本發(fā)明涉及一株可用于生物催化不對稱還原3-氯苯乙酮制備高光學純度(R)-3-氯苯乙醇的新菌種——騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604及其應用。

(二)

背景技術：

(R)-3-氯苯乙醇的化學結構式為：

(R)-3-氯苯乙醇是一種重要的手性中間體，是多種藥物分子的構建模塊，例如，它可以用于合成治療脊髓型肌肉萎縮癥的活性化合物(R)-5-[1-(3-氯苯基)乙氧基]喹唑啉-2,4-二胺，還可以用于合成治療抑郁癥、糖尿病和肥胖的β₃-腎上腺素受體激動劑，包括SR58611，Solabegron，CL316243，AJ-9677等。

采用化學法制備(R)-3-氯苯乙醇，需要使用價格昂貴的如銠、釕等金屬催化劑，會對環(huán)境造成污染。采用微生物全細胞催化的生物不對稱還原方法制備(R)-3-氯苯乙醇具有反應條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點。

已有文獻報道，John Thurmond等(J.Med.Chem.2008,51,449–469)利用手性催化劑((S)-MeCBS和(R)-MeCBS)催化還原3-氯苯乙酮制備(R)-3-氯苯乙醇，Perna等(J.of Mol.Catal.B:Enzym.,2016,124:29–37)利用Lactobacillus reuteri靜息細胞催化還原3-氯苯乙酮制備(R)-3-氯苯乙醇，轉化率100％，對映體過量值(ee)>99％，當底物濃度>5g/L時，轉化率低于70％。

(三)

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一株可用于生物催化不對稱還原3-氯苯乙酮制備高光學純度(R)-3-氯苯乙醇的微生物新菌種——騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604，以及該菌種在催化不對稱合成制備(R)-3-氯苯乙醇中的應用。

本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供一株新菌株--騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M 2016541，保藏日期：2016年9月30日，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072。

本發(fā)明還提供一種所述騷動厄斯考維菌ZJPH1604在微生物催化不對稱還原3-氯苯乙酮制備(R)-3-氯苯乙醇中的應用，具體所述應用為：以3-氯苯乙酮為底物，以騷動厄斯考維菌ZJPH1604經發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體細胞為酶源，加入輔助底物，于pH為6.0～9.0的緩沖液中，在25～35℃下進行轉化反應，反應結束后，反應液經分離純化得到(R)-3-氯苯乙醇；所述輔助底物為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、異丙醇、甲醇或乙醇中的一種。

進一步，所述底物3-氯苯乙酮的初始濃度為20～200mmol/L緩沖液(優(yōu)選25-150mmol/L)，騷動厄斯考維菌ZJPH1604濕菌體細胞的添加量以濕重計為50～300g/L緩沖液(優(yōu)選100-300g/L)；所述輔助底物為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖時，加入量為20～300g/L緩沖液(優(yōu)選100-300g/L)，所述輔助底物為甲醇、乙醇或異丙醇時，加入體積為緩沖液體積的10～30％(優(yōu)選20％)。

進一步，所述酶源按如下方法制備：1)斜面培養(yǎng)：將騷動厄斯考維菌ZJPH1604接種至斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1-2天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH 6.5；

2)種子培養(yǎng)：從斜面挑一環(huán)菌體接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)24小時，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母膏4-8g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-4g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，NaCl 0.5-2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，溶劑為水，pH 6.5-8.0；優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶劑為水，pH 6.5；

3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度4-10％(優(yōu)選8％)的接種量將種子液轉接到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，180-220r/min(優(yōu)選200r/min)培養(yǎng)36-48h(優(yōu)選48h)，將發(fā)酵液離心，收集濕菌體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0-6.0g/L，KH₂PO₄ 2.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.6g/L，NaCl 0.2～0.8g/L，溶劑為水，pH 6.0～7.5，優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下：葡萄糖15g/L，酵母膏30g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，KH₂PO₄4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，NaCl 0.4g/L，溶劑為水，pH 6.5。

采用Box-Behnken旋轉中心組合實驗設計法對葡萄糖濃度、酵母膏濃度和KH₂PO₄濃度三個對產酶影響顯著的因素進行優(yōu)化，得到騷動厄斯考維菌(Oerskovia)ZJPH1604。菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20～30g/L，酵母膏10～40g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0-6.0g/L，KH₂PO₄2.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.6g/L，NaCl 0.2～0.8g/L，溶劑為水，pH 6.0～7.5。

騷動厄斯考維菌(Oerskovia)ZJPH1604的培養(yǎng)條件為：初始pH 6.0～7.5，搖瓶裝液量80～120mL/250mL錐形瓶，培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉速180～220rpm，接種量4～10％，培養(yǎng)時間36～48h。

本發(fā)明所述反應液分離純化方法為：反應結束后，將轉化液用等體積乙酸乙酯萃取，經離心后得到上清液，采用手性氣相色譜法分析目的產物和殘留底物的含量，以及產物的光學純度。

