本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株植物乳桿菌及其應(yīng)用于果蠅社交行為的矯正。

背景技術(shù)：

腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致病原微生物過度生長，腸道的生理代謝狀態(tài)紊亂，可以通過神經(jīng)遞質(zhì)、代謝產(chǎn)物、細(xì)胞因子和中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行信息交流，影響宿主腦功能神經(jīng)行為出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響情緒和認(rèn)知行為(Mangiola et al.,2016)。腸道菌群失調(diào)研究發(fā)現(xiàn)大部分智能障礙以及自閉癥的患者都出現(xiàn)腸道菌群紊亂、腸粘膜屏障功能受損的情況(Malkki et al.,2014)。目前，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，尤其是基因突變導(dǎo)致認(rèn)知和智能障礙如自閉癥發(fā)病率居高不下，至今仍未尋找到有效的治療方法。

KDM5家族蛋白是重要的激活或抑制基因表達(dá)的染色體蛋白(Blair et al.,2011)，KDM5蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有四個(gè)家族成員，而果蠅具有單一KDM5同源物。KDM5蛋白參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，包括氧化應(yīng)激、線粒體功能和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等，該蛋白功能的失調(diào)與智能障礙(Intellectual Disability，ID)以及自閉癥(Autism)等疾病密切相關(guān)(Silver et al.,2014)，KDM5C突變會(huì)導(dǎo)致小鼠自閉癥行為(Iwase et al.,2016)。這些突變位點(diǎn)與果蠅的KDM5蛋白具有顯著的保守性。

果蠅作為一種經(jīng)典的動(dòng)物模型，其遺傳背景清晰、繁殖快，已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。果蠅的消化道與哺乳動(dòng)物腸道非常相似，果蠅的微生物種群雖然比人類微生物種群簡單，然而它們?nèi)匀粍?dòng)態(tài)影響果蠅生命活動(dòng)，具體包括壽命、社交行為和腦功能等(Venuet al.,2014；Lee et al.,2013)。另一方面，這些微生物種群在人類的腸道中也共生，因此研究這些共生菌群與果蠅腸道的相互作用，對(duì)揭示人類腸道菌群進(jìn)化保守的機(jī)制也具有重要意義。

果蠅的KDM5蛋白與人類的KDM5家族蛋白高度保守，以及KDM5P因子插入的突變體果蠅顯示腸道菌群紊亂和社交行為缺陷等表型，因此，本發(fā)明在該研究背景和基礎(chǔ)上，以果蠅為模型，從野生型果蠅中分離得到益生菌以改善KDM5突變果蠅的社交行為，從而為自閉癥的診療奠定研究基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株益生菌株及其在緩解自閉癥社交行為缺陷方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的菌株為一種植物乳桿菌，命名為Lactobacillus plantarum L168菌株，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.13660。

本發(fā)明還公開了所述的植物乳桿菌CGMCC No.13660在制備矯正果蠅社交行為制劑中的應(yīng)用。具體的方法是：將植物乳桿菌CGMCC No.13660在營養(yǎng)培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)18h，離心收集和洗滌菌體；將10⁷CFU菌體懸浮于含2mL 5％蔗糖的PBS緩沖溶液中，得到矯正果蠅社交行為的制劑。用該制劑喂養(yǎng)果蠅，果蠅體內(nèi)的植物乳桿菌CGMCC No.13660的數(shù)量增加，同時(shí)果蠅壽命、腸道形態(tài)和社交行為得到恢復(fù)。

本發(fā)明所采用的研究模型為KDM5突變果蠅的腸道細(xì)、短，且存在多數(shù)氣泡狀的受損組織(圖1所示)，社交行為也弱于野生型果蠅(如圖2所示)。

本發(fā)明利用MRS固體培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)乳桿菌在KDM5突變果蠅腸道中的數(shù)量顯著少于在野生型果蠅的腸道中(如圖3所示)，本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC No.13660是一種兼性厭氧菌，在標(biāo)準(zhǔn)MRS培養(yǎng)基上厭氧環(huán)境下可生長，PCR結(jié)果表明為植物乳桿菌(如圖3、圖4所示)。

