本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棉花是世界上最重要的天然纖維經(jīng)濟作物，在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位。目前，干旱、鹽堿是全球面臨的嚴(yán)重問題之一，也是制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。多年來，人們采用傳統(tǒng)常規(guī)選育等方法解決棉花品種干旱和鹽漬問題，但往往耗資大、工作量大和選擇效率不高。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，利用生物技術(shù)手段，培育抗旱、耐鹽棉花品種正成為可能。當(dāng)前棉花的基因克隆工作雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但棉花的基因克隆工作遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于水稻、玉米、小麥等糧食作物，尤其是對棉花耐鹽機理的研究特別是在分子水平上的研究還不是很多。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus—induced gene silencing，VIGS)作為一種有效的反向遺傳學(xué)技術(shù)廣泛的用于植物基因組功能的鑒定，病毒誘導(dǎo)的基因沉默可以在植株的不同部位成功沉默內(nèi)源基因，為研究不同生長時期的基因功能提供了切實可行的手段。

在真核生物中，蛋白質(zhì)的“可逆磷酸化”作為一項普遍而重要的調(diào)控機制，幾乎參與調(diào)控著生命活動的每個過程，細(xì)胞的生長和分化、基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)的修飾和代謝調(diào)控、分子識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等都與蛋白質(zhì)的可逆磷酸化密切相關(guān)(Gupta and Luan，2003；Boudsocq and Lauriere，2005)。作為廣泛參與生物細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的一類分子事件，蛋白磷酸酶既存在于低等的原核生物中，也存在于高等生物體內(nèi)。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化過程由蛋白激酶(Protein kinases)和蛋白磷酸酶(Protein phosphatases)共同催化完成。蛋白激酶通過對其底物上特定的氨基酸殘基進(jìn)行磷酸化修飾而激活蛋白活性，使微弱的信號得以放大；反之，蛋白磷酸酶使磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化，以終止信號或進(jìn)行逆向調(diào)控。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化過程存在多種多樣的調(diào)節(jié)途徑，同時蛋白磷酸酶和蛋白激酶有多種底物并可在單個或多個位點發(fā)揮作用，這些特性為細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等提供了一種分子開關(guān)(Switch on and off)的作用，使細(xì)胞能有效而經(jīng)濟的調(diào)控對內(nèi)外信息的反應(yīng)(Luan,2002)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的另一個目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。

本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：

A1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；

A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；

A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；

A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；

A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。

本發(fā)明還有一個目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為降低。

本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗鹽性和/或抗旱性和/或滲透脅迫抗性和/或ABA脅迫抗性。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括將抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物。

上述方法中，所述抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為含有序列1所示的DNA分子的pTRV-RNA2載體和pTRV-RNA1載體。

上述方法中，所述抗逆性為抗鹽性和/或抗旱性和/或滲透脅迫抗性和/或ABA脅迫抗性。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物具體體現(xiàn)在：在100mM、200mM、250mM、300mM或400mM NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植物的地上部與地下部干物重和存活率高于受體植物，或在5％PEG干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植物的含水量高于受體植物，轉(zhuǎn)基因植物的失水率低于受體植物。

上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述雙子葉植物具體為棉花。

本發(fā)明的最后一個目的是提供抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)。

本發(fā)明提供的抑制上述蛋白質(zhì)的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為含有序列1所示的DNA分子的pTRV-RNA2載體和pTRV-RNA1載體。

本發(fā)明克隆了棉花GhPTP1基因，并通過構(gòu)建轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥和利用VIGS技術(shù)構(gòu)建GhPTP1沉默植株，對GhPTP1基因的功能進(jìn)行了功能驗證。通過試驗證明：說明GhPTP1蛋白可以降低植物的抗逆性，尤其降低了擬南芥的抗鹽性、抗旱性、滲透脅迫抗性和ABA脅迫抗性，更深入的研究了植物對鹽、旱等脅迫信號的響應(yīng)機制，為有效提高植物耐鹽抗旱性奠定良好的分子基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為棉花GhPTP1基因組織特異性表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位。圖1A為棉花GhPTP1基因組織特異性表達(dá)分析；圖1B為棉花GhPTP1基因質(zhì)壁分離前的亞細(xì)胞定位；圖1C為棉花GhPTP1基因質(zhì)壁分離后的亞細(xì)胞定位。

圖2為棉花GhPTP1基因沉默效率鑒定。圖2A為GhPTP1基因半定量PCR沉默效率檢測；圖2B為GhPTP1基因q-PCR沉默效率檢測。

圖3為VIGS-GhPTP1沉默植株抗鹽表型及生物量比較。圖3A為VIGS-GhPTP1沉默植株抗鹽表型；圖3B為VIGS-GhPTP1沉默植株鹽脅迫下干物質(zhì)積累量。

