和排卵、妊娠期間乳腺生長(zhǎng)、胎兒附植以及發(fā)動(dòng)分娩等方面起重要作用。它可以促進(jìn)胎盤生長(zhǎng)，在妊娠早期可以增加子宮血流量。經(jīng)多年的研究現(xiàn)認(rèn)識(shí)到，松弛素在非妊娠系統(tǒng)也有重要作用，如舒張血管、促進(jìn)組織愈合、抗纖維化、刺激組織重構(gòu)、維持器官穩(wěn)態(tài)等作用。因此可將其制成藥品用于子宮陣痛、妊娠維持、促進(jìn)分娩、預(yù)防早產(chǎn)難產(chǎn)和胎衣不下、抗炎及治療心血管疾病等。

本發(fā)明所說(shuō)的犬松弛素原多克隆抗體在臨床上的應(yīng)用。通過(guò)本方法制備的犬松弛素原多克隆抗體可用于建立松弛素原檢測(cè)的各種技術(shù)，進(jìn)而檢測(cè)樣品中犬 松弛素原的分布和含量，以對(duì)犬的生理機(jī)能進(jìn)行評(píng)判，如用于犬妊娠診斷，完善犬松弛素原的臨床應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次嘗試通過(guò)犬松弛素原基因原核表達(dá)在體外獲得犬松弛素原重組蛋白，相對(duì)于通過(guò)感染動(dòng)物細(xì)胞和化學(xué)合成來(lái)獲得純化的松弛素原蛋白，具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本低廉、蛋白表達(dá)量高等特點(diǎn)。

犬松弛素原重組蛋白純化后作為免疫原，免疫新西蘭家兔獲得多克隆抗體。本發(fā)明多克隆抗體的制備，具有制備程序簡(jiǎn)單、制備時(shí)間短、成本低廉、蛋白表達(dá)量高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。

所獲得的犬松弛素原重組蛋白和高效價(jià)的犬松弛素原多克隆抗體，可以為進(jìn)一步研究犬松弛素原的功能與作用奠定基礎(chǔ)。將松弛素原重組蛋白制成相關(guān)藥品，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值；以犬松弛素原多克隆抗體建立檢測(cè)犬松弛素原的方法，分析樣品中松弛素原的分布和含量，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：

圖1prorelaxin片段的擴(kuò)增圖，其中：M，DNAMaker；1，北京犬prorelaxin基因；

圖2pET28a-prorelaxin重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖，其中：M，DNA Maker；1，pET28a-prorelaxin重組質(zhì)粒；

圖3本發(fā)明重組蛋白超聲波裂解的SDS-PAGE電泳圖，其中：M，蛋白分子量標(biāo)(170kD，130kD，95kD，72kD，55kD，43kD，34kD，26kD，17kD，11kD)；Lane1，pET28a-prorelaxin總菌體裂解液(未誘導(dǎo))；Lane2，pET28a-prorelaxin總菌體裂解液(1mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后，28℃)；Lane3，超聲波裂解后的上清液；Lane4，超聲波裂解后的沉淀物；

圖4本發(fā)明重組蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖，其中：M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(170kD，130kD，95kD，72kD，55kD，43kD，34kD，26kD，17kD，11kD)；Lane1，超聲波裂解后的沉淀物(待純化樣品)；Lane2，流穿樣品；Lane3，NTAU-10洗脫樣品；Lane4，NTAU-50洗脫樣品；Lane5，NTAU-20洗脫樣品；Lane6，NTAU-500洗脫樣品。*NTAU-10/50/200/500為10/50/200/500不同咪唑濃度；

圖5本發(fā)明重組蛋白的免疫印跡圖，其中：圖4中Lane 5和Lane6泳道的蛋白樣品分別對(duì)應(yīng)本圖Lane 1和Lane 2的蛋白樣品；

圖6本發(fā)明多克隆抗體特異性檢測(cè)的Western blotting圖，其中：1-2均為犬松弛素原蛋白。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明提供一種犬松弛素原基因，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供一種犬犬松弛素原重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明采用的材料如下：

A、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及組織、菌種、表達(dá)載體：犬胎盤組織取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院剖腹產(chǎn)的一只北京犬，PBS清洗后分別剪成小塊，分裝于含RNA保存液的離心管中，-70℃保存。pMD19-T感受態(tài)細(xì)胞及克隆宿主菌E.coliDH5α，pET28a表達(dá)載體及BL21(DE3)表達(dá)菌株均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。2只3月齡左右健康新西蘭家兔，體重約2.0kg。

