本發(fā)明屬于快速檢測領(lǐng)域,涉及微生物檢測技術(shù),具體涉及一種快速檢測大腸菌群的測試片,以及該測試片制備方法、檢測方法。
背景技術(shù):
大腸菌群分布較廣,在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調(diào)查研究表明,大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)?;顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方,人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主,而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。
目前國內(nèi)進(jìn)出口食品中大腸菌群檢測方法主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國標(biāo)和行標(biāo)兩個方法在檢測程序上略有不同,國標(biāo)法具體操作參見GB 4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》,行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法具體操作參見SN0169-92《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》,這兩種檢測方法具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的特點,是經(jīng)典的微生物檢測和鑒定方法,但是這兩種方法耗時長、培養(yǎng)基需要現(xiàn)配置,操作步驟繁瑣,難以滿足快速檢測的實際需求。
紙片法的出現(xiàn),彌補(bǔ)了國標(biāo)方法檢測的缺點,逐步成為微生物檢測和鑒定的主要方法和標(biāo)準(zhǔn),2007年,PetrifilmTM測試片被正式列為中國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),該方法正逐漸被越來越多的食品生產(chǎn)加工企業(yè)及各類檢測機(jī)構(gòu)所認(rèn)可。目前,國內(nèi)長沙市宇馳檢測技術(shù)有限公司2014年09月17日公開了一項授權(quán)公開號為CN203833945U,名稱為大腸菌群和/或大腸菌群測試片的實用新型專利,該專利采用位于底片上的印有方格的無紡布層,位于無紡布層上的培養(yǎng)基和含有葡萄糖苷酶指示劑的蓋膜,該實用新型專利技術(shù)存在目標(biāo)菌落在無紡布上擴(kuò)散生長菌落邊緣模糊,影響檢測結(jié)果判讀的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的大腸菌群測試片存在的目標(biāo)菌落在無紡布上擴(kuò)散生長,菌落邊緣模糊,結(jié)果判讀不準(zhǔn)的問題,本發(fā)明提供了一種快速檢測大腸菌群的測試片及其制備方法、檢測方法。
技術(shù)方案:
一種快速檢測大腸菌群的測試片,包括下層底板4,珍珠紙2,上層薄膜組件1和大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基,所述珍珠紙2中間具有圓形凹槽3,所述下層底板4、珍珠紙2、上層薄膜組件1通過不干膠粘貼,所述圓形凹槽3內(nèi)均勻分布有大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基。
所述大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基每100mL含有胰蛋白胨1.0~3.0g、氯化鈉0.1~1.0g、乳糖1.5~3.5g、膽鹽0.1~0.4g、酵母膏粉0.2~1.0g、磷酸氫二鉀0.15~0.5g、磷酸二氫鉀0.15~0.5g、冷水可溶性凝膠0.5~2g,抑菌劑混合物150~500IU/mL、顯色酶解底物混合劑0.02~0.05g。
所述顯色酶解底物混合劑由5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、3-吲哚基-beta-D-吡喃半乳糖苷按重量比2:1:1混合組成。
所述抑菌劑混合物為膽鹽與結(jié)晶紫的混合物,膽鹽:結(jié)晶紫重量比為80:1。
所述的測試片上層薄膜組件1上方粘貼有測試片標(biāo)簽5。
本發(fā)明的另一個目的還提供了一種快速檢測大腸菌群的測試片的制備方法,包括如下步驟:
a.配制大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基:每100mL按照以下方式配制,稱量胰蛋白胨1.0~3.0g、氯化鈉0.1~1.0g、乳糖1.5~3.5g、膽鹽0.1~0.4g、酵母膏粉0.2~1.0g、磷酸氫二鉀0.15~0.5g、磷酸二氫鉀0.15~0.5g、冷水可溶性凝膠0.5~2g,于錐形瓶中加蒸餾水100mL攪拌溶解,在121℃高壓滅菌鍋條件下滅菌15min,冷卻至室溫后,依次加入經(jīng)過濾滅菌的抑菌劑混合物15000~50000IU及顯色酶解底物混合劑0.02~0.05g,得到大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基,在0~4℃下冷藏備用;
b.各組件的前處理
上層薄膜組件1處理:輻照,劑量8KGy,使用前紫外滅菌30min;
下層底板4和珍珠紙2:下層底板4與珍珠紙2粘貼貼合在一起后,輻照,劑量8KGy,使用前用紫外滅菌30min;
