本發(fā)明涉及一種鹽誘導(dǎo)功能元件及應(yīng)用，尤其涉及一種大豆的新型高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大豆(Glycine max(L.)Merill)是一種傳統(tǒng)的可食用豆科作物，也是公認(rèn)的重要雙子葉植物，種子為人類提供了豐富的蛋白、高質(zhì)量的植物油、礦物質(zhì)和維生素等資源。另外，大豆異黃酮、皂角苷、磷脂酰膽堿等也作為重要的功能化合物存在于大豆種子中。

根據(jù)高鹽脅迫下植物正常生長(zhǎng)的比率對(duì)植物進(jìn)行鹽脅迫耐受性分級(jí)，分級(jí)結(jié)果顯示栽培大豆是一種中度耐鹽的農(nóng)作物，土地高鹽堿含量限制了大豆種植業(yè)的發(fā)展。

高等植物自身生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)是通過調(diào)控目的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。而轉(zhuǎn)錄因子和基因順式作用元件的相互作用，可以作為基因表達(dá)調(diào)控的分子開關(guān)。正是轉(zhuǎn)錄因子與抗逆功能基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的相互作用激活了抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高了植物的綜合抗逆性。

利用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是培育抗逆作物新品種的有效方法。目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子元件仍然很少，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟動(dòng)子功能元件的發(fā)現(xiàn)、克隆、分析以及與順式元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后研究的重點(diǎn)，將功能明確的抗逆啟動(dòng)子功能元件成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá)是植物抗逆基因工程的研究方向。

目前在植物中，研究較深入的有：脫落酸響應(yīng)元件(ABA-responsive element,ABRE)、乙烯響應(yīng)元件(ethylene-responsive element,ERE)、茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答元件(jasmonate-responsive element,JRE)、低溫響應(yīng)元件(low-temp rature reponsive element,LTRE)和干旱應(yīng)答元件(dehydration-responsive element,DRE)等。

植物鹽脅迫相關(guān)啟動(dòng)子元件的研究，有助與了解鹽脅迫下基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和其調(diào)控機(jī)制，有助得到耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物。

申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室前期工作中已經(jīng)證明來源于耐鹽品種——圣豆9號(hào)的GmNAC4基因?yàn)辂}響應(yīng)基因，且對(duì)鹽脅迫為正調(diào)節(jié)作用(專利CN102660554A)。研究大豆啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件可以更好地幫助闡釋耐鹽大豆植株的鹽脅迫應(yīng)答分子機(jī)制，同時(shí)可為獲得通用型的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子功能元件提供重要參考，可用于轉(zhuǎn)基因耐鹽作物的培育。經(jīng)過檢索，未見有關(guān)于該鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子功能元件的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種大豆的新型高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件，其特征在于：所述鹽誘導(dǎo)功能元件命名為大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件GmBM1，該鹽誘導(dǎo)功能元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其與擬南芥TUB2啟動(dòng)子融合的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供了一種含有上述大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件的植物雙熒光報(bào)告載體，其特征在于：所述載體命名為植物雙熒光報(bào)告載體pGmBM1-pGreen II-0800LUC，該載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明所述大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件在提高植株鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用。

其中：所述植株優(yōu)選是大豆或擬南芥。進(jìn)一步的，所述擬南芥是Col-0野生型，大豆品種是圣豆9號(hào)。

本發(fā)明所述大豆啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件受鹽脅迫誘導(dǎo)能高效啟動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)。通過對(duì)GmNAC4轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并結(jié)合的下游基因的啟動(dòng)子序列分析，發(fā)現(xiàn)了鹽脅迫下GmNAC4調(diào)節(jié)的大部分下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有一段保守的序列(pGmBM1)：CCTCCACCC(見圖1)。將該功能元件融合擬南芥TUB2啟動(dòng)子構(gòu)建pGmBM1::pGreenII-0800LUC載體(見圖2)轉(zhuǎn)入擬南芥葉片原生質(zhì)體中，通過擬南芥和大豆葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系，檢測(cè)鹽、非鹽條件下啟動(dòng)子LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體相對(duì)熒光素酶活性，結(jié)果表明該功能元件可快速高效的響應(yīng)高鹽誘導(dǎo)(見圖3)。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)：本發(fā)明所述大豆啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件能夠在鹽誘導(dǎo)條件下上調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，可望用于轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的培育。

