本發(fā)明涉及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及抗原的制備技術(shù)，具體涉及一種乙型腦炎病毒懸浮培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

流行性乙型腦炎是由黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種人獸共患蟲媒性傳染病。人、豬、馬屬動物等對該病毒均易感，其中對豬的危害最大。豬乙型腦炎主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔、公豬睪丸炎等，常常給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)滅活苗的制造工藝簡單，易保存，安全性好，但注射劑量大，需多次重復(fù)注射，且免疫效果較弱毒活疫苗差，在實際應(yīng)用中使用很少。目前，弱毒活疫苗的使用已替代滅活苗。但如今乙型腦炎病毒一般以傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝進(jìn)行增殖，其生產(chǎn)周期長、操作機(jī)械化程度低，污染機(jī)率提高，諸多因素可影響抗原的生產(chǎn)及質(zhì)量。盡管有研究者嘗試?yán)靡?guī)?；纳锓磻?yīng)器進(jìn)行連續(xù)式培養(yǎng)，但這種條件下一方面加大了生產(chǎn)成本，另一方面還存在著質(zhì)量不穩(wěn)定、污染幾率高等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種乙型腦炎病毒懸浮培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的JEV病毒生產(chǎn)方法產(chǎn)量低、質(zhì)量不穩(wěn)定的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中JEV病毒的大規(guī)模培養(yǎng)方法占地面積較大、生產(chǎn)成本較高的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種乙型腦炎病毒懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)取微載體加入生物反應(yīng)器，以每克微載體對應(yīng)200～300ml PBS緩沖液的比例加入PBS緩沖液，浸泡2～3h，更換PBS緩沖液再浸泡1～2h，期間持續(xù)攪拌，棄去PBS緩沖液；以每克微載體對應(yīng)100～150ml PBS緩沖液的比例加入PBS緩沖液，濕熱滅菌，冷卻后棄去PBS緩沖液，以培養(yǎng)基洗滌微載體2～3遍，加入新鮮培養(yǎng)基，冷卻至2～8℃，平衡8～12h，備用；

2)取步驟1)處理后的微載體，平衡其溫度至25～30℃，補(bǔ)充培養(yǎng)基至其中微載體濃度為2～3g/L；將Vero細(xì)胞以5×10⁵～7×10⁵cell/L的濃度接種，攪拌混勻，靜置；

3)調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器溫度36～38℃，在攪拌條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)總時間35～40h時流加補(bǔ)料，培養(yǎng)總時間70～100h時接種乙型腦炎病毒；

4)以0.1～0.5的MOI值接種病毒，36～38℃靜置吸附，而后在攪拌條件下培養(yǎng)，此后16～24h時流加補(bǔ)料、50～70h時收獲病毒。

作為優(yōu)選，所述微載體型號為cytodex1。

作為優(yōu)選，所述生物反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器，其攪拌器為推進(jìn)式。

作為優(yōu)選，所述生物反應(yīng)器是潮汐式、旋轉(zhuǎn)式或灌注式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器。

作為優(yōu)選，步驟1)中所述持續(xù)攪拌的轉(zhuǎn)速是10～15r/min。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基中含有2～4％的新生牛血清。

作為優(yōu)選，步驟2)中所述攪拌的轉(zhuǎn)速為45～55r/min。

作為優(yōu)選，步驟3)的培養(yǎng)過程中，空氣飽和度為40～60％，pH值為7.1～7.4。

作為優(yōu)選，步驟3)和步驟4)所述補(bǔ)料的成分為葡萄糖和谷氨酰胺的50～70倍濃縮液，流加的速率為3～5ml/18h。

作為優(yōu)選，步驟4)中所述攪拌的轉(zhuǎn)速為60～80r/min。

作為優(yōu)選，步驟4)的培養(yǎng)過程中，空氣飽和度為70～90％，pH值為7.1～7.4。

作為優(yōu)選，步驟2)中所述靜置的時間為2～3h。

作為優(yōu)選，步驟4)中靜置吸附的時間為1～3h。

作為優(yōu)選，步驟1)中所述PBS緩沖液的pH值為7.0～7.2。

作為優(yōu)選，步驟3)所述的乙型腦炎病毒是SA14-14-2株。

本發(fā)明提供了一種乙型腦炎病毒懸浮培養(yǎng)方法，該技術(shù)方案依托于動物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)技術(shù)展開。由于微載體為單層貼壁細(xì)胞的生長繁殖提供了更大的表面積，因此為細(xì)胞生長提供了一個均質(zhì)的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，利用微載體作為細(xì)胞定殖的物理支撐，再結(jié)合優(yōu)化的培養(yǎng)條件，從而提高了細(xì)胞及病毒的培養(yǎng)密度。

