本發(fā)明涉及桑黃，特別涉及一種桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)方法。

（二）

背景技術(shù)：

藥用真菌桑黃具有抗癌、抗氧化、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血脂和抗病毒等作用 ，在傳統(tǒng)中藥中，其被用于治療傷口、腹痛和淋病。最近的研究強(qiáng)調(diào)了其抗癌和肝臟保護(hù)功能。其含有三萜、黃酮、多糖等活性成分。

當(dāng)前，桑黃產(chǎn)品大部分依賴(lài)于桑黃子實(shí)體，桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境的依賴(lài)性很高，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量不穩(wěn)定。利用液體培養(yǎng)可以較容易地對(duì)各種生長(zhǎng)影響因素進(jìn)行控制和優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)。有研究報(bào)道：利用液體培養(yǎng)基（土豆/葡萄糖肉湯24%，麥芽提取物10%，蛋白胨1%）獲得的菌絲體產(chǎn)量為1.42 g / 100mL，這種培養(yǎng)基缺乏礦物質(zhì)元素，不利于菌絲體的生長(zhǎng)。另有研究指出使用液體培養(yǎng)基（玉米粉50 g/ L，麥麩50 g /L，KH₂PO₄ 2 g/ L，MgSO₄ 1 g /L，維生素B1 300μg / L和維生素B2 400μg / L）獲得菌絲體產(chǎn)量為0.356 g / 100mL，這個(gè)配方含氮量較低，不利于菌絲體的生長(zhǎng)，另外，維生素的使用會(huì)增加其生產(chǎn)成本。

對(duì)桑黃的液體培養(yǎng)，目前技術(shù)顯示，普遍產(chǎn)量較低，或者原料成本較高。為了獲得穩(wěn)定的液體發(fā)酵高產(chǎn)，同時(shí)降低成本，本專(zhuān)利進(jìn)行了桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

本研究旨在利用成本較低的農(nóng)產(chǎn)品下腳料和礦物質(zhì)成分，對(duì)它們進(jìn)行適宜的配比，利用合適的方法進(jìn)行煮制，采用10L的發(fā)酵罐在一定條件下進(jìn)行桑黃的液體培養(yǎng)，以獲得桑黃液體培養(yǎng)產(chǎn)物（菌絲體及活性物質(zhì)產(chǎn)量）的高產(chǎn)。本研究結(jié)果會(huì)對(duì)桑黃的擴(kuò)大生產(chǎn)及工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

（三）

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)方法，原料易得，產(chǎn)量高。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）配制培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基由以下重量的原料制成：麥麩6-8%，玉米粉2-4%，蛋白胨1-3%，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15%，KH₂PO₄ 0.10-0.15%，K₂HPO₄·3H₂O 0.02-0.04%，其余為水，

配制方法：麥麩放入足量的水中，煮沸45-55min，四層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O，調(diào)pH值為6，配制6000mL培養(yǎng)基；

（2）裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐；

（3）滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到105-115℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃-124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫滅菌；

（4）接種：火焰圈保護(hù)接種，向滅菌后的培養(yǎng)基中接入處于迅速生長(zhǎng)期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種；

（5）培養(yǎng)：T為28±0.5℃；罐壓為0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz。

發(fā)酵罐電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤(pán)直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴試噴管。

步驟（3）中，保溫20min滅菌。

步驟（4）中，向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長(zhǎng)期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

培養(yǎng)第10天，菌濃達(dá)到最大，為30%，菌絲體產(chǎn)量最高，為4.6217g/100mL（46.217mg/mL）。 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Kim DH等的菌絲體產(chǎn)量1.42 g / 100mL和李翠翠等的菌絲體產(chǎn)量0.356 g / 100mL。

培養(yǎng)第10天，胞外黃酮產(chǎn)量達(dá)到最大，為16.198mg/mL。

培養(yǎng)第5天，胞外三萜類(lèi)化合物產(chǎn)量達(dá)到最大，為5.736mg/mL。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明原料選取方便，成本低，利用研究所得配方可以獲得桑黃菌絲體及胞外活性物質(zhì)的高產(chǎn)。菌絲體產(chǎn)量達(dá)到4.6217g/100mL（46.217mg/mL）。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Kim DH等的菌絲體產(chǎn)量1.42 g / 100mL和李翠翠等的菌絲體產(chǎn)量0.356 g / 100mL。胞外黃酮產(chǎn)量達(dá)到16.198mg/mL。胞外三萜類(lèi)化合物產(chǎn)量達(dá)到5.736mg/mL。

（四）具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，KH₂PO₄ 0.12%，K₂HPO₄·3H₂O 0.03% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸50min，四層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O，調(diào)pH值為6）配制6000mL培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤(pán)直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長(zhǎng)期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開(kāi)始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

實(shí)施例2

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩6%，玉米粉4%，蛋白胨3%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KH₂PO₄ 0.10%，K₂HPO₄·3H₂O 0.04% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸55min，四層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O）配制6000mL培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤(pán)直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長(zhǎng)期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開(kāi)始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

實(shí)施例3

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩8%，玉米粉2%，蛋白胨1%，MgSO₄·7H₂O 0.15%，KH₂PO₄ 0.13%，K₂HPO₄·3H₂O0.02% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸45min，四層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O）配制6000mL培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤(pán)直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長(zhǎng)期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開(kāi)始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

需要說(shuō)明的是，雖然本發(fā)明已將較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明方法。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方案范圍的情況下，都可以利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此未脫離本發(fā)明方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均應(yīng)落在本發(fā)明方案保護(hù)的范圍內(nèi)。