圖4為VIGS-GhPTP1沉默植株在不同鹽脅迫下表型分析及存活率比較。圖4A為VIGS-GhPTP1沉默植株不同鹽濃度脅迫表型；圖4B為VIGS-GhPTP1沉默植株不同鹽濃度脅迫下存活率比較。

圖5為沉默不同品種GhPTP1基因在鹽脅迫下的抗鹽表型。

圖6為VIGS-GhPTP1沉默植株抗旱表型。圖6A為VIGS-GhPTP1沉默植株P(guān)EG滲透脅迫下表型；圖6B為VIGS-GhPTP1沉默植株失水率；圖6C為VIGS-GhPTP1沉默植株含水量。

圖7為T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥純合株系在不同鹽脅迫下的萌發(fā)率比較。圖7A為T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥不同鹽濃度下萌發(fā)表型；圖7B為T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥不同鹽濃度下萌發(fā)率統(tǒng)計。

圖8為T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥純合株系在100mM NaCl下生長比較。

圖9為T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥純合株系在150mM甘露醇及0.5μM ABA脅迫下萌發(fā)率比較。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的棉花品種“國欣3號”在文獻(xiàn)“王寧,田曉莉,段留生,等.縮節(jié)胺浸種提高棉花幼苗根系活力中的活性氧代謝[J].作物學(xué)報,2014,40(7):1220-1226.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實施例中的Super1300-GFP載體在文獻(xiàn)“Xu J,Tian X,Eneji A E,et al.Functional characterization of GhAKT1,a novel Shaker-like K+channel gene involved in K+uptake from cotton(Gossypium hirsutum)[J].Gene,2014,545(1):61-71”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實施例中的pTRV-RNA2載體在文獻(xiàn)“Gao X,Wheeler T,Li Z,et al.Silencing GhNDR1and GhMKK2compromises cotton resistance to Verticillium wilt[J].The Plant Journal,2011,66(2):293-305.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實施例中的pTRV-RNA1載體在“Gao X,Wheeler T,Li Z,et al.Silencing GhNDR1and GhMKK2compromises cotton resistance to Verticillium wilt[J].The Plant Journal,2011,66(2):293-305.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

實施例1、GhPTP1蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)、克隆及定位

一、GhPTP1基因的克隆

1、引物的設(shè)計

根據(jù)棉花數(shù)據(jù)庫得到的GhPTP1基因序列，設(shè)計兩條特異性引物：上游引物：ATGAAGATCGAGGATTTGG和下游引物：GCAAGCACGTGCTTCA。

2、RNA的提取

使用華越洋試劑盒抽提棉花(棉花品種“國欣3號”)葉片的RNA(試劑盒購自北京久康源生物科技有限公司，抽提按照提供的說明書操作)。

3、cDNA的獲得

以步驟2獲得的RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Promega公司， 按照試劑盒說明書操作)合成第一鏈cDNA。

4、PCR擴增

以步驟3獲得的cDNA為模板，采用步驟1設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，即為GhPTP1基因全長。

PCR反應(yīng)體系(20μL)：模板10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO₄1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、上引物0.3μL、下引物0.3μL、ddH₂O 12.4μL；

PCR擴增程序為：94℃，2min；30個循環(huán)的程序為94℃，15s；56℃，30s；68℃，3min；最后68℃延伸10min。

5、電泳

取PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)純化，操作步驟參照該試劑盒的使用說明書。并對其進(jìn)行測序(測序工作由上海invitrogen公司完成)。

6、GhPTP1基因的獲得

測序結(jié)果表明：PCR擴增得到大小為852bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為GhPTP1基因，自5’端第1-849位為ORF，由849個核苷酸組成，GhPTP1基因編碼的蛋白為GhPTP1蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，由283個氨基酸殘基組成。

二、GhPTP1基因的組織特異性定位

通過熒光實時定量PCR對棉花品種“國欣3”中GhPTP1基因的表達(dá)部位進(jìn)行了分析，具體步驟如下：

1、cDNA的獲得

分別提取正常營養(yǎng)水平下三葉期棉花的根、莖、葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

2、熒光實時定量PCR

分別以步驟1獲得的cDNA為模板，采用引物5’-TTCAGATGGTGGGACGAA-3’和引物5’-ATTGAGAGTGATGACGCCG-3’進(jìn)行熒光實時定量PCR(熒光實時定量PCR所用的儀器為ABI 7500Fast(Applied Biosystem))。以棉花Actin9基因作為對照(用于鑒定棉花Actin9基因的引物對為：5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’和5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’)。PCR程序：94℃變性30s；94℃變性5s、60℃退火35s、40個循環(huán)；相對表達(dá)量采用2^-ΔΔCt方法進(jìn)行計算。