B、主要生物學(xué)試劑：限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司，DNA片段純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司，PrimeSTAR HS DNAPolymerase(高保真酶)、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量購(gòu)自Fermentas公司，兔抗His多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Rockland公司；其余相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。

C、主要溶液的配制

細(xì)菌裂解緩沖液：50mM PBS，pH 7.4，0.5M NaCl；

NTAU-X緩沖液：50mM PBS，pH 7.4，0.5M NaCl，8M Urea，X mM咪唑。

D、主要儀器設(shè)備

Mltrasonieproeessor-500超聲波裂解器，Autoseienee公司產(chǎn)品；Sigmal-15普通離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；Mini-SUB凝膠電泳裝置，GelDoc2000凝膠成像分析系統(tǒng)，MiniProtean3凝膠電泳儀及轉(zhuǎn)印裝置，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1犬松弛素原基因的原核表達(dá)

1.1、犬松弛素原基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與基因克隆

檢索Genbank獲得犬preprorelaxin基因cDNA序列(登錄號(hào)：NM_001003132.1)，用生物信息學(xué)網(wǎng)站提供的在線軟件分析序列，獲得犬松弛素原(prorelaxin)基因cDNA序列。針對(duì)犬松弛素原基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并在5'端引入BamHI酶切位點(diǎn)，3'端引入XhoI酶切位點(diǎn)。其中：上游引物P1：5'-GCGGATCCATGACGGATGACAA-3'，下游引物P2：5'-GCCTCGAGTCAGCATCGGCTAG-3'。

以北京犬前松弛素原基因cDNA的克隆質(zhì)粒pMD19-T-preprorelaxin為材料，提取質(zhì)粒DNA，以P1和P2作為擴(kuò)增用引物，擴(kuò)增出犬松弛素原基因cDNA。瓊脂糖凝膠電泳后觀察到PCR擴(kuò)增片段大小約為459bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期相符。雙酶切結(jié)果顯示(圖2)，犬松弛素原cDNA擴(kuò)增片段被完全切下，與預(yù)期大小一致。利用PCR方法從轉(zhuǎn)化連接后得到的菌落中直接擴(kuò)增犬松弛素原基因cDNA，挑取的菌落均擴(kuò)增得到大小約459bp左右的片段，初步證實(shí)這些菌落中已成功轉(zhuǎn)入，將重組質(zhì)粒送到生物公司測(cè)序，證實(shí)目的片段已成功克隆。

1.2、犬松弛素原基因克隆載體pMD19-T-prorelaxin的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將回收的prorelaxin基因片段與19-T Simple Vector載體充分混勻后，于16℃連接過(guò)夜，連接體系為：膠回收純化產(chǎn)物5.0μL，載體0.5μL，SolutionI 4.5μL。連接完成后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.3、犬松弛素原基因表達(dá)載體pET28a-prorelaxin的構(gòu)建

1.3.1、質(zhì)粒DNA的抽提

PCR鑒定確認(rèn)后的pMD19-T-prorelaxin克隆菌，接種于5ml含AMP(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA。

1.3.2、載體與片段酶切

將含重組質(zhì)粒PMD19-T-prorelaxin質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒pET28a的菌株分別培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒DNA，用BamHI與XhoI雙酶切，50μL酶切體系：pMD19-T-prorelaxin或pET28a 20.0μL，BamHI 5.0μL，XhoI5.0μL，10×Kbuffer 5.0μL，ddH₂O 15.0μL，37℃作用4h，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認(rèn)后，凝膠回收試劑盒回收目的片段和pET28a表達(dá)載體。

1.3.3、連接與轉(zhuǎn)化

取PCR管按順序加入試劑：酶切后犬松弛素原基因片段4.5μL，線性化pET28a0.5μL，T4DNALigase Buffer 5.0μL，共10μL，混勻后置16℃，進(jìn)行連接，取連接液全部轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，程序和方法同上。

1.3.4、重組陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

挑取數(shù)個(gè)單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(100μg/ml卡那霉素)中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，抽提質(zhì)粒DNA，進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，方法同前。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性的克隆菌送大連寶生物有限公司測(cè)序。將測(cè)序鑒定正確的克隆菌命名為pet28a-prorelaxin并保存。

