一種與酪氨酸磷酸酶抗體特異結(jié)合的抗原蛋白質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及抗原-抗體蛋白質(zhì)的技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及用于檢測糖尿病的截短的酪 氨酸磯酸酶（IA-2)的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種因膜島素分泌絕對或相對不足而引起的高血糖癥為主要特征的代 謝性疾病，受多種遺傳和環(huán)境因素影響。按照1997年美國糖尿病協(xié)會及1999年世界衛(wèi)生 組織（WHO)關(guān)于糖尿病分類及診斷標準，糖尿病可分為I型、II型、特殊類型糖尿病和妊娠 糖尿病。
[0003] 在1型糖尿病的免疫破壞期間，患者體內(nèi)會產(chǎn)生多種針對膜島細胞自身抗原的自 身抗體。自20世紀70年代W來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種膜島素自身抗體，例如；膜島細胞抗體 (ICA)、膜島細胞表面抗體（ICSA)、膜島素抗體（IAA)、熱休克蛋白抗體化SP)、谷氨酸脫駿 酶65佑AD65,哺乳動物中GAD的存在形式之一）抗體、蛋白質(zhì)酪氨酸磯酸酶抗體（IA-2A) 等。目前臨床上在診斷1型糖尿病常用的指標包括ICA、IAA、GADA、IA-2A。
[0004] 目前臨床上體外診斷1型糖尿病指標所用的平臺都基于放免或酶聯(lián)免疫技術(shù) 巧LASA)，自身免疫性1型糖尿病診斷試劑在敏感性和特異性方面有待于進一步改進。傳統(tǒng) 的放射免疫或者化ISA方法檢測時間長，至少6個小時，甚至過夜反應(yīng)才能完成測試，主要 依靠純手工加樣等系列操作，效率低，特異性不足?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)有高靈敏度、高特異性的 優(yōu)勢，檢測結(jié)果時間快、效率高，全程全自動儀器自動操作，1個小時即可完成測試，對現(xiàn)在 醫(yī)院的及時診斷治療起非常大的作用。
[0005] 隨著敏感性和特異性更高的化學(xué)發(fā)光技術(shù)在體外診斷中的應(yīng)用，開發(fā)能適用于化 學(xué)發(fā)光封閉系統(tǒng)的抗原變得尤其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是篩選出與酪氨酸磯酸酶（IA-2)抗體特異結(jié)合的截短的抗原 蛋白質(zhì)。目的之二是開發(fā)能滿足應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光封閉系統(tǒng)的抗原蛋白，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光 封閉系統(tǒng)。
[0007] 截短的抗原蛋白質(zhì)的表達與全長蛋白質(zhì)的表達相比，截短后的蛋白更容易表達， 表達量更高；在用于檢測糖尿病時，其與全長蛋白質(zhì)相比，截短后的蛋白靈敏度更好；非特 異性更低。
[000引本發(fā)明提供了一種與糖尿病特定抗體特異結(jié)合的抗原蛋白質(zhì)，所述抗原蛋白質(zhì)選 自如 SEQ ID NO: 17 中的第 600-979、604-979、604-969、600-969 和 709-969 位的截短蛋白 質(zhì)中的一種。
[0009] 在一個具體的實施例中，所述抗原蛋白質(zhì)選自如SEQ ID NO: 17中的第604-969、 600-969和709-969位的截短蛋白質(zhì)中的一種。
[0010] 在一個具體的實施例中，所述抗原蛋白質(zhì)選自如SEQ ID N0:17中的第709-969位 的截短蛋白質(zhì)。
[0011] 在一個具體的實施例中，所述抗原蛋白質(zhì)為真核表達系統(tǒng)獲得的蛋白質(zhì)。
