本發(fā)明屬于本發(fā)明涉及一種生物柴油生產(chǎn)用催化劑的制備方法。

背景技術(shù)：

目前生物柴油全部是用化學(xué)法生產(chǎn)，即用動物、植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在堿性催化劑下，在高溫下，轉(zhuǎn)酯化生成甲酯或乙酯?；瘜W(xué)法合成生物柴油有以下缺點：工藝復(fù)雜，醇必須過量，后續(xù)必須有相應(yīng)的醇回收裝置；能耗高，色澤深，由于脂肪中不飽和脂肪酸在高溫下容易變質(zhì)，酯化產(chǎn)物難于回收，成本高；生成過程有廢堿液排放。

為解決上述問題，人們開始研究用生物酶法合成生物柴油，即動植物油脂和低碳醇通過脂肪酶進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，制備相應(yīng)的脂肪酸甲酯及乙酯。相對于化學(xué)法，酶法合成生物柴油具有條件溫和、醇用量小，無污染物排放等優(yōu)點，其中，酶及酶固定化成本較高成為酶法生產(chǎn)生物柴油仍不能工業(yè)化的重要原因。

脂肪酶通常是被固定于不溶性的固體載體上，這有利于提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而降低其使用成本。 另一方面，固定化載體也是影響固定化脂肪酶性能的一個重要的因素。目前報道較多的固定化載體為膜狀物，如靜電紡絲膜、中空纖維膜等，還有不少微觀結(jié)構(gòu)規(guī)整的納米多孔材料，如 二氧化硅、碳酸鈣、碳納米管、氧化鋁等， 但這類無機(jī)材料本身 、生物相容性較差，固定化的過程易引起蛋白構(gòu)象的改變，在對其的修飾改性中又容易帶入新的影響脂肪酶構(gòu)象的因素，因此還需進(jìn)一步改善。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種生物柴油生產(chǎn)用催化劑的制備方法，該制備方法是使用絲瓜絡(luò)為載體，通過物理吸附和共價耦合實現(xiàn)脂肪酶的固定化。

為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的，一種生物柴油生產(chǎn)用催化劑的制備方法，包括如下步驟：

1）將正常生長成熟后的植物絲瓜果實，經(jīng)過自然風(fēng)干或烘干后，切割成1～5cm長的圓柱狀體，除去表皮以及孔隙內(nèi)部的絲瓜種子，得到圓柱狀體絲瓜絡(luò)；

2）將圓柱狀體絲瓜絡(luò)置于脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小時，同時加入步驟2）的活化劑溶液，所述的活化劑為N,N-二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺與丁炔二酸二甲酯混合物，三者的物質(zhì)的量比為1:0.5~2:0.05-0.2；

3）將上述載有脂肪酶的絲瓜絡(luò)干燥后即得。

經(jīng)文獻(xiàn)研究以及發(fā)明人通過掃描電鏡以及紅外光譜等分析等測試手段的多方面因素的論證，發(fā)現(xiàn)：處理后的絲瓜絡(luò)表面粗糙，有孔狀結(jié)構(gòu)，表面富含羧基、羥基等活性基團(tuán)， 因這些性質(zhì)的存在，使其可作為固定化脂肪酶的天然載體，因而，本發(fā)明在通過利用物理吸附將脂肪酶固定于絲瓜絡(luò)孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)外，同時還通過活性劑的加入，促使脂肪酶的羧基與絲瓜絡(luò)表面的羧基、羥基共價耦合實現(xiàn)脂肪酶的固定化。

其中，所述的活化劑溶液是將活化劑與溶劑二甲亞砜混合而成，其中，活化劑的體積濃度為5-10%，活化劑溶液的加入體積與絲瓜絡(luò)質(zhì)量比為1:10-100 ml/g 。

優(yōu)選地，脂肪酶溶液的濃度為1-10mg/mL。

有益效果：

1. 絲瓜絡(luò)在固定化過程中能穩(wěn)定脂肪酶的活性結(jié)構(gòu)，另外由于絲瓜絡(luò)的疏水性，能夠避免水在載體表面過多的積累，從而為脂肪酶提供一個良好的微環(huán)境使固定化脂肪酶保持高活性。

