本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，具體地，涉及一種與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明還涉及該分子標(biāo)記的引物、該分子標(biāo)記在谷子米粒顏色基因定位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子米粒顏色基因定位方法、以及一種谷子育種方法。
背景技術(shù)：
：谷子(Setariaitalica(L.)Beauv.)起源于中國，是傳統(tǒng)的優(yōu)勢作物、主食作物和抗旱耐瘠作物。谷子抗旱耐瘠、水份利用效率高、適應(yīng)性廣，不僅在目前旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中有重要作用，而且針對日益嚴(yán)重的水資源短缺，谷子還是重要的戰(zhàn)略儲備作物。谷子去殼后的小米營養(yǎng)豐富且各種成分平衡，是具有營養(yǎng)保健作用的糧食作物，對人體有重要作用的食用粗纖維是大米的5倍，是近年來興起的世界性雜糧熱的主要作物。同時谷子秸稈粗蛋白含量在8％左右，飼草谷子秸稈粗蛋白含量在15％以上，是禾本科中最優(yōu)質(zhì)的飼草，在畜牧業(yè)發(fā)展中有重要作用。因此，加速谷子育種進(jìn)程尤為重要。由于谷子屬于小粟類作物，在遺傳理論研究方面落后于玉米、小麥、水稻等禾谷類作物。如何應(yīng)用先進(jìn)科學(xué)的研究手段指導(dǎo)谷子育種是一個嚴(yán)峻的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新的思路和方法。開發(fā)與重要性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記并進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，能顯著提高我國谷子育種水平。隨著生活水平的提高，大家在關(guān)注谷子產(chǎn)量的同時，更加注重其品質(zhì)。米粒顏色與谷子的營養(yǎng)保健功效密切相關(guān)。但目前還沒有文獻(xiàn)報道谷子米色相關(guān)基因的定位研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，提供一種與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、一種擴(kuò)增與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對、一種谷子米粒顏色基因定位的方法、上述分子標(biāo)記的檢測方法、上述分子標(biāo)記和引物對在谷子輔助育種或者 谷子米粒顏色基因定位或檢測中的用途、一種谷子輔助育種方法以及一種篩選上述分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明所提供的一種與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，其含有SEQIDNO:1所示序列；優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記為SEQIDNO:1所示序列。本發(fā)明所提供的一種擴(kuò)增與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對，其引物1含有SEQIDNO:2所示序列，引物2含有SEQIDNO:3所示序列；優(yōu)選地，引物1為SEQIDNO:2所示序列，引物2為SEQIDNO:3所示序列。本發(fā)明還提供了另一種與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，其是由上述引物對以黃色米粒的谷子基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。具體地，上述另一種分子標(biāo)記為SEQIDNO:1所示序列。本發(fā)明所提供的一種谷子米粒顏色基因定位的方法，其包括使用上述任一種分子標(biāo)記或者上述引物對的步驟。本發(fā)明所提供的上述分子標(biāo)記的檢測方法，其包括步驟：根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物，以被檢測谷子基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記。進(jìn)一步地，上述檢測方法中的引物為上述引物對。本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記或者上述引物對在谷子輔助育種或者谷子米粒顏色基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明所提供的一種谷子輔助育種方法，其包括檢測上述分子標(biāo)記或者用上述引物對進(jìn)行檢測的步驟。本發(fā)明所提供的一種篩選上述分子標(biāo)記的方法，其包括以下步驟：(1)獲得純合型父本、母本基因組；(2)分別通過測序獲得父本、母本基因組序列；(3)比較父本、母本基因組序列，獲得差異位點(diǎn)；(4)構(gòu)建遺傳群體并收集表型數(shù)據(jù)；(5)對群體中的個體進(jìn)行基因型分析；(6)結(jié)合基因型和表型數(shù)據(jù)，將谷子米粒顏色基因定位在基因組上；(7)在靠近目標(biāo)基因的區(qū)段選擇候選的分子標(biāo)記。