芋螺毒液管cDNA文庫及其構(gòu)建方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及構(gòu)建芋螺毒液管cDNA文庫的方法，具體地，涉及芋螺毒液管cDNA文庫 及其構(gòu)建方法和用途。更具體，涉及芋螺毒液管cDNA文庫及其構(gòu)建方法，確定芋螺毒液管 中芋螺毒素肽全長(zhǎng)基因序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芋螺毒素具有高度遺傳多樣性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，富含二硫鍵，且生物活性功能 強(qiáng)，可高選擇性地作用于配體門控離子通道、電壓門控離子通道和G蛋白相關(guān)受體等靶標(biāo)， 并能對(duì)各種離子通道亞型及其亞基進(jìn)行區(qū)分，已成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究的重要工具和 新藥開發(fā)的新來源，引起了國際生物學(xué)與藥學(xué)界的廣泛關(guān)注。雖然芋螺毒素種類繁多，但迄 今為止，已發(fā)現(xiàn)和研究的芋螺多肽還不到估計(jì)總數(shù)量的千分之一，這表明芋螺毒液是一個(gè) 潛力無限的"天然海洋藥物寶庫"，尚待人類深入的研究、開發(fā)與利用。近年來，研究芋螺毒 素、開發(fā)成新型神經(jīng)多肽類藥物已成為國際上的熱門研究方向。
[0003] 傳統(tǒng)的芋螺毒素藥物篩選大多是從自然界活體芋螺的毒液管中分離天然芋螺毒 素，然后直接用于研究和應(yīng)用或以此作為藥物化學(xué)的先導(dǎo)化合物，再進(jìn)一步設(shè)計(jì)、加工、合 成，篩選有效的功能藥物。但此方法具有一定的盲目性，篩選周期長(zhǎng)。
[0004] 因此，關(guān)于芋螺毒素的篩選方面的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種高通量篩選芋螺毒素全長(zhǎng)基因的方法。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建芋螺毒液管cDNA文庫的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：將所述芋螺毒液管的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;以及 酶切回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便獲得目的片段，所述目的片段構(gòu)成所述芋螺 毒液管cDNA文庫。由此，利用本發(fā)明的方法能夠高效構(gòu)建針對(duì)特異長(zhǎng)度目的片段的芋螺毒 液管全長(zhǎng)cDNA文庫，進(jìn)一步基于該cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長(zhǎng)基因序列， 能夠有效提聞獲得芋螺毒素的機(jī)率。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的總RNA。由此，提 取獲得的芋螺毒液管的總RNA質(zhì)量較高、完整性好、未降解，且操作簡(jiǎn)單，方便快捷。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用Creator SMART cDNA試劑盒進(jìn)行所述反轉(zhuǎn)錄，其中所 述 Creator SMART cDNA 試劑盒中的 CDSIII/3primer 引物被 CDS-3M adapter 代替，所述 CDS-3M adapter 的序列為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3'。由 此，能夠有效得到RNA序列的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在進(jìn)行所述酶切回收之前，進(jìn)一步包括：將所述cDNA進(jìn)行 均一化處理。由此，降低了文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度，提高了發(fā)現(xiàn)隨機(jī)序列和稀有 基因的幾率，從而能夠獲得更多低豐度的芋螺毒素 cDNA，進(jìn)而有效克服了基因轉(zhuǎn)錄水平上 的巨大差異給文庫篩選和分析帶來的障礙。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用Trimmer-Director試劑盒進(jìn)行所述均一化處理。由 此，能夠有效實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA的均一化，且均一化效果較好。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用Sfi I Enzyme進(jìn)行所述酶切。由此，能夠高效對(duì)cDNA 進(jìn)行酶切處理，獲得特定長(zhǎng)度的目的片段，提高酶切效率。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用QIAquick Gel Extraction試劑盒進(jìn)行所述回收。由 此，目的片段的回收率較高，且操作簡(jiǎn)單，方便快捷。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括對(duì)各步驟產(chǎn)物進(jìn)行純化。由此，可以提高各步驟 產(chǎn)物的質(zhì)量，利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括將所述目的片段連接至載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 中。由此，能夠有效建立芋螺毒液管全長(zhǎng)CDNA文庫。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種芋螺毒液管CDNA文庫。根據(jù)本發(fā)明 的實(shí)施例，該芋螺毒液管cDNA文庫是通過期前面所述的構(gòu)建芋螺毒液管cDNA文庫的方法 構(gòu)建獲得的。由此，基于本發(fā)明的芋螺毒液管cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長(zhǎng) 基因序列，能夠有效提1?獲得芋螺毒素的機(jī)率。
