本發(fā)明涉及微生物分離提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法。

背景技術(shù)：

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)普遍增多，腸道等疾病的治愈難度增加，新抗生素的研發(fā)成本及其新的耐藥菌株增加等副作用，研究人員再次把目光投向了用提取健康人的腸道菌群來重建因腸道菌群失調(diào)引起的腸道等疾病。目前，研究者們都將重心放在了腸道菌群臨床治療疾病的種類和療效上，而對于腸道菌群的制備，卻往往采用簡陋的方法，例如，先采用普通的塑料盒、塑料袋采樣，后用普通均質(zhì)機均質(zhì)糞便，然后再離心或者篩網(wǎng)過濾等等。采用這些簡陋的方法而制備的腸道菌群液雜質(zhì)和色素多、感官差；其制備過程中使用的開放性器皿容易受污染和交叉污染，其制備操作也給工作人員帶來了感官及心理的強烈負(fù)面沖擊而引起不適。因此，采用簡陋的方法來分離提取制備腸道菌群液，無論是其操作過程，還是制作產(chǎn)品的品質(zhì)方面，都嚴(yán)重地影響了醫(yī)務(wù)工作者的應(yīng)用和病人對該項目的接受度，阻礙和延緩了腸道菌群液在臨床上的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法，該方法能減少腸道菌群液制備過程中的污染問題，避免工作人員在制備過程中的不適感，也能保證產(chǎn)品具有更優(yōu)異的品質(zhì)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法，其特征在于，它依次包括有以下步驟：1）采樣；2）均質(zhì)過濾；3）離心分離洗滌；所述步驟3），先采用稀釋液洗滌，后于轉(zhuǎn)速為7000～15000rpm條件下離心，每次離心5～25分鐘，洗滌離心1～5次。

進一步優(yōu)選地，上述離心分離洗滌的次數(shù)為4次。

為除去分離液中可能存在的寄生蟲卵，上述從健康人體糞便中分離腸道菌群的方法，還包括有過濾操作，且過濾操作在離心分離洗滌的操作前后或過程中進行。所述過濾操作選用分級過濾器進行；所述分級過濾器中過濾網(wǎng)的孔徑從大到小在0.2mm～0.04mm范圍內(nèi)設(shè)置。

作為進一步明確，上述均質(zhì)過濾步驟，采用均質(zhì)過濾袋和拍打式均質(zhì)器；所述均質(zhì)過濾袋的內(nèi)部有濾膜夾層。為實現(xiàn)更有效除去糞便中的色素、雜質(zhì)和異味，該濾膜夾層上的濾膜孔孔徑大小為0.1mm～0.45mm。進一步優(yōu)選地，所述濾膜夾層上的濾膜孔孔徑大小為0.1～0.25mm。

為進一步避免采用過程中樣品的污染和損失，簡化采樣操作，避免環(huán)境污染，減少操作人員處理樣品的不適感，上述步驟1），采用專用的雙層采樣袋；所述雙層采樣袋為內(nèi)、外兩層，其袋體上部設(shè)有撕口；所述內(nèi)層的下部向上折疊，且底端固定在內(nèi)層的一側(cè)外壁上；所述內(nèi)層的下部上設(shè)有一撕口。

作為進一步優(yōu)化，上述從人體糞便中分離腸道菌群的方法，依次包括有以下步驟：

1）無菌采樣

采用雙層采樣袋取樣；所述雙層采樣袋為內(nèi)、外兩層，其袋體上部設(shè)有撕口；所述內(nèi)層的下部向上折疊，且底端固定在內(nèi)層的一側(cè)外壁上；所述內(nèi)層的下部上設(shè)有一撕口。

2）拍打均質(zhì)過濾

將上述雙層采樣袋上的撕口撕開，棄去外層，將內(nèi)層放入無菌均質(zhì)過濾袋中，撕開內(nèi)層下部上的撕口，糞便樣品直接從撕口形成的通道中進入均質(zhì)過濾袋；所述均質(zhì)過濾袋的內(nèi)部有濾膜夾層，袋口處設(shè)置有封口條；該濾膜夾層上的濾膜孔孔徑大小為0.1mm～0.45mm；之后加入稀釋液，稀釋液為無菌水或生理鹽水，或者其它滅菌液體，最后再采用拍打式均質(zhì)器均質(zhì)，樣品粉碎均質(zhì)過濾后，制得均質(zhì)過濾液；

3）離心分離洗滌

將上述均質(zhì)過濾液用稀釋液，于3～8℃下低溫離心分離洗滌1～5次，以獲取中間菌液層，即可得到不同感官需求的腸道菌群液；其離心轉(zhuǎn)速7000～15000rpm，每次5～20分鐘；