本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了得到了大豆啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件，通過擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體能在鹽誘導(dǎo)下較非鹽條件下能更高效的表達(dá)LUC報(bào)告基因。預(yù)示本發(fā)明所述的鹽誘導(dǎo)功能元件可廣泛用于培育抗鹽的植物品種及轉(zhuǎn)基因耐鹽作物的相關(guān)功能研究。

附圖說明

圖1為啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件：pGmBM1。

圖2為pGmBM1::pGreenII-0800LUC載體T-DNA圖譜。

圖3為啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件在鹽和非鹽條件下相對(duì)熒光素酶測(cè)定結(jié)果，

其中，mock：為轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體正常培養(yǎng)6h的相對(duì)熒光素酶活性；NaCl：為轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體150mM NaCl處理6h的相對(duì)熒光素酶活性；-：陰性對(duì)照，為無啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pGreenII空載對(duì)照相對(duì)熒光素酶活性；+：陽(yáng)性對(duì)照，為35S::pGreenII，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的相對(duì)熒光素酶活性。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1大豆圣豆9號(hào)基因高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件的獲得

根據(jù)已報(bào)到的大豆圣豆9號(hào)轉(zhuǎn)GmNAC4大豆植株在鹽/非鹽條件下的RNAseq結(jié)果，找到高鹽脅迫下受轉(zhuǎn)錄因子GmNAC4上調(diào)表達(dá)的基因，利用http://meme-suite.org/網(wǎng)站比較這些基因的啟動(dòng)子區(qū)段共同含有的保守序列—CCTCCACCC，并設(shè)計(jì)特異性引物將該段序列與擬南芥TUB2啟動(dòng)子融合，命名為pGmBM1。

1.1 pGmBM1的克隆

高保真酶HIFI擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2克隆基因片段的純化回收(天根試劑盒)

1)將切下帶有目的片段的凝膠放入1.5ml離心管并稱凝膠重量，加入3倍體積的溶膠液，60℃溶膠10min，溶膠期間不斷的翻轉(zhuǎn)；

2)凝膠完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室溫，12000rpm，離心30Sec，棄溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，離心1min，棄漂洗液；

6)空柱，12000rpm，離心2min；

7)回收柱開蓋晾干1-2min，放入新的干凈的1.5ml離心管，加入60℃預(yù)熱的40μl滅菌水或者EB緩沖液，放置2min；

8)12000rpm離心1min，所得溶液即為回收片段。

1.3連接pGmBM1與T載體

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

16℃過夜連接。

1.4大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(無菌操作)

(1)將1-5μl質(zhì)粒DNA或者連接產(chǎn)物加入50μl的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)42℃，溫水浴熱激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)40-50min；

(4)室溫，4000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.5大腸桿菌PCR驗(yàn)證

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6DNA測(cè)序

挑取含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性單菌落用含有Amp(50mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果，啟動(dòng)子DNA序列如序列表SEQ ID No.2所示。

1.7大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取得到pGmBM1-pMD18-T質(zhì)粒(天根試劑盒)

(1)將測(cè)序正確的菌接種于10ml含有氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8小時(shí)-過夜；

(2)室溫，12000rpm，離心1min，收集菌體；

(3)棄上清，加入250μl低溫預(yù)冷的P1，振蕩懸浮菌體；

(4)加250溶液P2輕柔顛倒混勻，靜置5min；

(5)溶液澄清后加入350μl溶液P3，輕輕混勻后放置5min；

(6)12000rpm，離心12min，同時(shí)在過濾柱中加入600μl BL平衡液，室溫放置2min，12000rpm離心1min，將收集管中的液體倒掉；

(7)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒提取管中上層水相于過濾柱中，室溫2min，12000rpm離心1min，將收集管中的液體倒掉；

(8)在過濾柱中加入600μl漂洗液PW，室溫2min，12000rpm離心1min，將收集管中的液體倒掉，重復(fù)一次；

(9)將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心5min；

(10)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱的中間部位滴加55μl預(yù)熱55℃的滅菌水，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2.利用擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵元件pGmBM1受鹽誘導(dǎo)。

