擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及高通量測序領(lǐng)域,具體而言,涉及一種擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研宄有著十分重要的意義。第一代 測序儀對電泳分離技術(shù)的依賴,使其難以進(jìn)一步提高分析的速度和并行化程度,也難以 通過微型化降低測序成本。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn),21世紀(jì)初,以Roche 454技術(shù)、 illumina公司的Genome Analyzer技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技 術(shù)誕生了。第二代技術(shù)大大降低了測序成本,還大幅度提高了測序速度并保持了高準(zhǔn)確 性。其中,illumina公司的第一臺測序儀于2006年問世,之后開發(fā)出來一系列的測序儀,如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等,在準(zhǔn)確性、通量、成本和速度方面表現(xiàn)更優(yōu)秀,而 使其成為全球使用量最大的第二代測序儀。在第二代測序平臺不斷完善的同時,以對單分 子DNA進(jìn)行非PCR測序?yàn)橹饕卣鞯牡谌鷾y序技術(shù)也初顯端倪。但由于其關(guān)鍵技術(shù)問題 尚待解決,目前還未得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué)的研宄熱點(diǎn)。微生物多樣性的 研宄涉及農(nóng)業(yè)、土壤、林業(yè)、海洋、礦井、人體醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)研宄手段存在實(shí)驗(yàn)操作 費(fèi)時費(fèi)力、不可培養(yǎng)性、無法檢測痕量微生物、無法探索未知等的局限性。第二代高通量測 序技術(shù),尤其是illumina Miseq高通量測序技術(shù)的成熟和普及,使我們能夠?qū)Νh(huán)境微生物 進(jìn)行深度測序,靈敏地檢測環(huán)境樣品在細(xì)菌、真菌、古菌分類方面物種之間的差異,精確指 導(dǎo)不同環(huán)境微生物的構(gòu)成。
[0004] 16S rDNA是編碼細(xì)菌核糖體小亞基的DNA序列,分子大小約1540bp,由9個可變 區(qū)和10個保守區(qū)交叉排列組成。保守區(qū)能反映物種間親緣關(guān)系,可變區(qū)在不同菌種間存在 差異。根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,將可變區(qū)擴(kuò)增出來進(jìn)行測序,通過測序數(shù)據(jù)與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫 的比對,即可確定微生物在進(jìn)化樹中的位置,從而鑒定樣本中可能存在的細(xì)菌種類。研宄表 明,V4靶基因區(qū)域(約300bp)對微生物進(jìn)行分類較為準(zhǔn)確。
[0005] ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5. 8S rRNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)域,ITS2位于真核 生物的5. 8S rRNA和28S rRNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)域。由于進(jìn)化相對于18S rRNA、5. 8S rRNA 和28SrRNA迅速而具多態(tài)性,因而適合于等級水平較低的系統(tǒng)學(xué)研宄。根據(jù)保守區(qū)序列設(shè) 計(jì)引物,將其擴(kuò)增出來進(jìn)行測序,通過測序數(shù)據(jù)與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫的比對,即可確定微生物在進(jìn) 化樹中的位置,從而鑒定樣本中可能存在的真菌種類,是目前非常常見的分析真菌方法。
[0006] 擴(kuò)增子測序是對特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進(jìn)行測序,不僅包括16S rDNA測序,還包括18S rDNA測序、ITS測序及功能基因檢測等。采用illumina MiSeq第二 代高通量測序平臺對來源于不同環(huán)境的樣本進(jìn)行16S/18S/ITS中某個高變區(qū)域深度測序, 能靈敏地探測出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的變化而發(fā)生的極其微弱的變化,對于我 們研宄微生物與環(huán)境的關(guān)系,環(huán)境治理和微生物資源的利用有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
[0007] 為進(jìn)行微生物擴(kuò)增子區(qū)域的測序,首先需要對目標(biāo)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后構(gòu)建 適用于二代測序平臺的文庫。目前的擴(kuò)增體系主要有20ul和50ul兩種,體系中模板量的 添加一般為經(jīng)驗(yàn)值,并沒有一個確定的量,波動性較大,對擴(kuò)增結(jié)果也影響較大。同時退火 溫度則根據(jù)引物的不同而不同,一般在50-60°C之間。利用現(xiàn)有擴(kuò)增技術(shù)對上述擴(kuò)增子進(jìn) 行擴(kuò)增,合格率低且非特異性條帶較多。對于難擴(kuò)增的ITSl和ITS2區(qū)域擴(kuò)增一般使用的 Touchdown技術(shù)(65-50 °C ),對PCR儀要求較高。
[0008] 因此,仍需要對現(xiàn)有的針對微生物擴(kuò)增子的擴(kuò)增方法進(jìn)行改進(jìn),以降低擴(kuò)增子文 庫中非擴(kuò)增子的含量,提高擴(kuò)增子文庫的合格率,降低文庫構(gòu)建成本。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明提供了一種微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法,以降低擴(kuò)增子文庫中非擴(kuò)增子 的含量,提高擴(kuò)增子文庫的合格率,降低文庫構(gòu)建成本。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的,根據(jù)本發(fā)明的一個方面,提供了一種微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu) 建方法,該構(gòu)建方法包括以下步驟:S1,對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到富集的目的片段;以及 S2,對富集的目的片段進(jìn)行片段化文庫構(gòu)建,得到擴(kuò)增子文庫;其中,步驟Sl包括以下步 驟:S11,對目的片段的擴(kuò)增模板進(jìn)行定量;S12,對目的片段的擴(kuò)增引物的退火溫度進(jìn)行固 定;以及S13,利用擴(kuò)增引物在退火溫度下對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到富集目的片段。
[0011] 進(jìn)一步地,目的片段為16SV4、ITSl或ITS2。
[0012] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為16SV4時,擴(kuò)增引物為SEQ ID NO: 1所示的正向引物: GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及 SEQ ID N0:2 所示的反向引物:GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