結(jié)果如圖1所示：正常營養(yǎng)水平下三葉期棉花各部位GhPTP1基因的相對表達(dá)量的檢測結(jié)果如圖1A所示：GhPTP1基因在棉花不同組織中均有一定的表達(dá)量，而在葉和根中的表達(dá)量相對較高。

三、GhPTP1基因的亞細(xì)胞定位

將序列表中序列1所示的GhPTP1基因插入Super1300-GFP載體的Xba1和Kpn1酶切位點間，且保持super1300載體的其他序列不變，得到pCAMBIA1300-GhPTP1-GFP重組載體。將pCAMBIA3300-GhPTP1-GFP重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組菌。將重組菌轉(zhuǎn)化野生型擬南芥的根部，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥，并用Olympus FV1000型顯微鏡觀察報告基因。

結(jié)果如圖1B所示：轉(zhuǎn)基因擬南芥根部細(xì)胞熒光定位在細(xì)胞膜上或者細(xì)胞壁上。為了排除GhPTP1-GFP在細(xì)胞壁上表達(dá)的可能性，將根尖利用500mM甘露醇處理10min后質(zhì)壁分離，如圖1C所示，在根尖質(zhì)壁分離細(xì)胞中，熒光信號在細(xì)胞壁上極其微弱。由此可見，PTP1-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞膜上，而不是細(xì)胞壁上。

實施例2、GhPTP1沉默植株的獲得及其抗鹽耐旱表型

一、VIGS-GhPTP1沉默載體的構(gòu)建

1、提取棉花品種“國欣3號”葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟1得到的cDNA為模板，用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

F1:5’-CTCTAGAATGAAGATCGAGGATTTGGG-3’；

R1:5’-GGGTACCGCAAGCACGTGCTTCATGAA-3’。

3、用限制性內(nèi)切酶XbaI和Kpn1雙酶切步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶XbaI和Kpn1雙酶切pTRV-RNA2載體，回收載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pTRV2-GhPTP1。

對重組質(zhì)粒pTRV2-GhPTP1進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明：重組質(zhì)粒pTRV2-GhPTP1為將序列表中序列1所示的DNA片段替換pTRV-RNA2載體的XbaI和Kpn1酶切位點間的DNA片段，且保持pTRV-RNA2載體的其他序列不變得到的載體。

二、GhPTP1沉默植株的獲得

1、將pTRV2-GhPTP1電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101(上海邁其實業(yè)有限公司，產(chǎn)品目錄號CH5002A1)，得到重組菌pTRV2-GhPTP1/GV3101，于28℃搖培；

將pTRV-RNA1電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到重組菌pTRV-RNA1/GV3101，于28℃搖培；

將pTRV2-GFP(pTRV2-GFP為將序列表中序列3所示的GFP替換pTRV-RNA2載體的EcoR1和Kpn1酶切位點間的DNA片段，且保持pTRV-RNA2載體的其他序列不變得到的載體)電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到重組菌pTRV2-GFP/GV3101，于28℃搖培；

2、收集菌液，用VIGS溶液(10mmol L^-1的MES、200μm L^-1的乙酰丁香酮及10mmol L^-1的MgCl₂)把菌液濃度調(diào)整到OD₆₀₀＝1.5，將重組菌pTRV2-GhPTP1/GV3101與重組菌pTRV-RNA1/GV3101按照1:1(體積比)的比例混合，得到待注射菌液1；將重組菌pTRV2-GFP/GV3101與重組菌pTRV-RNA1/GV3101按照1:1(體積比)的比例混合，得到待注射菌液2；

3、用1ml無針頭注射器將待注射菌液1打滿棉花(“國欣3號”)子葉的下表面，待植株出現(xiàn)白化表型約兩周后，得到GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)。

用1ml無針頭注射器將待注射菌液1打滿棉花(中07)子葉的下表面，待植株出現(xiàn)白化表型約兩周后，得到GhPTP1沉默植株(中07)。

用1ml無針頭注射器將待注射菌液1打滿棉花(中G5)子葉的下表面，待植株出現(xiàn)白化表型約兩周后，得到GhPTP1沉默植株(中G5)。

用1ml無針頭注射器將待注射菌液2打滿棉花(“國欣3號”)子葉的下表面，得到對照植株(VIGS-GFP)。

4、GhPTP1沉默植株的檢測

對GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)和對照植株(VIGS-GFP)進(jìn)行鑒定。