1.3.5、轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌

將步驟1.3.4中鑒定的陽(yáng)性克隆菌抽提質(zhì)粒后，按步驟1.3.3的方法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)16小時(shí)。將不同編號(hào)過(guò)夜培養(yǎng)后的菌液接種于20μL PCR緩沖體系中，利用全菌PCR法進(jìn)行鑒定。將PCR反應(yīng)鑒定為陽(yáng)性的菌落命名為pET28a-prorelaxin表達(dá)菌。

1.3.6、重組犬松弛素原蛋白的表達(dá)及純化

(1)挑取單菌落于10mlLB培養(yǎng)基(Kana抗性)中，37℃250rpm，過(guò)夜；

(2)1％過(guò)夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接于1000mlLB培養(yǎng)基(Kana抗性)，37℃250rpm 3小時(shí)，然后加入1mM IPTG，25℃誘導(dǎo)5小時(shí)；

(3)離心收集1000ml表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)物，于40ml細(xì)菌裂解緩沖液中超聲波裂解，離心后分別收集沉淀和上清；

(4)將沉淀用NTAU溶解，離心取上清液，上樣于預(yù)先平衡好的NTA純化柱(5ml NTA介質(zhì)，10倍柱體積NTAU-0緩沖液平衡)；

(5)樣品上樣完成后，使用NATU-0緩沖液洗柱8-10個(gè)柱體積；

(6)順序使用NATU-X緩沖液分別洗柱1個(gè)柱體積；(X為不同濃度咪唑)

(7)分步收集不同組分并電泳檢測(cè)，最終將含目的蛋白的組分混合在一起。

重組蛋白在表達(dá)菌中大部分以包涵體形式表達(dá)，分子量大小在22KD左右(圖3)。通過(guò)進(jìn)一步的親和層析可以獲得較高純度的犬松弛素原重組蛋白。NTA純化結(jié)果表明(圖4)，重組蛋白在變性條件下與NTA柱結(jié)合效果一般，在200-500mM咪唑處可洗脫獲得較高濃度蛋白，重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)并選取純度較高部分進(jìn)行合 并。

1.3.7、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blotting)

將洗脫下來(lái)的犬松弛素原重組蛋白進(jìn)行10％聚乙烯酰胺凝膠電泳，使用濕電轉(zhuǎn)膜的方式，把重新組合的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)遞到PVDF膜，之后使用封閉液(PBST，5％脫脂奶粉，pH7.0)37℃條封閉1h，用PBST 1∶2000稀釋抗His一抗，37℃放置1h，完全洗滌后，用1：6000的PBST濃度稀釋HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗，37℃作用1h，用1×PBST充分洗滌；再置于暗室添加發(fā)光底物(Thenno)，3min后，將其放置在Kozak膠片下曝光，顯影及定影后，觀察目的蛋白的表達(dá)情況。

犬松弛素原重組蛋白與抗His抗體相互作用后，用化學(xué)底物進(jìn)行顯色，可以觀察到與預(yù)期相符的22KD大小的特異性蛋白條帶(圖5)，證明純化產(chǎn)物即為犬松弛素原蛋白。

本研究先用生物信息學(xué)方法分析犬前松弛素原基因cDNA序列，推導(dǎo)獲得犬松弛素原基因序列。將犬松弛素原基因重組到原核表達(dá)載體中，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)得到目的蛋白。表達(dá)的重組蛋白中含有編碼的His標(biāo)簽，可使用與之特異結(jié)合的鎳柱純化。松弛素原分子量較小，含有三對(duì)二硫鍵，包涵體形成可能性更高，我們通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度、降低IPTG濃度、降低搖床轉(zhuǎn)速等方式來(lái)減少包涵體的形成。利用超聲裂解技術(shù)裂解菌體，高速離心后即能輕易分離包涵體和可溶性蛋白。大量誘導(dǎo)表達(dá)后通過(guò)超聲波裂解菌體，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要存在于沉淀中，說(shuō)明此重組蛋白表達(dá)形式為包涵體。這與文獻(xiàn)報(bào)道相符，Reddy等曾報(bào)道豬松弛素原在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)在胞漿形成包涵體，占菌體蛋白8％。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了犬松弛素原基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)形式為包涵體。通過(guò)SDS-PAGE電泳以及Western bloting實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)的特異性產(chǎn)物為犬松弛素原蛋白。通過(guò)本方法制備的重組蛋白可用于制備犬松弛素原多克隆抗體。

