本發(fā)明涉及微流控芯片制備的領(lǐng)域，具體涉及一種可視化Transwell芯片及其制備方法。

背景技術(shù)：

Transwell實驗技術(shù)，傳統(tǒng)方法是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。但Transwell實驗因為中間膜材料的性質(zhì)限制，無法直接觀察下層的現(xiàn)象，只能通過熒光進行觀察，限制了它的應(yīng)用。

微流控芯片實驗室又稱芯片實驗室或微流控芯片，指的是把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測、細胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實驗室的各種功能的一種技術(shù)。微流控芯片技術(shù)作為一門迅速發(fā)展起來的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢，更因其同細胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設(shè)計實現(xiàn)多種細胞功能研究等特點而成為新一代生物仿生和細胞研究的重要平臺。但微流控芯片又難以實現(xiàn)Transwell實驗的功能，在藥物代謝、細胞侵襲等研究中受到了極大的限制。

目前，還沒有可以直接實時觀察Transwell小室下方現(xiàn)象的方法，利用可視化的Transwell芯片進行相關(guān)研究分析，還處于空白階段，如能實現(xiàn)在生物學(xué)研 究及醫(yī)藥研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可視化Transwell芯片及其制備方法，制得的微流控芯片同時具有Transwell小室和微流控芯片的功能優(yōu)勢，可以直接觀察底層芯片，可應(yīng)用于藥物代謝、細胞侵襲等生物學(xué)研究。

本發(fā)明提供了一種可視化Transwell芯片，該微流控芯片主要由有視窗的頂層芯片、多孔濾膜、底層芯片組成。

所述頂層芯片設(shè)計有視窗，視窗位置可以在多孔濾膜區(qū)域里，也可在多孔濾膜區(qū)域外。

可以通過視窗對底層芯片進行實時觀察。

一種可視化Transwell芯片的制備方法，按照以下步驟進行：多孔濾膜通過不可逆封接頂層芯片的下表面，多孔濾膜通過PDMS粘合下連底層芯片的上表面。

所述芯片材料為可透光透氣的PDMS聚合物，PDMS單體與引發(fā)劑比例為5:1，多孔濾膜材料為聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔徑為0.01um-10um。

所述微流控芯片的頂層芯片的下表面和多孔濾膜為不可逆封接，底層芯片的上表面和多孔濾膜為PDMS粘合。

所述不可逆封接方法為紫外活化1小時，硅烷化處理30分，氧等離子封接。

所述PDMS粘合方法為使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚，芯片上表面蘸取PDMS后，與已不可逆封接有上層芯片的多孔濾膜對齊封接，放入80度烘箱，加熱30分鐘。

所述視窗位置在多孔濾膜里時，視窗為柱形結(jié)構(gòu)，較視窗面積略小去除視窗位置的多孔濾膜，使用PDMS將視窗柱與多孔濾膜粘合。

所述視窗位置在多孔濾膜區(qū)域外時，下層芯片通道結(jié)構(gòu)試劑應(yīng)延長至多孔濾膜區(qū)域外，與視窗位置重合。

本發(fā)明提供的基于微流控技術(shù)的Transwell芯片，可在不同層芯片根據(jù)實驗設(shè)計接種不同細胞。

本發(fā)明的該微流控芯片同時具有Transwell小室和微流控芯片的功能，通過視窗可以直接觀察底層芯片，可應(yīng)用于藥物代謝、細胞侵襲等生物學(xué)研究。

附圖說明

圖1本發(fā)明微流控芯片a的示意圖，左邊為實物圖，右邊為剖面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明微流控芯片b的示意圖，左邊為實物圖，右邊為剖面結(jié)構(gòu)示意圖；

1頂層芯片，2多孔濾膜，3底層芯片，4觀察窗，5觀察區(qū),6底層芯片通道，7頂層芯片通道。,

圖3本發(fā)明微流控芯片顯微鏡下細胞觀察圖，(a)觀察區(qū)的明場照片，(b)通過觀察區(qū)對底層芯片中的細胞的明場照片。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實施例1

可視化芯片制作

由于頂層芯片1和底層芯片3為透明的PDMS芯片，而多孔濾膜2是不透明的，所以取多孔濾膜2在預(yù)定的位置處進行打孔作為觀察窗4，以便從多孔濾膜2的觀察窗4處觀察底層芯片通道6中的細胞狀態(tài)。將多孔濾膜2置于玻璃片上進行紫外活化1小時，然后，用硅烷化處理30分鐘，多孔濾膜2與頂層芯 片1一同進行不可逆的氧等離子封接后，置于80度烘箱中加熱30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，將底層芯片3的上表面進行氧等離子的處理后，蘸取薄PDMS，與封接有頂層芯片1的多孔濾膜2對齊粘合，置于80度烘箱中加熱，30分鐘固化完全。將封接好的芯片從烘箱中拿出后，切成需要的尺寸，如圖2所示。

實施例2

可視化芯片制作

由于頂層芯片1和底層芯片3為透明的PDMS芯片，而多孔濾膜2是不透明的，為了觀察底層芯片通道6中的細胞狀態(tài)，將多孔濾膜2在預(yù)定的位置處切除，作為觀察區(qū)5。將多孔濾膜2切成合適的尺寸后，置于玻璃片上紫外活化1小時，用硅烷化處理30分鐘，與頂層芯片1一同進行氧等離子封接，置于80度烘箱中加熱30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，將底層芯片3的上表面進行氧等離子的處理后，蘸取薄PDMS，與封接有頂層芯片1的多孔濾膜2對齊粘合，置于80度烘箱中加熱，30分鐘固化完全。將封接好的芯片從烘箱中拿出后，切成需要的尺寸。如圖1所示。

實施例3

可視化芯片應(yīng)用

將芯片放在培養(yǎng)皿中，紫外滅菌2h，用移液槍分別從底層芯片通道6和頂層芯片通道7入口處加入細胞培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基充滿整個底層芯片通道6和頂層芯片通道7。將培養(yǎng)瓶中的HePG2細胞用胰酶進行消化，細胞從壁上脫落后，終止消化，將培養(yǎng)瓶中的細胞懸液吸入離心管中進行離心，離心后，吸走上清液扔掉，加入新的培養(yǎng)基使細胞重懸，用移液槍吸取細胞懸液，從底層芯片通 道6入口處加入，從液體出口處吸走對應(yīng)體積的培養(yǎng)基，進行置換，重復(fù)三次后，可認為底層芯片通道6中已充滿細胞懸液，在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基，減少芯片中培養(yǎng)基的揮發(fā)。將培養(yǎng)皿放在37℃的培養(yǎng)箱中保持靜止，使細胞貼壁。12h后將培養(yǎng)皿拿出，在顯微鏡下通過觀察區(qū)5觀察的細胞狀態(tài)，并拍照，如圖3所示。