本發(fā)明優(yōu)選所述輔助底物為異丙醇，此時所得產物的光學純度和產率最高。

本發(fā)明從土樣中篩選獲得了與以往同類研究報道不同的微生物新菌種，并且催化轉化的底物濃度和產率均較高，從而在研究微生物催化法制備手性中間體(R)-3-氯苯乙醇方面提供了有益的參考。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一株可用于微生物催化不對稱還原3-氯苯乙酮制備(R)-3-氯苯乙醇的微生物新菌種，采用該新菌種催化制備光學純(R)-3-氯苯乙醇具有底物濃度高，立體選擇性好，產物光學純度高等優(yōu)點。本發(fā)明通過采用騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604細胞為催化劑的手性生物催化，當底物濃度為80mmol/L時，目的產物(R)-3-氯苯乙醇的e.e達到99.9％，產率達到98.1％。

(四)附圖說明

圖1為底物標準品氣相色譜圖(含內標十二烷)；

圖2為消旋體產物標準品氣相色譜圖(含內標十二烷)；

圖3為騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604菌株生物還原反應萃取液氣相色譜圖(含內標十二烷)。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

本發(fā)明實施例所述底物，輔助底物及濕菌體的用量均以緩沖液體積計。

實施例1：菌株的篩選及鑒定

菌種來源：騷動厄斯考維菌(Oerskovia turbata)ZJPH1604菌株系從浙江省東錢湖附近的土樣中分離篩選獲得，具體篩選方法如下：

將采集的土樣1g加入到裝有50mL富集培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200rpm，培養(yǎng)5～6d，待培養(yǎng)液變混濁后，取1mL培養(yǎng)液轉接至新鮮的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5～6d，如此重復富集培養(yǎng)3～4次。富集培養(yǎng)基中以3-氯苯乙酮為唯一碳源。富集培養(yǎng)基配方如下：3-氯苯乙酮25mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶劑為水，pH 6.5。

隨后富集培養(yǎng)液經梯度稀釋，涂布到分離平板上(平板培養(yǎng)基組成為富集培養(yǎng)基中加入15-20g/L的瓊脂)，經多次分離培養(yǎng)后獲得單菌落菌株。挑取單菌落菌株接種到種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24小時，再轉接至產酶培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)42小時。以終濃度5mM的3-氯苯乙酮為底物，篩選得到的微生物細胞為催化劑(終濃度100g/L)，在pH 6.5磷酸緩沖液10ml中，30℃生物轉化24h后。轉化結束后，轉化液用等體積乙酸乙酯萃取，經離心后得到上清液采用手性氣相色譜法檢測轉化液中目的產物(R)-3-氯苯乙醇的對映體過量值(e.e.值)和產率。用內標法定量，內標物為十二烷。取1mL萃取液加入1μL十二烷進行分析。氣相色譜條件：日本島津GC-2014氣相色譜儀，浙大N2000色譜工作站；美國瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛細管氣相色譜柱(25m×0.25mm×0.25μm)。載氣為高純氮氣，流量為2mL/min；進樣量1μL，分流比為15:1；檢測器和進樣口溫度均為250℃；色譜柱溫度120～160℃；升溫速度：8℃/min；檢測器為FID。用以上條件對樣品進行檢測，底物的保留時間為4.1min，如圖1；消旋體產物標準品的保留時間，R型產物為6.5min，S型產物為6.7min，如圖2；ZJPH1604菌株轉化產物的保留時間為6.5min，如圖3。內標物十二烷的保留時間為3.0min。

用相對校正因子分別計算出反應液中的底物和產物的濃度。進而求出反應的產率(Yield)。計算式為:

產率＝C_i/C₀×100％

式中C₀、C_i分別為反應起始底物的摩爾濃度和反應結束時產物的摩爾濃度。

產物的光學純度由對映體過量值(enantiomeric excess，e.e.)來表示。

e.e.＝(C_R-C_S)/(C_R+C_S)×100％

式中C_R和C_S分別為R型和S型3-氯苯乙醇的摩爾濃度。

該新菌種的特征如下：

生理生化特征：革蘭氏染色陽性，不生芽孢，不運動，無莢膜，碳水化合物發(fā)酵產酸，不產氣，氧化酶陽性，接觸酶陽性，專性需氧?？梢岳玫奶荚从?9種：糊精、D-麥芽糖、海澡糖、纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、水蘇糖、棉子糖、乳糖、D-密二糖、D-(-)-水楊苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-α-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神經氨(糖)酸、D-半乳糖、甲基雙丙酮、D-巖藻糖、L-巖藻糖、甘氨?；?L-脯氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、L-半乳糖酸內酯、D-葡糖酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎尼酸、葡萄糖二酸、p-甲酚-苯乙酸、丙酮酸甲酯、丙醇酸甲酯、左旋乳酸、檸檬酸、α-酮-戊二酸、D-蘋果酸、鼠李糖、肌苷、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、丙三醇、葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、天門冬氨酸、D-絲氨酸、左旋蘋果酸、溴代琥珀酸、α-氨基丁酸、α-羥基異丁酸、α-羥基-D,L-丁酸、α-酮丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸。