本發(fā)明中當(dāng)果蠅攝入植物乳桿菌CGMCC No.13660后腸道內(nèi)乳桿菌含量增高(如圖5、圖6所示)，植物乳桿菌No.CGMCC 13660可改善果蠅壽命和腸道缺陷(如圖7所示)。

本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC No.13660可改善果蠅社交行為(如圖8所示)。

本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC No.13660不僅能夠改善果蠅壽命、腸道缺陷，還能改善果蠅社交行為。

應(yīng)用本發(fā)明可矯正果蠅的社交行為，并有望應(yīng)用到人類自閉癥疾病的診療中。

附圖說明

圖1.野生型果蠅w¹¹¹⁸和突變型果蠅kdm5^k6801/10424腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖2.KDM5突變果蠅kdm5^k6801/10424存在社交行為缺陷。

圖3.乳桿菌在野生型果蠅w¹¹¹⁸和突變型果蠅kdm5^k6801/10424腸道中的含量。

圖4.植物乳桿菌CGMCC No.13660的16S rRNA部分序列的PCR擴(kuò)增。

圖5.果蠅喂完萬古霉素后乳桿菌數(shù)量上升，萬古霉素沒有改善突變型果蠅kdm5^k6801/10424社交行為缺陷。

圖6.果蠅攝入植物乳桿菌CGMCC No.13660后的乳桿菌數(shù)量增加。

圖7.植物乳桿菌CGMCC No.13660可改善果蠅壽命和腸道缺陷。

圖8.植物乳桿菌CGMCC No.13660可改善果蠅的社交行為。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：突變果蠅腸道和社交行為的缺陷

利用果蠅kdm5^k6801和果蠅kdm5¹⁰⁴²⁴雜交后得到KDM5表達(dá)下調(diào)的突變果蠅kdm5^k6801/10424，突變果蠅kdm5^k6801/10424年齡顯著低于野生型果蠅w¹¹¹⁸(Liu et al.,2014)，果蠅信息可以查閱FlyBase網(wǎng)站http://flybase.org/；kdm5^k6801kdm5¹⁰⁴²⁴和w¹¹¹⁸果蠅均可從FlyBase(http://flybase.org/)購買。。kdm5^k6801/10424果蠅腸道短且細(xì)，腸道中存在多數(shù)氣泡狀的受損組織(圖1)。根據(jù)文獻(xiàn)(Mcneil et al.,2015)分析果蠅間的社交活動(dòng)行為，將40只雌蠅轉(zhuǎn)移到社交行為玻璃板內(nèi)水平觀察2h，每30min拍照一次，利用GraphPad Prism 5.0軟件分析果蠅間的距離。結(jié)果表明突變果蠅kdm5^K6801/10424的社交距離顯著性高于野生型果蠅(圖2)。

實(shí)施例二：乳桿菌株的分離篩選、鑒定和生物學(xué)特性

1、菌株分離

解剖野生型果蠅w¹¹¹⁸和突變果蠅kdm5^k6801/10424雌性腸道，取4只果蠅腸道加入200μL無菌水中，研磨震蕩后，取100μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基中。MRS培養(yǎng)基的組成為：10g/L蛋白陳，5g/L牛肉粉，4g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，1mL/L吐溫80，2g/L磷酸氫二鉀，5g/L乙酸鈉，2g/L檸檬酸三銨，0.2g/L硫酸鎂，0.05g/L硫酸錳，15g/L瓊脂粉，pH 6.8。樣品于19℃、靜置厭氧培養(yǎng)18h。結(jié)果表明突變果蠅kdm5^k6801/10424腸道內(nèi)的乳桿菌數(shù)量顯著少于w¹¹¹⁸腸道內(nèi)的乳桿菌數(shù)量(圖3)。從野生型果蠅w¹¹¹⁸的MRS平板上挑取不同形態(tài)的單菌落劃線至新的MRS平板上，29℃過夜培養(yǎng)后，再次進(jìn)行菌種平板劃線純化，共挑取20個(gè)單菌落。