本發(fā)明實現(xiàn)了乙型腦炎病毒的規(guī)?；囵B(yǎng)，提供大量的優(yōu)質(zhì)病毒抗原。同時，本發(fā)明克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)動物原代細(xì)胞生產(chǎn)的單批產(chǎn)量不高、批間差異大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本和污染機(jī)率高等缺陷。此外，本發(fā)明能連續(xù)培養(yǎng)、占地小、生產(chǎn)規(guī)模大、對細(xì)胞傷害小，克服了傳統(tǒng)工藝占地空間大，培養(yǎng)不連續(xù)，生產(chǎn)成本高等缺點。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

本發(fā)明實施例中優(yōu)先使用攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，其它微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，如：潮汐式、旋轉(zhuǎn)式或灌注式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，均可以使用。

本發(fā)明使用攪拌式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器，易于控制和規(guī)模放大，具有良好流體混合能力和氧氣輸送能力，保證了培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和溶解氧的供應(yīng)，滿足GMP生產(chǎn)要求，適合病毒的規(guī)模化增殖培養(yǎng)。

實施例1

(1)微載體制備：取60g微載體cytodex1加入生物反應(yīng)器，以200ml/g比例加入PBS(pH值7.0)浸泡2.5h，去掉PBS，重新加入PBS，10r/min攪拌，浸泡2h，棄去PBS。

以100ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻后棄去PBS，以培養(yǎng)基洗滌2遍，加入新鮮培養(yǎng)基，冷卻至8℃，平衡10h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至28℃，補(bǔ)充培養(yǎng)基，微載體濃度為2g/L；將Vero細(xì)胞以5×10⁵cell/L比例接種，45r/min攪拌混勻，靜置2h，重復(fù)2次，使細(xì)胞充分分布。

(3)細(xì)胞和微載體混合后，調(diào)節(jié)溫度37℃，45r/min攪拌，以50％空氣飽和度和控制pH值7.2進(jìn)行培養(yǎng)，36h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(50倍濃縮液)，流加速率為5ml/18h。培養(yǎng)80h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.3病毒感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附3h，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為85r/min，75％空氣飽和度和控制pH值7.2進(jìn)行培養(yǎng)，16h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(50倍濃縮液)，60h后收獲病毒。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCID₅₀，每1.0ml含病毒＞10^7.9TCID₅₀。

實施例2

(1)微載體制備：取90g微載體cytodex1加入生物反應(yīng)器，以300ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡2h，去掉PBS，重新加入PBS，15r/min攪拌，浸泡1h，棄去PBS。

以150ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻后棄去PBS，以培養(yǎng)基洗滌3遍，加入新鮮培養(yǎng)基，冷卻至6℃，平衡12h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至25℃，補(bǔ)充培養(yǎng)基，微載體濃度為3g/L；將Vero細(xì)胞以7×10⁵cell/L比例接種，50r/min攪拌混勻，靜置2.5h，重復(fù)3次，使細(xì)胞充分分布。

(3)細(xì)胞和微載體混合后，調(diào)節(jié)溫度37℃，55r/min攪拌，以48％空氣飽和度和控制pH值7.4進(jìn)行培養(yǎng)，40h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(70倍濃縮液)，流加速率為3ml/18h。培養(yǎng)90h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.5病毒感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附2.5h，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100r/min，90％空氣飽和度和控制pH值7.4進(jìn)行培養(yǎng)，20h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(70倍濃縮液)，70h后收獲病毒。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCID₅₀，每1.0ml含病毒＞10^7.7TCID₅₀。

實施例3

(1)微載體制備：取75g微載體cytodex1加入生物反應(yīng)器，以250ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡3h，去掉PBS，重新加入PBS，12r/min攪拌，浸泡1.5h，棄去PBS。

以130ml/g比例加入PBS，121℃，高壓30min，冷卻后棄去PBS，以培養(yǎng)基洗滌3遍，加入新鮮培養(yǎng)基，冷卻至4℃，平衡12h，備用。

(2)滅菌微載體平衡至30℃，補(bǔ)充培養(yǎng)基，微載體濃度為2.5g/L；將vero細(xì)胞以5.5×10⁵cell/L比例接種，50r/min攪拌混勻，靜置2.5h，重復(fù)3次，使細(xì)胞充分分布。

(3)細(xì)胞和微載體混合后，調(diào)節(jié)溫度37℃，50r/min攪拌，以50％空氣飽和度和控制pH值7.1進(jìn)行培養(yǎng)，38h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(60倍濃縮液)，流加速率為4ml/18h。培養(yǎng)95h接種病毒(SA14-14-2株)。

(4)以0.1病毒感染復(fù)數(shù)(M.O.I.)接種病毒，37℃靜置吸附2h，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為90r/min，80％空氣飽和度和控制pH值7.3進(jìn)行培養(yǎng)，18h后流加葡萄糖和谷氨酰胺補(bǔ)料(60倍濃縮液)，70h后收獲病毒。根據(jù)Reed-Muench法計算病毒TCID₅₀，每1.0ml含病毒＞10^8.2TCID₅₀。

以上對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。