提取GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)和對照植株(VIGS-GFP)葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

(1)半定量RT-PCR

以上述cDNA為模板，采用引物5’-ATGAAGATCGAGGATTTGG-3’和引物：5’-GCAAGCACGTGCTTCA-3’進(jìn)行半定量PCR，。

PCR反應(yīng)體系(20μL)：模板10×Buffer 2μL、10mmol/L dNTPs 2μL、MgSO₄1.4μL、cDNA 1.2μL、KOD-Plus酶0.4μL、上引物0.3μL、下引物0.3μL、ddH₂O 12.4μL；

PCR擴增程序為：94℃，2min；30個循環(huán)的程序為94℃，15s；56℃，30s；68℃，3min；最后68℃延伸10min。

(2)熒光定量PCR

以上述cDNA為模板，采用引物5’-TTCAGATGGTGGGACGAA-3’和引物5’-ATTGAGAGTGATGACGCCG-3’進(jìn)行熒光實時定量PCR(熒光實時定量PCR所用的儀器為ABI 7500Fast(Applied Biosystem))。以棉花Actin9基因作為對照(用于鑒定棉花Actin9基因的引物對為：5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’和5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’)。PCR程序：94℃變性30s；94℃變性5s、60℃退火35s、40個循環(huán)；相對表達(dá)量采用2^-ΔΔCt方法進(jìn)行計算。

半定量RT-PCR的檢測結(jié)果如圖2A：GhPTP1沉默植株的GhPTP1電泳條帶明顯弱于對照植株，說明GhPTP1基因表達(dá)受到了明顯抑制。

熒光定量的檢測結(jié)果如圖2B：GhPTP1沉默植株的GhPTP1表達(dá)了顯著低于對照植株，說明GhPTP1基因表達(dá)受到了明顯抑制。

GhPTP1沉默植株(中07)和GhPTP1沉默植株(中G5)的鑒定結(jié)果和GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)無顯著性差異。

三、VIGS-GhPTP1沉默植株的抗鹽表型

1、不同濃度脅迫處理

分別在100mM、200mM、250mM、300mM、400mM NaCl脅迫下，對GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)、對照植株(VIGS-GFP)和野生型棉花(“國欣3號”)進(jìn)行鹽脅迫處理，處理兩周后，觀察植株的表型并統(tǒng)計單株地上部與地下部干物重及存活率。

200mM NaCl脅迫處理的結(jié)果如圖3所示：與對照植株相比，GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)有較好的抗鹽性，且單株地上部與地下部干物重顯著高于對照植株。

不同鹽濃度脅迫處理的結(jié)果如圖4所示：與對照植株相比，GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)表現(xiàn)出較好的抗鹽性，并且存活率也高于對照。GhPTP1沉默后能夠提高植物的存活率，說明GhPTP1基因具有調(diào)控植物抗鹽性的功能。

野生型棉花的表型和存活率和對照植株的表型無顯著差異。

2、不同品種的抗鹽性

在200mM NaCl脅迫下，對GhPTP1沉默植株(中07)和GhPTP1沉默植株(中G5)、GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)和對照植株(VIGS-GFP)進(jìn)行鹽脅迫處理，處理兩周后，觀察植株的表型。

結(jié)果如圖5所示：GhPTP1沉默植株(中07)和GhPTP1沉默植株(中G5)、GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)的長勢均明顯好于對照植株。說明GhPTP1基因在不同棉花品種中均具有調(diào)控植物抗鹽性的功能。

野生型棉花的表型和對照植株的表型無顯著差異。

四、VIGS-GhPTP1沉默植株的抗旱表型

對GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)、對照植株(VIGS-GFP)進(jìn)行5％PEG干旱脅迫處理，處理3天后，觀察植株的表型，并統(tǒng)計GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)、對照植株(VIGS-GFP)干旱處理前的單株含水量和失水率。

結(jié)果如圖6所示：在5％PEG脅迫下，和對照植株相比，GhPTP1沉默植株(VIGS-GhPTP1)表現(xiàn)出明顯的抗旱表型，且含水量明顯高于對照植株，失水率明顯低于對照植株。GhPTP1沉默后能夠提高植物的含水量，并降低植物失水率，說明GhPTP1基因具有調(diào)控植物抗旱性的功能。

實施例3、轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥的獲得及抗逆性分析

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、提取棉花品種“國欣3號”葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟1得到的cDNA為模板，用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