c.大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基添加:將步驟b中經(jīng)紫外滅菌后的下層底板4和珍珠紙2結(jié)合部件水平放置在水平臺面上,珍珠紙2中間圓形凹槽3開口向上,吸取1~3mL大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基添加于圓形凹槽3內(nèi),使培養(yǎng)基均勻分布,無菌條件下烘干后,置于0~4℃的無菌冷藏箱內(nèi),備用;
d.組裝測試片:將經(jīng)上述步驟b、c后得到的測試片組件上貼上經(jīng)步驟a處理后的上層薄膜組件1,即得到快速檢測大腸菌群的測試片。
本發(fā)明還提供了一種用快速檢測大腸菌群的測試片檢測樣品中大腸菌群的方法,包括以下步驟:
a.樣品前處理;
b.用上述快速檢測大腸菌群的測試片進(jìn)行接菌培養(yǎng);
c.分析檢測結(jié)果。
有益效果:
1.本發(fā)明快速檢測大腸菌群的測試片,與現(xiàn)有大腸菌群測試片相比,菌落易于分辨,分布均勻,顯色清楚,避免了因擴(kuò)散嚴(yán)重而導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確,避免了人為操作不當(dāng)引起的誤差。
2.通過培養(yǎng)基優(yōu)化,獲得了顏色均一,雜質(zhì)少,培養(yǎng)效果好的培養(yǎng)基;通過將待測樣品直接接種于測試片上,實現(xiàn)對待測樣品中大腸菌群的快速培養(yǎng)和檢測。
3.本發(fā)明快速檢測大腸菌群測試片具有制備方法簡單,成本低廉,能夠自動化生產(chǎn)。使用方便,可以長期存放,大大節(jié)省培養(yǎng)基配置、培養(yǎng)皿滅菌、清洗等處理的時間,降低了勞動強(qiáng)度,縮短了檢測時間。
附圖說明
圖1為本發(fā)明測試片示意圖;
1-上層薄膜組件;2-珍珠紙;3-圓形凹槽;4-下層底板;5-測試片標(biāo)簽。
圖2為本發(fā)明測試片檢測陽性大腸菌群樣品的圓形凹槽內(nèi)的顯色圖。
具體實施方式
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明,下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進(jìn)行描述,但是應(yīng)當(dāng)理解,這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點,而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制,本發(fā)明試劑如無特別說明,均為常規(guī)試劑。
實施例1快速檢測大腸菌群的測試片的組成
如圖1所示,一種快速檢測大腸菌群的測試片,包括下層底板4,珍珠紙2,上層薄膜組件1,測試片標(biāo)簽5及大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基。下層底板4,珍珠紙2及上層薄膜組件1為長方形,珍珠紙2中間有圓形凹槽3,圓形凹槽3內(nèi)均勻分布有大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基。每100mL大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨1.0~3.0g、氯化鈉0.1~1.0g、乳糖1.5~3.5g、膽鹽0.1~0.4g、酵母膏粉0.2~1.0g、磷酸氫二鉀0.15~0.5g、磷酸二氫鉀0.15~0.5g、冷水可溶性凝膠0.5~2g,抑菌劑混合物150~500IU/mL、顯色酶解底物混合劑0.02~0.05g。抑菌劑混合物為膽鹽和結(jié)晶紫,重量比為80:1。顯色酶解底物混合劑為5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷、2,3,5-三苯基氯化四氮唑、3-吲哚基-beta-D-吡喃半乳糖苷的混合物,重量比為2:1:1。
冷水可溶性凝膠為重量比1:1的黃原膠和卡拉膠的混合物。
大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基的成分,100mL,見表1
表1大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基成分,100mL
上述試劑藥品均購置于青島海博生物技術(shù)有限公司和廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
珍珠紙2,中間具有圓形凹槽3,長×寬×厚為90×70×1.5mm,圓形凹槽的R=58mm。
上層薄膜組件1為透明bopp薄膜,長×寬×厚為95×70×0.1mm。
測試片標(biāo)簽5為不干膠貼紙,長×寬為70×10mm。
下層底板4為PVC底板,長×寬×厚為90×70×0.7mm。
最下面為下層底板4,珍珠紙2緊貼下層底板4,中間具有圓形凹槽3,上層薄膜組件1貼在珍珠紙2上,測試片標(biāo)簽5貼在上層薄膜組件1上,相互之間用不干膠粘合。
實施例2快速檢測大腸菌群的測試片的制備
2.1大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基的制備:其中100mL大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基配制的方法:稱量胰蛋白胨2.5g、氯化鈉0.35g、乳糖2.5g、膽鹽0.2g、酵母膏粉0.6g、磷酸氫二鉀0.35g、磷酸二氫鉀0.35g、冷水可溶性凝膠0.9g,于錐形瓶中加蒸餾水100mL攪拌溶解,在121℃高壓滅菌鍋條件下滅菌15min,冷卻至室溫后,依次加入經(jīng)過濾滅菌的抑菌劑混合物35000IU及顯色酶解底物混合劑0.03g,得到大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基,在0~4℃下冷藏備用。