[0013] 進(jìn)一步地,擴(kuò)增引物的退火溫度為48?52°C,優(yōu)選為50°C。
[0014] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為16SV4時,擴(kuò)增模板為10-20ng。
[0015] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為ITSl時,擴(kuò)增引物為SEQ ID N0:3所示的正向引物: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ;以及 SEQ ID 勵:4所示的反向引物:6(^6061'1'(:1'1^六1^6六了6(:。
[0016] 進(jìn)一步地,擴(kuò)增引物的退火溫度為55?56°C,優(yōu)選為55. 3°C。
[0017] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為ITSl時,擴(kuò)增模板為20_30ng。
[0018] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為ITS2時,擴(kuò)增引物為SEQ ID N0:5所示的正向引物: GCATCGCATAAGAACGCAGC;以及SEQIDN0:6所示的反向引物:TCCTCCCCATATTGATATGC ;優(yōu)選 擴(kuò)增引物的退火溫度為56?58°C,更優(yōu)選為57. 6°C。
[0019] 進(jìn)一步地,當(dāng)目的片段為ITS2時,擴(kuò)增模板為15-50ng。
[0020] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案,通過對來自于不同環(huán)境的核酸樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量擴(kuò)增體 系中的模板量,使得不同樣本間目的片段的擴(kuò)增效率相當(dāng),因而使產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)的波動 性降低;通過對所用引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了利用普通PCR儀,經(jīng)過簡單操作,提 供了一種目的片段擴(kuò)增合格率高、非特異條帶少的擴(kuò)增文庫構(gòu)建方法。本發(fā)明的上述方法 不僅降低擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建成本,而且降低擴(kuò)增子文庫中的非特異擴(kuò)增子的比例,提高了 擴(kuò)增子文庫的合格率。
【附圖說明】
[0021] 構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解,本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明,并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
[0022] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的一種典型實(shí)施方式中擴(kuò)增子文庫構(gòu)建的流程示意圖; [0023] 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1所提供的16SV4擴(kuò)增子的電泳檢測結(jié)果圖; [0024] 圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例2所提供的ITSl擴(kuò)增子的電泳檢測結(jié)果圖;以及
[0025] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例3所提供的ITS2擴(kuò)增子的電泳檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 需要說明的是,在不沖突的情況下,本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0027] 正如【背景技術(shù)】部分所提到的,現(xiàn)有技術(shù)的微生物擴(kuò)增子文庫構(gòu)建方法中,文庫構(gòu) 建合格率低且不同樣本間測序數(shù)據(jù)波動性較大的缺陷,為了改善上述狀況,在本發(fā)明一種 典型的實(shí)施方式中,提供了一種微生物擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法,如圖1所示,該構(gòu)建方法包 括以下步驟:S1,對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到富集目的片段;以及S2,對富集的目的片段進(jìn) 行片段化文庫構(gòu)建,得到擴(kuò)增子文庫;其中,步驟Sl包括以下步驟:S11,對目的片段的擴(kuò)增 模板進(jìn)行定量;S12,對目的片段的擴(kuò)增引物的退火溫度進(jìn)行固定;以及S13,利用擴(kuò)增引物 在退火溫度下對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增,得到富集目的片段。
[0028] 在本發(fā)明的上述構(gòu)建方法中,通過對來自于不同環(huán)境的核酸樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量擴(kuò) 增體系中的模板量,使得不同樣本間目的片段的擴(kuò)增效率相當(dāng),因而使產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)的 波動性降低;通過對所用引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了利用普通PCR儀,經(jīng)過簡單操 作,提供了一種目的片段擴(kuò)增合格率高、非特異條帶少的擴(kuò)增文庫構(gòu)建方法。本發(fā)明的上述 方法不僅降低擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建成本,而且降低擴(kuò)增子文庫中的非特異擴(kuò)增子的比例,提 高了擴(kuò)增子文庫的合格率。
[0029] 在本發(fā)明的上述構(gòu)建方法中,是一種適用于環(huán)境微生物擴(kuò)增子的高效擴(kuò)增方法, 能在普通的PCR設(shè)備上完成擴(kuò)增,不僅擴(kuò)增合格率高,而且在擴(kuò)增中產(chǎn)生的非特異性條帶 少。上述擴(kuò)增子即目的片段,根據(jù)研宄目的的不同,可以是不同的基因或基因組片段。在本 發(fā)明一優(yōu)選的實(shí)施例中,上述目的片段可以是16SV4、ITSl或ITS2。上述三個目的片段能 夠根據(jù)其片段中的某個高變區(qū)來體現(xiàn)環(huán)境中微生物的多樣性或環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)隨 外界環(huán)境的變化。
[0030] 在本發(fā)明的上述構(gòu)建方法中,當(dāng)目的片段為16SV4時,擴(kuò)增引物為SEQ ID NO: 1所示的正向引物:GTGCCAGCMGMWGCGGTAA ;以及SEQ ID NO:2所示的反向引物: GGACTACHVGGGTWTCTAAT。上述引物是根據(jù)其保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì),引物之間擴(kuò)增的目的片段 是不同物種間的可變區(qū),采用上述引物能夠?qū)⒉煌h(huán)境中的16SV4的可變區(qū)都擴(kuò)