[0016] 進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種確定芋螺毒液管中芋螺毒素 肽全長(zhǎng)基因序列的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：根據(jù)前面所述的構(gòu)建 芋螺毒液管CDNA文庫的方法，構(gòu)建所述芋螺毒液管的cDNA文庫；對(duì)所述cDNA文庫進(jìn)行測(cè) 序，以便獲得測(cè)序結(jié)果；以及基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長(zhǎng)基 因序列。由此，利用本發(fā)明的方法能夠大大提高獲得芋螺毒素的機(jī)率，能一次性、大量地獲 取芋螺毒素多肽的cDNA序列，并且得到的芋螺毒素序列可信度高，可對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn) 行驗(yàn)證，彌補(bǔ)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝錯(cuò)配問題。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用選自Hiseq2000、S0LID、454和單分子測(cè)序裝置的至少 一種進(jìn)行所述測(cè)序。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，基于所述測(cè)序結(jié)果，確定所述芋螺毒液管中芋螺毒素肽全 長(zhǎng)基因序列進(jìn)一步包括：將所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行預(yù)處理，以便獲得經(jīng)過預(yù)處理的測(cè)序結(jié)果； 將所述經(jīng)過預(yù)處理的測(cè)序結(jié)果與芋螺毒素庫進(jìn)行比對(duì)，以便確定所述芋螺毒液管中芋螺毒 素的芋螺毒素肽全長(zhǎng)基因序列。由此，可以高效確定芋螺毒素肽全長(zhǎng)基因序列，準(zhǔn)確度較 商。
[0019] 需要說明的是，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] (1)本發(fā)明是基于編碼芋螺毒素肽的mRNA構(gòu)建全長(zhǎng)CDNA文庫，獲得芋螺毒素的完 整開放閱讀框（0RF)，進(jìn)而獲得全長(zhǎng)的芋螺毒素前體肽；
[0021] (2)均一化處理可以獲得更多低豐度的芋螺毒素 cDNA ;
[0022] (3)切取針對(duì)特異長(zhǎng)度的目的片段cDNA，能夠大大提高獲得芋螺毒素的機(jī)率；
[0023] (4)本發(fā)明利用的高通量測(cè)序方法能一次性、大量地獲取芋螺毒素多肽的cDNA序 列；
[0024] (5)利用本發(fā)明的方法得到的芋螺毒素序列可信度高，可對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行 驗(yàn)證，彌補(bǔ)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝錯(cuò)配問題。
[0025] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說明】
[0026] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0027] 圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的芋螺毒素總RNA的電泳檢測(cè)圖；
[0028] 圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的二鏈cDNA合成后的電泳檢測(cè)圖；
[0029] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的經(jīng)過均一化處理的cDNA電泳檢測(cè)圖；
[0030] 圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的經(jīng)過均一化處理的cDNA二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的電泳檢測(cè)圖；以及
[0031] 圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的菌落PCR電泳檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā) 明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0033] 芋螺毒液管cDNA文庫及其構(gòu)建方法
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建芋螺毒液管cDNA文庫的方法。根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：將所述芋螺毒液管的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;酶切 回收所述cDNA中400-1400bp的片段，以便獲得目的片段，所述目的片段構(gòu)成所述芋螺毒液 管cDNA文庫。由此，利用本發(fā)明的方法能夠高效構(gòu)建針對(duì)特異長(zhǎng)度目的片段的芋螺毒液管 全長(zhǎng)cDNA文庫，進(jìn)一步利用該cDNA文庫確定芋螺毒液管中芋螺毒素肽全長(zhǎng)基因序列，能夠 有效提1?獲得芋螺毒素的機(jī)率。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提取所述芋螺毒液管的總RNA的方法不受特別限制，只要 能夠獲得完整、未降解的RNA，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施例，利用Trizol LS法提取所述芋螺毒液管的總RNA。由此，提取獲得的芋螺毒液 管的總RNA質(zhì)量較高、完整性好、未降解，且操作簡(jiǎn)單、方便快捷。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄的方法不受特別限制，只能能夠有效獲得芋螺 毒素全長(zhǎng)cDNA，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 例，利用Creator SMART cDNA試劑盒進(jìn)行所述反轉(zhuǎn)錄，其中所述Creator SMART cDNA試 劑盒中的⑶SIII/3primer引物被Q3S-3M adapter代替，所述Q3S-3M adapter的序列為： 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCd(T)20VN-3'（SEQ ID N0:1，其中，該 CDS-3M adapter 序列也可以直接表示為：5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCGAGGCGGCCnTTITITT TTTTTTTTTTTVN-3'）。由此，能夠有效得到RNA序列的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在進(jìn)行所述酶切回收之前，需要將所述cDNA進(jìn)行均一化處 理。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)將所述cDNA進(jìn)行均一化處理的方法