[0012] 在一個具體的實施例中，所述抗原蛋白質(zhì)為昆蟲細胞表達系統(tǒng)獲得的蛋白質(zhì)。昆 蟲細胞表達系統(tǒng)是應(yīng)用較多的真核表達系統(tǒng)，它可W在昆蟲細胞中表達多種外源基因，包 括真菌，植物，細菌，病毒的基因。桿狀病毒是一類W昆蟲細胞為天然宿主的雙鏈DNA病毒， 具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動物，對人、畜無害。目前研究較多的是首猜銀紋夜蛾 核多角體（AcNPV)，其宿主是草地貪夜蛾。而SF9細胞，正是桿狀病毒表達系統(tǒng)的宿主細胞 之一。SF9細胞屬于半貼壁型細胞系，可W進行懸浮培養(yǎng)，也可W進行貼壁培養(yǎng)，在應(yīng)用于蛋 白的表達與制備純化中，有許多的優(yōu)點；1)與其他真核表達系統(tǒng)相比，外源基因表達水平 高，特別是細胞內(nèi)蛋白。多數(shù)情況下，表達的重組蛋白可溶，折疊正確有翻譯后修飾（如糖 基化等），有生物學(xué)活性，容易分離純化；2)利用昆蟲細胞懸浮生長，容易放大培養(yǎng)，有利于 大規(guī)模表達重組蛋白；3)易于表達異源多聚體蛋白，可通過多種重組病毒同時感染昆蟲細 胞或用含有多個表達框的一種病毒感染昆蟲細胞來實現(xiàn)；4)昆蟲桿狀病毒不感染脊椎動 物，具有安全性。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種抗原蛋白質(zhì)，所述抗原蛋白質(zhì)為上述截短型的蛋白質(zhì)或IA-2 的全長蛋白質(zhì)，且所述蛋白質(zhì)為納米磁珠包被的蛋白質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明又提供了一種用于檢測糖尿病的試劑盒，所述試劑盒包括一種抗原蛋白 質(zhì)，所述抗原蛋白質(zhì)選自如SEQ ID NO:17中的第600-979、604-979、604-969、600-969和 709-969位的截短蛋白質(zhì)中的一種。
[0015] 在一種具體的實施例中，所述試劑盒中的所述抗原蛋白質(zhì)選自如SEQ ID NO: 17中 的第604-969、600-969和709-969位的截短蛋白質(zhì)中的一種。
[0016] 在一個具體的實施例中，所述抗原蛋白質(zhì)選自如SEQ ID N0:17中的第709-969位 的截短蛋白質(zhì)。需要指出的是，在檢測抗體的過程中，所選用的抗原蛋白質(zhì)并非全長蛋白 質(zhì)是最優(yōu)的，因為雖然全長蛋白質(zhì)包含了更多的抗原決定簇，該樣能夠更容易的識別其相 應(yīng)的抗體，但是由于全長蛋白質(zhì)包含較多的抗原決定簇，也會帶來非特異性增高的結(jié)果；此 夕F，蛋白質(zhì)的片段長度越長，其表達難度W及后續(xù)的純化等一系列的操作的難度也會相應(yīng) 的越高。因此，優(yōu)選的抗原蛋白質(zhì)應(yīng)該是首選滿足靈敏性和特異性的前提下，蛋白質(zhì)的片段 越短則越有利于應(yīng)用于實際。例如，在化學(xué)發(fā)光法的檢測系統(tǒng)中，用于檢測糖尿病的IA-2 抗體的最優(yōu)的蛋白質(zhì)為如SEQ ID NO: 17中的第709-969位的截短蛋白質(zhì)。
[0017] 在一個具體的實施例中，所述試劑盒中的所述抗原蛋白質(zhì)為在真核表達系統(tǒng)中表 達而獲得的蛋白質(zhì)。
[0018] 在一個具體的實施例中，所述試劑盒中的所述抗原蛋白質(zhì)為在昆蟲細胞表達系統(tǒng) 中表達而獲得的蛋白質(zhì)。
[0019] 在一個具體的實施例中，所述試劑盒中的所述抗原蛋白質(zhì)為納米磁珠包被的蛋白 質(zhì)。
[0020] 在一個具體的實施例中，所述試劑盒中還包括化學(xué)發(fā)光標記的蛋白A。利用化學(xué)發(fā) 光法可W提高產(chǎn)品的靈敏度和特異性。其中，蛋白A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質(zhì)， 能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG)的化區(qū)結(jié)合。
[0021] 在一個具體的實施例中，所述試劑盒中還包括所述試劑盒中還包括BSA緩沖液。 所述