4）過濾

該步驟4）可在離心分離洗滌的操作前后或過程中進行，采用分級過濾器進行，濾除腸道菌群液中可能存在的寄生蟲卵；所述分級過濾器中過濾網(wǎng)的孔徑從大到小在0.2mm～0.04mm范圍內(nèi)設(shè)置。

更具體來說，上述從人體糞便中分離腸道菌群的方法，依次包括有以下步驟：

1）無菌采樣

采用上述雙層采樣袋取樣，取樣后封口，在冷藏環(huán)境下2小時內(nèi)送往實驗室；

2）無菌加樣

將上述雙層采樣袋上的撕口撕開，棄去外層，將內(nèi)層放入無菌均質(zhì)過濾袋中，撕開內(nèi)層下部上的撕口，糞便樣品直接從撕口形成的通道中進入均質(zhì)過濾袋，避免了樣品的飛濺；所述均質(zhì)過濾袋的內(nèi)部有濾膜夾層，袋口處設(shè)置有封口條；該濾膜夾層上的濾膜孔孔徑大小為0.1mm～0.25mm；

3）加稀釋液

加入無菌稀釋液，稀釋液可為無菌水或滅菌的0.9%生理鹽水，或者其它滅菌液體，其加液量為樣品重量的2～10倍；

4）拍打均質(zhì)過濾

采用拍打式均質(zhì)器均質(zhì)10秒～600秒，樣品粉碎均質(zhì)過濾后，制得均質(zhì)過濾液；

5）離心分離洗滌

將上述均質(zhì)過濾液用無菌稀釋液，于3～8℃下低溫離心分離洗滌3～4次，以獲取中間菌液層，即可制得不同感官需求的腸道菌群液；其離心轉(zhuǎn)速7000～15000rpm，每次5～20分鐘；

6）過濾

該步驟6）在離心分離洗滌的操作前后或過程中進行，采用分級過濾器進行，濾除分離液中可能存在的寄生蟲卵，所述分級過濾器中過濾網(wǎng)的孔徑從大到小在0.2mm～0.04mm范圍內(nèi)設(shè)置，制得更純化的腸道菌群液；

7）無菌分裝

根據(jù)需要量，將腸道菌群液分裝至包裝瓶中。

為保證產(chǎn)品質(zhì)量，上述的各個步驟都在生物安全柜里進行，所有的操作步驟都是無菌操作，所有的分裝或者吸取的工具都是無菌的。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明方法采用專用的雙層采樣袋取樣，從源頭上減少了污染幾率和樣品損失，減少了操作中的不適感，避免了對環(huán)境的污染。

2、其在無菌均質(zhì)過濾袋中一次性完成了均質(zhì)和過濾過程，既有效避免了在開放的均質(zhì)機中均質(zhì)、在開放的篩網(wǎng)中過濾所造成的污染，以及使用共同容器所造成的樣品間的交叉污染，又簡化了操作流程，縮短了提取時間，保證了提取過程中微生物菌群的生態(tài)與活性。

3、其離心分離洗滌步驟中，同時棄去了離心管中清澈透明，且在顯微鏡下觀察每視野極少細(xì)菌的上清液（主要為水溶性雜質(zhì)）和下層固體雜質(zhì)，而將呈白色且稀釋10倍后顯微鏡下觀察每視野細(xì)菌多至無法計數(shù)的中間層菌層保留，既高效地分離提取了腸道菌群，還有效除去了糞便中的色素、雜質(zhì)、異味，降低了腸道菌群液的粘度和粒度，減少了腸道菌群液因為糞便的色素、雜質(zhì)和臭味而引起的不適感，其分離提取效果好；其過濾步驟則有效地除去了腸道菌群液中的寄生蟲卵。

4、采用本發(fā)明方法制得的腸道菌群液半透明且均勻，無異味，無雜質(zhì)顆粒，不堵塞糞菌移取管道。適用于從糞便中分離腸道菌群液、糞便微生物的分離提取、糞便微生物的分析檢測等標(biāo)準(zhǔn)化和批量化的制備過程。

附圖說明

圖1為實施例1中所述雙層采樣袋的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為圖1中所述雙層采樣袋撕去外層并經(jīng)展開后的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為實施例1中所述均質(zhì)過濾袋的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為圖3中所述均質(zhì)過濾袋的俯視圖。