2. 絲瓜絡(luò)為多孔的結(jié)構(gòu)，表面富含羧基、羥基等活性基團(tuán)，可固載大量脂肪酶，因而脂肪酶的固載量高，其中部分通過脂肪酶通過共價結(jié)合固定在絲瓜絡(luò)表面，因而固定化脂肪酶的穩(wěn)定性好，且可循環(huán)使用次數(shù)多，循環(huán)使用10次后，固定化脂肪酶的酶活仍然能保持60%以上，提高了脂肪酶的利用率, 降低了因脂肪酶所致的產(chǎn)品成本。

3、處理方法簡單，條件要求溫和，易于實現(xiàn)。

具體實施方式

為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，這些實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

在下述的實施例中，所述的脂肪酶溶液由Sigma或阿拉丁公司購買豬胰腺的凍干脂肪酶粉采用pH=7.0磷酸緩沖溶液配置而成。具體步驟為將一定量豬胰脂肪酶干粉溶于50mL 的磷酸緩沖液中，上述磷酸緩沖液濃度為0. 025-0.500mo1/ L，pH 值為7.5，4℃低溫下攪拌均勻，在10000r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，然后取上清液貯于冰箱內(nèi)備用。

實施例1

1）將正常生長成熟后的植物絲瓜果實，經(jīng)過自然風(fēng)干或烘干后，切割成3cm長的圓柱狀體，除去表皮以及孔隙內(nèi)部的絲瓜種子，得到圓柱狀體絲瓜絡(luò)；

2) 將N,N-二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺與丁炔二酸二甲酯以物質(zhì)的量比為1:0.5：0.5混合后，加入至二甲亞砜中，配成濃度為5V%的活化劑溶液；

3）將100g圓柱狀體絲瓜絡(luò)置于100ml的4mg/mL脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小時，同時加入步驟2）的1ml活化劑溶液，

3）將上述載有脂肪酶的絲瓜絡(luò)置于室溫下自然干燥后即得。

檢測所述產(chǎn)品中胰脂肪酶的固載量為54.3 mg/g；所述的固定化脂肪酶的酶活為3739 U/g；固定化脂肪酶的酶活回收率為152%；

將一定量的菜籽油和甲醇置于圓底燒瓶中，菜籽油和甲醇的總加入量摩爾比為1:4，其中甲醇分三次加入，再加入相當(dāng)于菜籽油質(zhì)量10-20%的水和10-20% 正己烷的有機(jī)溶劑，混合均，然后將該混合物加入至反應(yīng)器內(nèi)，在實施1中的固定化脂肪酶作用下進(jìn)行反應(yīng)，控制反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為14-24 h，將上述固定化脂肪酶在酯化反應(yīng)后回收連續(xù)重復(fù)使用8次, 固定化脂肪酶的活性保持率位62.4%。

實施例2

1）將正常生長成熟后的植物絲瓜果實，經(jīng)過自然風(fēng)干或烘干后，切割成2cm長的圓柱狀體，除去表皮以及孔隙內(nèi)部的絲瓜種子，得到圓柱狀體絲瓜絡(luò)；

2) 將N,N-二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺與丁炔二酸二甲酯以物質(zhì)的量比為1: 2.0: 0.2混合后，加入至二甲亞砜中，配成濃度為10V%的活化劑溶液；

3）將100g圓柱狀體絲瓜絡(luò)置于100ml10mg/mL脂肪酶溶液中，在20-50 ℃下浸泡8-24小時，同時加入步驟2）的10ml活化劑溶液，

3）將上述載有脂肪酶的絲瓜絡(luò)置于室溫下自然干燥后即得。

檢測所述產(chǎn)品中胰脂肪酶的固載量為95mg/g；固定化脂肪酶的酶活為3939 U/g；固定化脂肪酶的酶活回收率為148%；

將一定量的菜籽油和甲醇置于圓底燒瓶中，菜籽油和甲醇的總加入量摩爾比為1:4，其中甲醇分三次加入，再加入相當(dāng)于菜籽油質(zhì)量10-20%的水和10-20% 正己烷的有機(jī)溶劑，混合均，然后將該混合物加入至反應(yīng)器內(nèi)，在實施2中的固定化脂肪酶作用下進(jìn)行反應(yīng)，控制反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為14-24 h，將上述固定化脂肪酶在酯化反應(yīng)后回收連續(xù)重復(fù)使用8次, 固定化脂肪酶的活性保持率大于65.0%。

上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。