菌種的16S rDNA序列特性：以提取到的細胞總DNA為模板，利用通用引物P1和P2擴增菌株的16S rDNA基因，再將PCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳。經測序確認所述菌株ZJPH1604的16S rDNA基因序列(SEQ ID NO.1)已提交GenBank(GenBank登錄號為No.KY302675)，將ZJPH1604菌株的16S rRNA序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行同源性比對(BLAST)，結果表明：ZJPH1604菌株與騷動厄斯考維菌(Oerskovia sp.)的部分菌株序列同源性較高。ZJPH1604菌株與Oerskovia菌株(GenBank登錄號為No.HM563054.1)的序列同源性達到99％。

根據生理生化特性并結合分子生物學鑒定，該菌株被鑒定為厄斯考維菌(Oerskovia sp.)，命名為騷動厄斯考維菌(Oerskovia sp.)ZJPH1604，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072；保藏編號：CCTCC NO：M 2016541，保藏日期：2016年9月30日。

實施例2：濕菌體細胞的獲得

種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄2g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶劑為水，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖15g/L，酵母膏30g/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 4g/L，NaCl 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L，溶劑為磷酸鹽緩沖液，pH 6.5。

斜面培養(yǎng)：將騷動厄斯考維菌ZJPH1604接種至斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)1-2天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH 6.5；

從斜面挑一環(huán)菌體接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200rpm培養(yǎng)24小時得種子液，再以體積濃度8％的接種量將種子液轉接到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200rpm培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后發(fā)酵液離心，沉淀用pH值6.5的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，收集濕菌體細胞，備用。

實施例3：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，濕菌體以濕重計濃度為100g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入占緩沖液體積10％的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為17.8mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率70.9％。

實施例4：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，濕菌體以濕重計濃度為100g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入占緩沖液體積10％的異丙醇作為輔助底物，置于37℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為16.8mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率67.3％。

實施例5

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，濕菌體以濕重計濃度為200g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入占緩沖液體積10％的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為19.2mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率76.7％。

實施例6：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，濕菌體以濕重計濃度為200g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入占緩沖液體積10％的異丙醇作為輔助底物，置于37℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為20.4mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率88.8％。

實施例7：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，濕菌體以濕重計濃度為150g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入300g/L的葡萄糖作為輔助底物，置于37℃，200r/min的搖床中反應48h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為3.4mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率13.7％。

實施例8：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于15mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，濕菌體以濕重計濃度為200g/L緩沖液；加入80mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入占緩沖液體積20％的異丙醇作為輔助底物，置于37℃，200r/min的搖床中反應48h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為78.5mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率98.1％。

實施例9：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，濕菌體以濕重計濃度為100g/L緩沖液；加入35mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入100g/L緩沖液的葡萄糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為7.7mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率22.2％。

實施例10：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于20mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，濕菌體以濕重計濃度為200g/L緩沖液；加入35mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入2mL(占緩沖液體積10％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于37℃，200r/min的搖床中反應48h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為34.6mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率99％。

實施例11：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，濕菌體以濕重計濃度為300g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入1mL(占緩沖液體積10％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為19.9mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率79.7％。

實施例12

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，濕菌體以濕重計濃度為200g/L緩沖液；加入150mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入2mL(占緩沖液體積20％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應24h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為98.1mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率65.4％。

實施例13

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中，濕菌體以濕重計濃度為250g/L緩沖液；加入150mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入2mL(占緩沖液體積20％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應36h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為121.8mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率71.2％。

實施例14：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，濕菌體以濕重計濃度為100g/L緩沖液；加入25mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入2.5mL(占緩沖液體積20％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應48h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為11.2mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率44.1％。

實施例15：

將實施例2所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH 9.0)中，濕菌體以濕重計濃度為100g/L緩沖液；加入35mmol/L緩沖液的3-氯苯乙酮作為底物，再加入2mL(占緩沖液體積20％，v/v)的異丙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應48h。采用實施例1的檢測方法，產物(R)-3-氯苯乙醇的濃度為34.6mmol/L，光學純度ee值99.9％，產率99.1％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江醫(yī)藥高等?？茖W校；浙江工業(yè)大學

<120> 一種騷動厄斯考維菌及在制備(R)-3-氯苯乙醇中的應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213> Oerskovia turbata

<400> 1

gatcactggg gaacgggtga gtaacacgtg agtaacctgc cccagactcc gggataagcc 60

ttggaaacga ggtctaatac tggatatgag atgcccctgc atggggagtg tctggaaaga 120

tttatcggtc tgggatggac tcgcggccta tcagcttgtt ggtggggtaa tggcctacca 180

aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc 240

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca 300

gcgacgccgc gtgagggatg aaggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag 360

cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 420

tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggtttgt 480

cgcgtctggt gtgaaaactc aaggctcaac cttgagcttg catcgggtac gggcagacta 540

gagtgcggta ggggtgactg gaattcctgg tgtagcggtg gaatgcgcag atatcaggag 600

gaacaccgat ggcgaaggca ggtctctggg ccgcaactga cgctgaggag cgaaagcatg 660

gggagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgttggg cactaggtgt 720

ggggctcatt ccacgagttc cgtgccgcag caaacgcatt aagtgccccg cctggggagt 780

acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg 840

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