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供了與谷子米粒顏色基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記將基因組DNA序 列與谷子米粒顏色基因聯(lián)系起來，有利于谷子分子標(biāo)記輔助育種體系的建立；所述分子標(biāo)記與谷子米粒顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為0.7cM。本發(fā)明的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子育種實(shí)踐和資源及品種鑒定。附圖說明圖1為利用分子標(biāo)記引物(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)對父本、母本、RIL群體281個單株進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳檢測結(jié)果圖。其中，泳道1-5為重組自交系RIL群體中5株米粒為黃色的谷子單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道7-11為重組自交系RIL群體中5株米粒為黑色的谷子單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道6為marker，其分子量包括：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Illumina公司。實(shí)施例1：谷子RIL群體的構(gòu)建父本：JZG，黃米。母本：MJG，黑米。父本和母本雜交得到F1，F(xiàn)1代通過單粒傳法得到281個重組自交系RIL株系(F6代)。JZG、MJG、F1、重組自交系谷子種子均可在深圳華大農(nóng)業(yè)與循環(huán)經(jīng)濟(jì)科技有限公司和張家口農(nóng)科院谷子研究所購買。實(shí)施例2：基因組DNA的提取針對實(shí)施例1中獲得的谷子RIL群體，用CTAB法分別提取父母本及RIL群體單株的基因組DNA，具體方法如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3mL1.5×CTAB，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15mL的離心管中，然后往研缽中加入1mL1.5×CTAB沖洗再轉(zhuǎn)入離心管中。混勻后于65℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB15g1mol/L的Tris.Cl(pH為8.0)75mL0.5mol/L的EDTA30mLNaCl61.4g加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15mL離心管，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混合靜止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1mL75％乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心管干燥DNA，加入200μLTE溶解DNA。(5)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。(6)將得到的父母本及RIL群體單株的基因組DNA存于-20℃?zhèn)溆?。?shí)施例3：基因定位和分子標(biāo)記開發(fā)(1)遺傳圖譜構(gòu)建針對實(shí)施例2中獲得的RIL個體的基因組DNA，基于RAD-seq的基因分型技術(shù)(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)對RIL群體的個體進(jìn)行基因分型，獲得RIL群體的基因型數(shù)據(jù)。用MapMaker3.0軟件(ConstructinggeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0，SLincoln,MDaly,ELander-Cambridge,MA:WhiteheadInstitute,1992，通過參照將其全文并入本文)進(jìn)行遺傳連鎖圖譜繪制，得到遺傳連鎖圖。(2)基因定位針對實(shí)施例1中獲得的RIL群體，將RIL群體的個體表型，與父本型性狀相似的記為a，與母本型性狀相似的記為b，性狀居于父本和母本之間的記為h。得到全部個體的表型數(shù)據(jù)，將個體的表型數(shù)據(jù)與之前得到的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，從而將谷子米粒顏色基因定位在遺傳連鎖圖譜上。結(jié)果顯示，谷子米粒顏色基因定位在6號染色體34656385bp至34732860bp區(qū)間內(nèi)，長度約為76475bp。(3)分子標(biāo)記開發(fā)將父本和母本分別進(jìn)行全基因組重測序(10X)，然后根據(jù)RAD-seq的測序結(jié)果，利用SOAP軟件比對測序reads，然后用SOAPsv尋找父母本基因組片段差異較大的分子標(biāo)記，便于用凝膠電泳區(qū)分鑒別。結(jié)果，選擇靠近谷子米粒顏色基因所在區(qū)段的標(biāo)記SVmc4(SEQIDNO:1所示的核酸序列)作為候選。SVmc4的核苷酸序列如下(307bp)：CAGAATGCTTGATACTATGCAGAGACTGTGGTAGATTATTGGCTTTAATCAATTGGTGGTTGGATTTGTCATTTCGTAAAGGAACTTTCCCTAATATAAATTTCTGCTGAAAGTTTTGATTTGTTTAAACTTTTTTTTTTCATTTTCCTACTTGTTTGCTTTTCAAATGCTTTGTTGGATCATTTACCTTCCTATGTGTTTATTTCTCTCCATCCAAATTCTGTCACCTGTATCCTTGACAACAACAAGATTTGGAAGATGGATTTACATTGCATCTGGTCGCTCGGCGTGCAGCTGAGGGCCAGAG(SEQIDNO:1)。