實(shí)施例2犬松弛素原多克隆抗體的制備

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2只3月齡左右健康新西蘭白兔，體重約2.0kg。

1.1.2主要試劑：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Rockland公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(國(guó)藥化試)其余相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，ProteinA介質(zhì)為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；NaCl、KCL、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、EDTA、TMB、DMSO等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1新西蘭家兔免疫

免疫家兔前耳緣靜脈采血0.5mL，離心取血清作為陰性對(duì)照，-20℃保存。前述的犬松弛素原純化重組蛋白作為免疫抗原，分裝存留于4℃。免疫流程：第1天，取1ml抗原加入1ml福氏完全佐劑，乳化(檢驗(yàn)乳化的程度：把一滴乳化抗原液滴在生理鹽水里，如果沒(méi)有散開(kāi)，就說(shuō)明達(dá)到了要求)，在頸部與背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)(最少8點(diǎn))注射；第15天，取1ml抗原加入1ml福氏不完全佐劑，免疫新西蘭家兔；第29天，重復(fù)上一次免疫；第43天，重復(fù)上一次免疫；第53天，頸動(dòng)脈采血。兔血在4℃靜置過(guò)夜，離心(4℃，10000rpm)30分鐘，收集上清。

1.2.2血清純化

血清經(jīng)ProteinA柱純化，可得到特異性針對(duì)目的蛋白的抗體，操作步驟如下：血清經(jīng)0.45um濾膜過(guò)濾；取出protein A柱，用10倍柱體積PBS平衡，待PBS流干后，血清上樣過(guò)柱，收集流穿；倍柱體積PBS平衡，流干后，加入5倍柱體積的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液，收集洗脫液，每管1ml，預(yù)先加入90ul1M Tris溶液(pH8.8)中和；加入10倍柱體積PBS平衡，流干后加入2倍柱體積的20％乙醇，4度保存柱子；收集的洗脫液檢測(cè)280nm的吸光值，吸光值大于1.0的合并，PBS透析過(guò)夜，ELISA檢測(cè)效價(jià)。

1.2.3間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)

ELISA具體操作步驟如下：(1)包被：將抗原用CBS稀釋為1ug/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔100ul，4℃過(guò)夜；(2)封閉：將包被液棄去，每孔加入200ul封閉液(5％脫脂奶粉)，37℃放置1.5小時(shí)；(3)加入樣本：棄去封閉液，加入樣品(血清或者抗體)，每孔100ul加入酶標(biāo)板，37℃放置1小時(shí)；(4)洗滌：用自來(lái)水 沖洗10次，拍干；(5)加入二抗：酶標(biāo)羊抗兔用封閉液稀釋至工作濃度，每孔100ul加入酶標(biāo)板，37℃放置30分鐘；(6)洗滌：用自來(lái)水沖洗10次，拍干；(7)加入TMB顯色底物：每孔100ul加入酶標(biāo)板，37℃放置15分鐘；(8)加入終止液：每孔加入2M H₂SO₄50ul；(9)讀數(shù)：酶標(biāo)儀OD450nm讀數(shù)。

1.2.4Western blotting檢測(cè)

1.2.4.1電泳及轉(zhuǎn)膜

(1)配膠：配制15％的分離膠，加入電泳用的玻璃板中，分離膠凝固后，配制5％的積層膠，加入玻璃板中，插入15孔梳子。

(2)電泳：根據(jù)順序加樣，每個(gè)樣品上樣量為30ng蛋白，裝入電泳槽中，打開(kāi)電源，恒壓100V開(kāi)始電泳，運(yùn)行20min；然后將電壓調(diào)至180V，運(yùn)行60min，取出膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

(3)轉(zhuǎn)膜：濾紙及PVDF膜先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡數(shù)分鐘，再用去離子水浸泡數(shù)分鐘。然后先鋪三層濾紙，用滾筒趕氣泡，再蓋上PVDF膜，接著放上電泳膠，用滾筒趕氣泡，最后鋪三層濾紙，裝入轉(zhuǎn)移槽中，打開(kāi)電源，恒壓30V開(kāi)始轉(zhuǎn)膜，運(yùn)行16h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用眼科鑷將膜夾出，放在5％脫脂奶溶液中封閉，放入反應(yīng)盒中備用。