2.2測試片各組件前處理:
2.2.1上層薄膜組件前處理,在有膠的一面均勻敷上冷水可溶性膠,并貼上產(chǎn)品標(biāo)簽,輻照,劑量8KGy,使用前紫外滅菌30min。
2.2.2下層底板和珍珠紙如圖1所示用不干膠進(jìn)行粘貼貼合處理后,輻照,劑量8KGy,使用前紫外滅菌30min。
2.2.3大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基添加:將2.2.2輻照處理后的材料平鋪于水平臺面,吸取1~3mL大腸菌群特征顯色液體培養(yǎng)基添加于珍珠紙上的圓形凹槽內(nèi),使培養(yǎng)基均勻分布,無菌條件下烘干后,置于0~4℃的無菌冷藏箱內(nèi),備用。
2.3組裝測試片:將步驟2.2.3中制備的測試片貼上上層薄膜組件,分裝于自封袋,置于鋁箔袋中,抽真空包裝,即得到快速檢測大腸菌群的測試片,制備好的快速檢測大腸菌群的測試片置于2~8℃環(huán)境下,保存期限1年。
實施例3待檢樣品中大腸菌群的檢測
使用本發(fā)明快速檢測大腸菌群測試片檢測樣品中大腸菌群時,主要有以下幾個步驟:
首先樣品處理:取樣品25mL(g)放入含有225mL滅菌稀釋液(磷酸鹽緩沖液或生理鹽水)的取樣器或均質(zhì)杯內(nèi),制成1:10的樣品勻液,用1mL的滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL,注入含有9mL滅菌稀釋液的試管內(nèi),搖勻后得到1:100的樣品稀釋液,按照上述操作步驟依次往下稀釋,制備10倍遞增系列的樣品稀釋勻液。一般樣品選2~3個稀釋度進(jìn)行檢測,含菌量少的液體樣品(如飲用純水和礦泉水等)可直接吸取原液進(jìn)行檢測。
其次接菌培養(yǎng):將測試片置于平坦臺面,打開測試片上層薄膜組件,用滅菌槍頭或滴管吸取1mL樣品勻液加到測試片中間凹槽位置,緩慢蓋上上層薄膜組件,避免有氣泡產(chǎn)生,使樣品勻液浸潤整個培養(yǎng)基區(qū)域,即可培養(yǎng)。每個稀釋度接種兩片,同時取1mL無菌生理鹽水接種另一測試片作空白對照。將接種好的測試片放置于37±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h。
上述磷酸鹽緩沖液的配制:稱取34.0g的分析純磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用175mL的1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0,用蒸餾水稀釋至1000mL后,取1.25mL,用蒸餾水繼續(xù)稀釋至1000mL,分裝于干凈的適量容器中,121℃高壓滅菌15min。
上述生理鹽水的配制:取8.5g分析純氯化鈉溶解到1000mL蒸餾水或純凈水中,充分混勻溶解,分裝到適量容器后,121℃高壓滅菌15min。
最后分析檢測結(jié)果:
1.培養(yǎng)后培養(yǎng)基區(qū)域上呈現(xiàn)紅點藍(lán)圈菌落的計為大腸菌群陽性,呈現(xiàn)紅色菌落的計為大腸菌群陰性。
2.計數(shù)
上述經(jīng)培養(yǎng)后的測試片(選取15~150CFU數(shù)值之間的測試片進(jìn)行計數(shù)),大腸菌群在測試片上呈現(xiàn)紅點藍(lán)圈菌落,且菌落形態(tài)較大。
選取菌落數(shù)在15~150CFU的培養(yǎng)皿,根據(jù)菌落形態(tài)計數(shù)大腸菌群數(shù)。
1)若兩個稀釋度的菌落數(shù)均在15~150CFU之間,則取其平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
2)若所有測試片上菌落數(shù)均小于15CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
3)若所有測試片上菌落數(shù)均大于150CFU,則對稀釋度最高的測試片進(jìn)行計數(shù),其他測試片可記錄為多不可計,結(jié)果按其平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)。
4)若所有測試片均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算;如果為原液,則以小于1計數(shù)。單位CFU/mL或CFU/g。
為了更好的體現(xiàn)本發(fā)明的有益效果,發(fā)明人用本發(fā)明測試片法、國家標(biāo)準(zhǔn)檢測法對樣品中的大腸菌群進(jìn)行檢測,對比結(jié)果如下:
將處理好的樣品,用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液將其稀釋至10-1、10-2兩個梯度。用滅菌槍頭或滴管吸取1mL待測樣品稀釋液傾注在國標(biāo)法推薦的平板上和本發(fā)明的測試片上,以1mL滅菌生理鹽水作為空白對照,在37±1℃條件下,培養(yǎng)24h后,記錄觀察結(jié)果如下表2:
表2樣品檢測結(jié)果比對表1(培養(yǎng)時間24h,培養(yǎng)溫度37±1℃)
檢測結(jié)果本發(fā)明與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果有很好的符合度。
對所公開的實施例的上述說明,使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的,本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下,在其它實施例中實現(xiàn)。