2.1 pGmBM1-pGreen II-0800LUC載體的構(gòu)建

2.1.1克隆含有酶切位點(diǎn)的pGmBM1啟動(dòng)子片段

利用雙酶切-連接法構(gòu)建pGmBM1的雙熒光報(bào)告載體pGmBM1-pGreen II-0800LUC。利用Primer5pGmBM1上的限制性酶切位點(diǎn)分析，與pGreen II-0800LUC上的多克隆位點(diǎn)(如圖2所示)進(jìn)行比較，篩選出可用酶切位點(diǎn)為Sal I和Pst I。

利用pGmBM1含有酶切位點(diǎn)的引物(F：5’-ACG CGT CGA CAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AAC TGC AGT TTT TCA AAA ACA CAA TTT CG-3’)PCR擴(kuò)增pGmBM1。

高保真酶HIFI擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.1.2膠回收PCR產(chǎn)物(同1.3)

2.1.3 Sal I和Pst I分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pGreen II-0800LUC載體過夜。

反應(yīng)體系如下：

37℃過夜充分酶切。

2.1.4第二天膠回收酶切產(chǎn)物及pGreen II-0800LUC載體(同1.2)。

2.1.5將回收的酶切產(chǎn)物和載體進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。

2.1.6大腸桿菌感受態(tài)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(同1.4)。

2.1.7大腸桿菌PCR驗(yàn)證(同1.5)。

2.1.8 DNA測(cè)序(同1.6)。

2.1.9大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取得到pGmBM1::pGreenII-0800LUC質(zhì)粒：無內(nèi)毒素質(zhì)粒純化DNA純化體系(NucleoBond Xtra Midi EF)(MACHEREY-NAGEL)

(1).菌體培養(yǎng)收集：4500×g,15min,4℃

(2).菌體裂解：8ml Buffer RES-EF徹底重懸菌體，加入8ml Buffer LYS-EF裂解菌體，輕柔混勻，常溫裂解5min；

(3).平衡柱子和濾頭：15ml Buffer EQU-EF

(4).中和:8ml NEU-EF,輕柔混合10-15次，冰上放置5min

(5).凈化和裝柱裂解液：顛倒試管3次，將裂解液倒入柱子中

(6).1st洗：5ml Buffer FIL-EF

(7).去除過濾柱：去除Nucleobond Xtra Column Filter

(8).2ed洗：35ml Buffer ENDO-EF

(9).溶解：5ml ELU-EF

(14)沉淀：3.5ml異丙醇,15000g，4℃，30min

(15)清洗和干燥DNA沉淀：2ml 70％乙醇常溫，5min,15000g,常溫，5min

(16).溶解DNA：加入適量體積的H2O-EF，使DNA濃度達(dá)到1000ug/ml,-20℃保存。

2.2pGmBM1啟動(dòng)子擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

(1)準(zhǔn)備在土里生長(zhǎng)的3～4周擬南芥幼苗(擬南芥未受脅迫，未抽苔，生長(zhǎng)良好)，取5-8片展開的真葉；

(2)用新的單面刀片將葉片的中部切成0.5-1mm的小條，保證切片沒有組織的擠壓；

(3)將葉片條迅速且輕柔的轉(zhuǎn)移到備好的酶液中，用平頭鑷子將葉條兩邊的切面都浸入酶液；

(4)將葉條在黑暗中抽真空30min黑暗中酶解3小時(shí)，輕搖后酶液呈綠色，說明原生質(zhì)體解離下來；

(5)用顯微鏡檢查原生質(zhì)體，正常擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體應(yīng)約為30-50μm；

(6)用W5溶液將酶/原生質(zhì)體等體積稀釋；

(7)用水將75μm尼龍網(wǎng)上的乙醇洗凈并吸去多余水分，并用W5浸濕，然后過濾上述混合物；

(8)將上清轉(zhuǎn)入30ml圓底離心管，200g離心2min,盡可能去除上清，并輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)重懸原生質(zhì)體；

(9)用血球計(jì)數(shù)板在100倍顯微鏡下對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)，按2×10⁵個(gè)/ml的比例用W5重懸原生質(zhì)體，冰上靜止30min；

(10)用移液器盡量吸去W5,不要碰到沉淀。按照2×10⁵個(gè)/ml的比例用MMG重懸原生質(zhì)體，并放置室溫；

(11)在2ml離心管中加入10ul pGmBM1::pGreenII-0800LUC質(zhì)粒；

(12)加入100ul原生質(zhì)體(2×10⁴個(gè)),輕柔混合；

(13)加入110ulPEG溶液，輕敲離心管充分混合，室溫放置10min；

(14)在6孔板的每個(gè)孔中加入1ml 5％的牛血清溶液，晃動(dòng)幾下，使溶液覆蓋好孔的內(nèi)壁(防止原生質(zhì)體貼壁)，將牛血清移去，加入1mlW5溶液清洗六孔板，移去W5溶液；