實(shí)施例4：分子標(biāo)記的米粒顏色相關(guān)性驗(yàn)證對實(shí)施例3中確定的谷子米粒顏色相關(guān)分子標(biāo)記SVmc4(SEQIDNO:1所示的核酸序列)進(jìn)行驗(yàn)證，具體如下：在實(shí)施例3制得的遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)上，根據(jù)與谷子米粒顏色基因的遺傳連鎖距離，在與谷子米粒顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為0.7cM的位置確定了分子標(biāo)記引物對(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)，并找到對應(yīng)的父本序列位置，上下游引物之間的序列即包含了分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。針對上述分子標(biāo)記設(shè)計引物，引物序列如下所示：正向引物：5’-CGTTTAGTAATGACATAATT-3’(SEQIDNO:2)；反向引物：5’-GCAGAATAAGGTAAGCTTAT-3’(SEQIDNO:3)。利用上述引物，通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗(yàn)證該標(biāo)記的多態(tài)性和擴(kuò)增穩(wěn)定性。具體地，以實(shí)施例2中提取的父本、母本、RIL群體單株的基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，PCR反應(yīng)體系如下：無菌水20.2μl10*Buffer(含Mg2+)2.5μldNTPs(25mM)0.15μlTaq酶(5U/μl)0.15μl正向引物(10μmol/L)0.5μl反向引物(10μmol/L)0.5μl模板1.0μl總體積25μlPCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運(yùn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃下保存。接著，將各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取部分進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。如圖1所 示，米粒黃色的單株均擴(kuò)增出618bp的條帶，米粒黑色的單株均擴(kuò)增出311bp的條帶。由此證明該分子標(biāo)記SVmc4(SEQIDNO:1所示的核酸序列)在父母本之間具有多態(tài)性，該分子標(biāo)記與谷子米粒顏色性狀緊密連鎖。然后，利用3730測序儀對各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果，父本及RIL群體中米粒黃色的單株擴(kuò)增條帶，與母本及RIL群體中米粒黑色的單株擴(kuò)增條帶相比增加了一些序列，該序列即為分子標(biāo)記SVmc4(SEQIDNO:1所示的核酸序列)。此外，利用上述擴(kuò)增引物(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)擴(kuò)增含有該米粒顏色位點(diǎn)的其它群體，米粒黃色的單株均擴(kuò)增出618bp的條帶，米粒黑色的單株均擴(kuò)增出311bp的條帶。由此證明該分子標(biāo)記使用于含有該米粒顏色位點(diǎn)的其它群體。黃色米粒擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如下(618bp)：TATTTTTCTGAACTGTAAGGTTGGGGTGATTTGCTGACTTGCAGAATCAGAATATTTGCTTGTAAGTTGGTTAATAGGTTATTTAATGCCATATCAAGTGCATTCTCAGCTGAAATACATGCAACCCTACGCAGAGTTGAAAATACATGCAACCCTATGTTCTTCTGGGGCTTCTGAAGGAAATACACACACCAATGGTAAGTCAGACCTGCAGTTGCTATGTCAGCTGCATCATCAATCCTGAACCACCAAGTAAATATGCTTCCATGAT(SEQIDNO:4)。黑色米粒擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如下(311bp)：TATTTTTCTGAACTGTAAGGTTGGGGTGATTTGCTGACTTGCAGAATCAGAATATTTGCTTGTAAGTTGGTTAATAGGTTATTTAATGCCATATCAAGTGCATTCTCAGCTGAAATACATGCAACCCTACGCAGAGTTGAAAATACATGCAACCCTATGTTCTTCTGGGGCTTCTGAAGGAAATACACACACCAATGGTAAGTCAGACCTGCAGTTGCTATGTCAGCTGCATCATCAATCCTGAACCACCAAGTAAATATGCTTCCATGAT(SEQIDNO:5)。上述核苷酸序列中，斜體下劃線部分為引物設(shè)計區(qū)段，粗體下劃線部分為分子標(biāo)記的序列。分子標(biāo)記SVmc4與谷子米粒顏色基因的遺傳緊密連鎖距離為0.7cM。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3