正向引物：F1:5’-CTCTAGAATGAAGATCGAGGATTTGGG-3’；

反向引物：R1:5’-GGGTACCGCAAGCACGTGCTTCATGAA-3’。

3、用限制性內(nèi)切酶XbaI和Kpn1雙酶切步驟2得到的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶XbaI和Kpn1雙酶切Super1300-GFP載體，回收載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Super1300-GFP-GhPTP1。

對重組質(zhì)粒Super1300-GFP-GhPTP1進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明：重組質(zhì)粒Super1300-GFP-GhPTP1為將序列表中序列1所示的DNA片段替換Super1300-GFP載體的XbaI和Kpn1酶切位點間的DNA片段，且保持Super1300-GFP載體的其他序列不變得到的載體。

二、轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥的獲得

1、將重組質(zhì)粒Super1300-GFP-GhPTP1導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。

2、待擬南芥植株(哥倫比亞生態(tài)型)開花后，剪去主枝頂端，促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展；在剪枝后的6天內(nèi)，將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌的菌懸液蘸濕擬南芥未露白的花序上，然后將擬南芥用充滿氣的黑色塑料袋包住，平放，暗培養(yǎng)24h后去掉塑料袋，恢復(fù)光照、按常規(guī)方法培養(yǎng)植株至結(jié)實，收獲成熟T₁代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子。

3、采用含有50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)T₁代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子并從中挑選陽性植株(陽性植株表現(xiàn)為：真葉健康呈深綠色，根伸長至培養(yǎng)基中)。

4、將步驟3獲得的陽性植株自交獲得T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子。

5、采用含有50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子并從中挑選陽性植株(篩選標(biāo)準(zhǔn)同上)。

對于某一T₁代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株，如果其T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株均為陽性植株，該T₁代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株及其自交后代為一個純合的轉(zhuǎn)基因株系。

5、培育T₂代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株并自交獲得T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子。培育T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥種子，得到T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株(OE1-OE14)。

6、提取T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株的基因組DNA(CTAB法)，用特異性引物擴增進(jìn)行分子鑒定。引物序列如下：

正向引物：F1:5’-CTCTAGAATGAAGATCGAGGATTTGGG-3’；

反向引物：R1:5’-GGGTACCGCAAGCACGTGCTTCATGAA-3’。

鑒定結(jié)果表明：T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥植株(OE1-OE14)均可以擴增得到大小為849bp的目的條帶，而野生型擬南芥擴增不到大小為849bp的目的條帶。選取T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3進(jìn)行下一步抗逆性的研究。

三、轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥的逆境敏感反應(yīng)

1、鹽脅迫下萌發(fā)率分析

將T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE2)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)和野生型擬南芥(wt)的種子分別種在正常MS培養(yǎng)基、含有100mM NaCl的MS培養(yǎng)基和含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基中，4℃春化72小時后，移入20℃溫室中，16h光/8h暗，光強為60μmol/m²/s，濕度60％～70％的培養(yǎng)室培養(yǎng)10天，分別統(tǒng)計存活率。

結(jié)果如圖7所示：在100mM NaCl和150mM NaCl條件下，T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE3)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)的萌發(fā)率均極顯著低于野生型擬南芥(wt)。

2、鹽脅迫下根長分析

將T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE2)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)和野生型擬南芥(wt)的種子分別種在正常MS培養(yǎng)基中，4℃春化72小時后，移入20℃溫室中，16h光/8h暗，光強為60μmol/m²/s，濕度60％～70％的培養(yǎng)室培養(yǎng)5天后移入100mM NaCl培養(yǎng)基，繼續(xù)生長3天后，統(tǒng)計根長。

結(jié)果如圖8所示：T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE2)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)的根長均極顯著短于野生型擬南芥(wt)。

3、其他逆境脅迫下萌發(fā)率分析

將T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE2)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)和野生型擬南芥(WT)的種子分別種在正常MS培養(yǎng)基、含有150mM甘露醇的MS培養(yǎng)基、含有0.5μM ABA(脫落酸)的MS培養(yǎng)基中，4℃春化72小時后，移入20℃溫室中，16h光/8h暗，光強為60μmol/m²/s，濕度60％～70％的培養(yǎng)室培養(yǎng)10天后，統(tǒng)計萌發(fā)率。

結(jié)果如圖9所示：在150mM甘露醇、0.5μM ABA條件脅迫，T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE1(OE1)、T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE2(OE2)和T₃代轉(zhuǎn)GhPTP1擬南芥株系OE3(OE3)的萌發(fā)率均極顯著低于野生型擬南芥(WT)。

以上各指標(biāo)的變化說明GhPTP1蛋白可以降低植物的抗逆性，尤其降低了擬南芥的抗鹽性、抗旱性和滲透脅迫抗性，并提高了對ABA的敏感性。