1.2.4.2Western Blot

(1)加一抗：anti-prorelaxin抗體用5％脫脂奶粉稀釋(1：5000和1:20000)，加入反應(yīng)盒中，室溫緩搖2小時(shí)。

(2)洗膜：用PBST洗去未結(jié)合的一抗，每次10分鐘，洗4次。

(3)加二抗：二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔)用5％脫脂奶粉稀釋(1：5000)，加入反應(yīng)盒中，室溫緩搖60分鐘。

(4)洗膜：用PBST洗去未結(jié)合的一抗，每次10分鐘，洗4次。

(5)顯色：在EP離心管中按照每1mlECL-PLUS顯色液需要SolutionA1ml、Solution B 20ul的比例配置顯色液，加入膜上(有蛋白的一面)，反應(yīng)5分鐘，X-film曝光。

2結(jié)果

2.1間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)

用間接ELISA的方法檢測(cè)待檢血清效價(jià)，并記錄其OD₄₅₀值。當(dāng)待檢血清OD₄₅₀(P) 值與陰性對(duì)照血清OD₄₅₀(N)值之比大于或等于2.1，且待檢血清OD₄₅₀(P)大于或等于0.4時(shí)判斷為陽(yáng)性，故該抗體效價(jià)達(dá)到1:80000以上。結(jié)果(表1)表明本試驗(yàn)獲得了高效價(jià)的prorelaxin多克隆抗體。

表1 prorelaxin多克隆抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)

2.2 Western blotting檢測(cè)抗體特異性

Prorelaxin蛋白轉(zhuǎn)膜后分別與稀釋度為1∶5000的一抗、二抗反應(yīng)，Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明(圖6)，anti-prorelaxin兔血清作為一抗在稀釋至1∶5000時(shí)仍能與純化后的蛋白反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了所制備的抗體能與重組蛋白特異性結(jié)合。

通過(guò)本方法制備的犬松弛素原多克隆抗體可用于建立松弛素原檢測(cè)的各種技術(shù)，進(jìn)而檢測(cè)樣品中犬松弛素原的分布和含量，以對(duì)犬的生理機(jī)能進(jìn)行評(píng)判，如用于犬妊娠診斷，完善犬松弛素原的臨床應(yīng)用。

序列表

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種犬松弛素原重組蛋白及犬松弛素原的多克隆抗體的制備方法

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> 犬

<400> 1

acggatgaca agaaacttaa ggcatgtggt cgtgattatg tccgcctaca gattgaggtc 60

tgcggctcca tctggtgggg gagaaaggct ggccagctgc gggaacgtcg gcagatatcc 120

gaacccctgg cagaagttgt gccatcctcc atcatcaatg atccagaaat cttaagtttg 180

atgttgcaat ccattcccgg tatgccacag gaactgagga tagcaacacg gtctgggaag 240

gagaagttat taagagagct acactttgta ctggaagatt ccaatcttaa cttggaagaa 300

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gtaggttgta ccagaagaga gcttgctagc cgatgctga 459

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 犬

<400> 2

Thr Asp Asp Lys Lys Leu Lys Ala Cys Gly Arg Asp Tyr Val Arg Leu

1 5 10 15

Gln Ile Glu Val Cys Gly Ser Ile Trp Trp Gly Arg Lys Ala Gly Gln

20 25 30

Leu Arg Glu Arg Arg Gln Ile Ser Glu Pro Leu Ala Glu Val Val Pro

35 40 45

Ser Ser Ile Ile Asn Asp Pro Glu Ile Leu Ser Leu Met Leu Gln Ser

50 55 60

Ile Pro Gly Met Pro Gln Glu Leu Arg Ile Ala Thr Arg Ser Gly Lys

65 70 75 80

Glu Lys Leu Leu Arg Glu Leu His Phe Val Leu Glu Asp Ser Asn Leu

85 90 95

Asn Leu Glu Glu Met Lys Lys Thr Phe Leu Asn Thr Gln Phe Glu Ala

100 105 110

Glu Asp Lys Ser Leu Ser Lys Leu Asp Lys His Pro Arg Lys Lys Arg

115 120 125

Asp Asn Tyr Ile Lys Met Ser Asp Lys Cys Cys Asn Val Gly Cys Thr

130 135 140

Arg Arg Glu Leu Ala Ser Arg Cys

145 150

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggatccat gacggatgac aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctcgagtc agcatcggct ag 22