(16)在轉(zhuǎn)化體系中加入440ul W5稀釋，輕柔混合以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；

(17)100g離心2min，去除上清，加入200ul W5溶液懸浮原生質(zhì)體；

(18)在六孔板中加入1ml W5溶液，將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)入劉孔板中，黑暗中過夜培養(yǎng)；

(19)重懸原生質(zhì)體，100g離心2min收集，去上清，留100ul左右的液體，直接進(jìn)行LUC測(cè)定，或放入-80℃保存。

2.3 pGmBM1::pGreenII-0800LUC相對(duì)熒光素酶活性測(cè)定

利用Promega Dual-Luciferase Assay System檢測(cè)啟動(dòng)子LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體相對(duì)熒光素酶活性，操作參照說明書。

將-80℃的原生質(zhì)體拿出放在冰上融化，取20ul原生質(zhì)體溶液+20ul Dual-Luciferase Reagent,25℃反應(yīng)10min后測(cè)定螢火蟲發(fā)光值，加入20ul Dual-Stop&Reagent測(cè)定，25℃反應(yīng)10min，測(cè)定海腎發(fā)光值。計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性值，相對(duì)活性值＝螢火蟲發(fā)光值/海腎發(fā)光值。pGmBM1::pGreenII-0800LUC的相對(duì)活性值和受鹽誘導(dǎo)情況如圖3所示，結(jié)果證明，在鹽誘導(dǎo)下，pGmBM1能上調(diào)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體中的表達(dá)，pGmBM1啟動(dòng)子具有鹽誘導(dǎo)功能，能夠用于今后轉(zhuǎn)基因耐鹽調(diào)控機(jī)制研究，并廣泛地應(yīng)用于培育耐鹽轉(zhuǎn)基因植物。

序列表

<110> 山東大學(xué)

<120>一種大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件及其應(yīng)用

<141> 2017-2-22

<160> 3

<210> 1

<211> 9

<212> cDNA

<213> 大豆(Glycine max?(L.) Merr)

<221>大豆高效啟動(dòng)子鹽誘導(dǎo)功能元件GmBM1

<222>（1）…（9）

<400>1

cctccaccc 9

<210> 2

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 含有鹽誘導(dǎo)功能元件與擬南芥TUB2啟動(dòng)子的融合序列pGmBM1

<222>（1）…（272）

<400> 2

gtcgacacat gtgctcttcc aattttcatt ttcagcaacc cttcatgaat gggcccaaag 60

cctgccacaa acatgtgcac aatattacaa actctaaaaa caaaaacaaa ataaaacatt 120

cttttttccc aatttgtatt ttaatatcaa tttgaatcaa actcatagtt ttaaaactca 180

attttgtaat cgaaaacaat tttttttttt ttttttaagg aaacttacac agtagagaaa 240

gaaacggacc attttaacct ccacccctgc ag 272

<210> 3

<211> 4127

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 含有pGmBM1的植物雙熒光報(bào)告載體pGmBM1-pGreen II-0800LUC

<222>（1）…（4127）

<400>

agatcttggc aggatatatt gtggtgtaac gttatcgtac ccctactcca aaaatgtcaa 60

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatttcggg 120

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa 180

ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc 240

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 300

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acgttgtaca aattgttagg aattataatg cttatctacg tgcaagtgat gatttaccaa 1200

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agtttcctaa tactgaattt gtcaaagtaa aaggtcttca tttttcgcaa gaagatgcac 1320

ctgatgaaat gggaaaatat atcaaatcgt tcgttgagcg agttctcaaa aatgaacaat 1380

aattctagcc ggtacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctctattt 1440

tctccataaa taatgtgtga gtagtttccc gataagggaa attagggttc ttatagggtt 1500

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 1560

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcgataa 1620

cattaacgtt tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1680

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 1740

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1800

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacacatg 1860

tgctcttcca attttcattt tcagcaaccc ttcatgaatg ggcccaaagc ctgccacaaa 1920

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