圖5為實施例2中所述雙層采樣袋的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖6為圖5中所述雙層采樣袋除去外層并經(jīng)展開后的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行具體描述，在此指出以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。

實施例 1

一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法，它具體按照以下步驟進行：

1）無菌采樣

采用經(jīng)滅菌的雙層采樣袋取樣，如圖1和2所示，該雙層采樣袋1為內(nèi)、外兩層2、3，且袋體上部設(shè)有一撕口4；其內(nèi)層2設(shè)置為上端面面積大于下端面面積的圓臺體，該內(nèi)層2的下部向上折疊，且底端9固定在內(nèi)層2的一側(cè)外壁上；其內(nèi)層2的下部上也設(shè)有一撕口4；該雙層采樣袋1的袋體上部設(shè)有封口條5和撕拉口6，且撕拉口6位于封口條5的上部；采樣操作為：撕開采樣袋的撕拉口6，取樣后經(jīng)封口條5實現(xiàn)封口，在冷藏環(huán)境下2小時內(nèi)送往實驗室；

2）無菌加樣

將雙層采樣袋上的撕口4撕開，棄去外層3，將內(nèi)層2放入無菌均質(zhì)過濾袋7中，撕開內(nèi)層2下部上的撕口4，糞便樣品直接從撕口4形成的通道中進入均質(zhì)過濾袋7，避免了樣品的飛濺；如圖3和4所示，該均質(zhì)過濾袋7內(nèi)部有一濾膜夾層8，袋口處設(shè)置有封口條5；該濾膜夾層8的兩端和低端均固定于均質(zhì)過濾袋7的袋體上，且濾膜夾層8上的濾膜孔孔徑大小為0.40mm；

3）稱量

稱量均質(zhì)過濾袋的總重，經(jīng)扣除預(yù)先稱量的均質(zhì)過濾袋的自重，即為所采糞便樣品的重量，得到糞便100克；

4）加稀釋液

加入無菌的生理鹽水300ml，將均質(zhì)過濾袋封口；

5）拍打均質(zhì)過濾

采用拍打式均質(zhì)器拍打均質(zhì)120秒，從均質(zhì)過濾袋的過濾膜層吸出濾液并分裝到4個滅菌離心管，每管100ml；

6）離心分離洗滌和過濾

將步驟5）所得的裝有濾液的滅菌離心管，于5℃下低溫條件下分別離心10分鐘，轉(zhuǎn)速7000rmp；經(jīng)離心分離后，離心管中的上清液清澈透明，顯微鏡下觀察每視野極少細(xì)菌，主要為水溶性雜質(zhì)，棄去；中間層呈白色，為菌層，稀釋10倍后顯微鏡下觀察每視野細(xì)菌多至無法計數(shù)，保留；下層為固體雜質(zhì)，棄去；離心后將中間細(xì)菌層取出放入下另一離心管，該離心管口放置一個孔徑為0.15mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；再次離心這4個滅菌離心管，每管100ml，離心10分鐘，轉(zhuǎn)速8000rmp，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，該離心管口放置一個孔徑為0.1mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；再一次離心這4個滅菌離心管，每管100ml，離心10分鐘，轉(zhuǎn)速8000rmp，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，該離心管口放置一個孔徑0.075mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；

7）包裝成品

將經(jīng)步驟6）所得的4個離心管中的菌群合并入一個容量為500ml的包裝瓶，即得到100g糞便的腸道菌群稀釋液400ml。

實施例 2

一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法，它具體按照以下步驟進行：

1）無菌采樣

采用經(jīng)滅菌的雙層采樣袋取樣，如圖5和6所示，該雙層采樣袋1為內(nèi)、外兩層2、3，且袋體上部設(shè)有一撕口4；其內(nèi)層2設(shè)置為倒錐體，該內(nèi)層2的下部向上折疊，且底端9固定在內(nèi)層2的一側(cè)外壁上；其內(nèi)層2的下部上也設(shè)有一撕口4；采樣操作為：采用該雙層采樣袋1直接取樣；

2）無菌加樣

將雙層采樣袋袋體上部的撕口4撕開，棄去外層3，將內(nèi)層2放入無菌均質(zhì)過濾袋7中，撕開內(nèi)層2下部上的撕口4，糞便樣品直接從撕口4形成的通道中進入均質(zhì)過濾袋；該均質(zhì)過濾袋的結(jié)構(gòu)與實施例1中所述的均質(zhì)過濾袋7的結(jié)構(gòu)相近，其不同之處僅在于，本例中的濾膜夾層8的中部沿著袋口至袋底方向固定在均質(zhì)過濾袋7的一側(cè)袋體上，即分隔出了兩個并排分布的過濾區(qū)域，且濾膜夾層8上的濾膜孔孔徑大小為0.40mm；