2、SCL3-10菌株的鑒定及生物學(xué)特性

在MRS固體培養(yǎng)基上，菌落呈白色、光滑、不透明、有粘液、邊緣規(guī)整。革蘭氏陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性。

采用菌落PCR擴(kuò)增16S rRNA基因序列并進(jìn)行菌株的分類學(xué)鑒定。從含MRS固體培養(yǎng)基上用無菌牙簽挑取單菌落，加入20μL無菌水，100℃加熱10min。輕微離心后，取5μL作為模板。引物為設(shè)計(jì)的乳桿菌16S rRNA基因擴(kuò)增通用引物E9F和E1541R(Baker et al.,2003)。引物由擎科新業(yè)生物技術(shù)(南京)有限公司合成。反應(yīng)體系：Taq緩沖液(10×)2.5μL、MgCl₂(25mM)1μL、dNTP(2.5mM)2.5μL、E9F(10mM)1μL、E1541R(10mM)1μL、去離子水16.5μL、rTaq酶(2U/μL)0.5μL，共25μL總反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min(圖4)。所得序列由生工生物工程(上海)有限公司測序后，得到的部分16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1)在美國國家生物技術(shù)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blast搜索。比對(duì)結(jié)果表明L168菌株與植物乳桿菌Lactobacillus plantarum親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到100％。

L168菌株于2017年2月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，保藏編號(hào)為CGMCC No.13660。

實(shí)施例三：植物乳桿菌CGMCC No.13660矯正果蠅壽命和腸道形態(tài)

研究報(bào)道植物乳桿菌對(duì)萬古霉素具有耐藥性(Tynkkynen et al.,1998)，用3M濾紙片浸泡于含30μM萬古霉素的5％蔗糖PBS緩沖液(0.2mol/L Na₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 7.0)，將濾紙片置于空果蠅管中喂養(yǎng)剛出生的果蠅，每天換新鮮濾紙片，待2d后用植物乳桿菌CGMCC No.13660喂養(yǎng)果蠅。解剖喂了CGMCC No.13660的果蠅腸道觀察乳桿菌含量的變化，同時(shí)分析果蠅行為變化。結(jié)果表明突變果蠅kdm5^k6801/10424喂養(yǎng)萬古霉素后乳桿菌含量顯著增加(圖5)，但社交行為沒有改善(圖5)。取保藏的植物乳桿菌CGMCC No.13660劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，于29℃培養(yǎng)箱中厭氧過夜培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落，接種于含30mL MRS液體培養(yǎng)基中，29℃靜置厭氧培養(yǎng)18h，8000rpm離心5min，收集菌體。菌體用PBS緩沖液洗滌兩次后，懸浮于3mL含5％蔗糖PBS緩沖液50ml的離心管中，將菌體定為10⁷CFU喂養(yǎng)果蠅，解剖果蠅腸道觀察腸道變化，結(jié)果表明果蠅攝入乳桿菌CGMCC No.13660后壽命顯著改善，腸道組織受損的果蠅數(shù)量顯著減少(圖7)。

實(shí)施例四：植物乳桿菌CGMCC 13660矯正果蠅社交行為

突變果蠅kdm5^k6801/10424的社交行為在攝入萬古霉素后沒有發(fā)生改善(圖5)，而攝入乳桿菌后社交行為有所改善，果蠅間距離呈顯著降低的趨勢(圖8)。

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SEQUENCE LISTING

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<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1501

<212> DNA

<213> 植物乳桿菌L168

<400> 1

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