3）稱量

稱量均質(zhì)過濾袋的總重，經(jīng)扣除預(yù)先稱量的均質(zhì)過濾袋的自重，即為所采糞便樣品的重量，得到糞便100克；

4）加稀釋液

加入無菌的生理鹽水400ml，將均質(zhì)過濾袋封口；

5）拍打均質(zhì)過濾

采用拍打式均質(zhì)器拍打均質(zhì)240秒，從均質(zhì)過濾袋的過濾膜層吸出濾液并分裝到5個滅菌離心管，每管100ml；另取1個100ml離心管,加稀釋液100,作為平衡；

6）離心分離洗滌和過濾

將步驟5）所得的裝有濾液的滅菌離心管，于3℃下條件下分別離心20分鐘，轉(zhuǎn)速10000rmp；經(jīng)離心分離后，離心管中的上清液清澈透明，顯微鏡下觀察每視野極少細(xì)菌，主要為水溶性雜質(zhì)，棄去；中間層呈白色，為菌層，稀釋10倍后顯微鏡下觀察每視野細(xì)菌多至無法計數(shù)，保留；下層為固體雜質(zhì)，棄去；離心后將中間細(xì)菌層取出放入下另一離心管，該離心管口放置一個孔徑為0.20mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；再次離心這5個滅菌離心管，每管100ml，離心15分鐘，轉(zhuǎn)速11000rmp，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，該離心管口放置一個孔徑為0.08mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；再一次離心這5個滅菌離心管，每管100ml，離心10分鐘，轉(zhuǎn)速15000rmp，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，該離心管口放置一個孔徑0.05mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；

7）包裝成品

將經(jīng)步驟6）所得的5個離心管中的菌群合并入一個容量為500ml的包裝瓶，即得到100g糞便的腸道菌群稀釋液500ml。

實施例 3

一種從人體糞便中分離腸道菌群的方法，它具體按照以下步驟進行：

1）無菌采樣

采用滅菌塑料袋或塑料盒直接采集糞便；

2）無菌加樣

將塑料袋或塑料盒的出料口用消毒液滅菌后，打開均質(zhì)過濾袋，將糞便倒入均質(zhì)過濾袋中；該均質(zhì)過濾袋的結(jié)構(gòu)與實施例1中的均質(zhì)過濾袋7相近，其差別僅在于本例中其濾膜夾層8上的濾膜孔徑大小則為0.20mm；

3）稱量

稱量均質(zhì)過濾袋的總重，經(jīng)扣除預(yù)先稱量的均質(zhì)過濾袋的自重，即為所采糞便樣品的重量，得到糞便100克；

4）加稀釋液

加入無菌水300ml，將均質(zhì)過濾袋封口；

5）拍打均質(zhì)過濾

采用拍打式均質(zhì)器拍打均質(zhì)240秒，從均質(zhì)過濾袋的過濾膜層吸出濾液并分裝到4個滅菌離心管，每管100ml；

6）離心分離洗滌和過濾

將步驟5）所得的裝有濾液的滅菌離心管，于5℃下條件下分別離心15分鐘，轉(zhuǎn)速15000rmp；經(jīng)離心分離后，離心管中的上清液清澈透明，顯微鏡下觀察每視野極少細(xì)菌，主要為水溶性雜質(zhì)，棄去；中間層呈白色，為菌層，稀釋10倍后顯微鏡下觀察每視野細(xì)菌多至無法計數(shù)，保留；下層為固體雜質(zhì)，棄去；離心后吸棄上清液；加滅菌0.9%生理鹽水95ml，分3次將中間菌層洗滌溶解；再次離心15分鐘，轉(zhuǎn)速15000rmp，分3次加滅菌0.9%生理鹽水95ml將中間菌層洗滌溶解后，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，該離心管口放置一個孔徑為0.10mm的濾網(wǎng)，加滅菌生理鹽水95ml，使中間菌層洗滌溶解過濾進入離心管內(nèi)；再次離心離心15分鐘，轉(zhuǎn)速11000rmp，離心后將中間細(xì)菌層取出放入下一個離心管，在合并前用濾網(wǎng)0.75mm過濾后,再倒入保存瓶。

7）分裝成品

分別將每2管的上述離心管加入1個保存瓶，再向每個保存瓶中補充100ml滅菌0.9%生理鹽水，即得每個保存瓶中腸道菌群液總量為300ml，含50克糞便中的腸道菌液。