本發(fā)明屬于快速檢測領(lǐng)域，涉及微生物檢測技術(shù)，具體涉及一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，以及該測試片制備方法、檢測方法。

背景技術(shù)：

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在自然界分布廣泛，在各種食品中的檢出率也較高，造成這個現(xiàn)象的原因，往往是由于食品在食用前保存溫度不當，放置時間過長，使污染在食品中的蠟樣芽孢桿菌或殘存的芽孢得以生長繁殖，由于蠟樣芽孢桿菌會產(chǎn)生的熱穩(wěn)定毒素，從而會導(dǎo)致食物中毒事件發(fā)生。蠟樣芽孢桿菌中毒的發(fā)病率較高，一般能達到60％～100％。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局2014年已通過《食品微生物含量指引》，指出每克即食食品含超過十萬個蠟樣芽孢桿菌，就不宜供人食用，可能危害食用者的健康。

目前食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測，主要采用國標《GB 4789.14-2014食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》的方法進行檢測，該方法為平板法，是經(jīng)典的微生物檢測和鑒定方法，檢測結(jié)果具有準確可靠的特點，但是該方法耗時長，需要現(xiàn)配置培養(yǎng)基，操作步驟繁瑣，難以滿足快速檢測的實際需求。

紙片法的出現(xiàn)，彌補了平板法的缺點，逐步成為微生物檢測和鑒定的主要方法和標準,2007年，Petrifilm^TM測試片被正式列為中國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準，該方法正逐漸被越來越多的食品生產(chǎn)加工企業(yè)及各類檢測機構(gòu)所認可。目前市場上現(xiàn)有測試片的培養(yǎng)基載體為無紡布，其存在目標菌落在無紡布上擴散生長使菌落邊緣模糊的缺點，對結(jié)果判讀有影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片及其制備方法、檢測方法。

技術(shù)方案：

一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，包括下層底板4，珍珠紙2，上層薄膜組件1和蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基，所述珍珠紙2中間具有圓形凹槽3，所述圓形凹槽3內(nèi)均勻分布有蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基。

進一步蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基每100mL含有胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化鈉0.1～1.0g、磷酸二氫鉀0.2～0.4g、磷酸氫二鉀0.2～0.4g、冷水可溶性膠0.5～2.0g、抑菌劑混合物100～500IU/mL、顯色酶解底物混合劑0.015～0.04g。

進一步顯色酶解底物混合劑由5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽、4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽按重量比1:1:1:2混合組成。

進一步抑菌劑混合物為多粘菌素B、卡那霉素，頭孢克洛按重量比為2:2:1的混合物。

進一步珍珠紙圓形凹槽3直徑為50～65mm。

進一步測試片上層薄膜組件1上方粘貼有測試片標簽5。

本發(fā)明的另一個目的還提供了一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片的制備方法，包括如下步驟：

a.配制蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基：每100mL按照以下方式配制，稱量胰蛋白胨0.8～2.0g、牛肉浸出粉0.05～0.5g、氯化鈉0.1～1.0g、磷酸二氫鉀0.2～0.4g、磷酸氫二鉀0.2～0.4g、冷水可溶性膠0.5～2.0g，于燒杯中加蒸餾水100mL加熱攪拌溶解，在121℃高壓滅菌鍋條件下滅菌15min，冷卻至室溫后，依次加入經(jīng)過濾滅菌的抑菌劑混合物10000～50000IU及顯色酶解底物混合劑0.015～0.04g，得到蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基，在0～4℃下冷藏備用；

b.各組件的前處理

上層薄膜組件1：在上層薄膜組件1的反面均勻敷上冷水可溶性凝膠，在正面貼上測試片標簽5，送輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

下層底板4和珍珠紙2：下層底板4與珍珠紙2采用不干膠粘貼貼合在一起后，送輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

c.蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基添加：將步驟b中經(jīng)紫外滅菌后的下層底板4和珍珠紙2結(jié)合部件水平放置在水平臺面上，珍珠紙2中間圓形凹槽3開口向上，吸取1～3mL蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基添加于圓形凹槽3內(nèi)，使培養(yǎng)基均勻分布，無菌條件下35～85℃烘干4h后，置于0～4℃的無菌冷藏箱內(nèi)，備用；

d.組裝測試片：將經(jīng)上述步驟c后得到的測試片組件上貼上經(jīng)步驟a處理后的上層薄膜組件1，具有測試片標簽5的一面向上，即得到快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片。

本發(fā)明還提供了一種用快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌的方法，包括以下步驟：

a.樣品前處理；

b.用上述快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片進行接菌培養(yǎng)；

c.分析檢測結(jié)果。

本發(fā)明快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，利用微生物生化反應(yīng)的特性，將微生物胞內(nèi)酶的種類及反應(yīng)條件作為微生物分類鑒定的主要依據(jù)，通過在分離培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基中，加入微生物特異性酶顯色底物，當目的菌在培養(yǎng)基上生長時，其特異性酶就能降解顯色底物，并產(chǎn)生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落形成特定的顏色或形態(tài)，從而進行樣品中微生物的培養(yǎng)和檢測。本發(fā)明采用測試片形式，該測試片培養(yǎng)時間為18～24h,菌落顯色清楚，易于判讀和分析，可實現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌的檢測，且準確度達國標90％以上，能夠滿足實際檢測需求。

有益效果：

1.通過培養(yǎng)基優(yōu)化，獲得一種顏色均一，雜質(zhì)少，培養(yǎng)效果好的培養(yǎng)基；通過將待測樣品直接接種于測試片上，實現(xiàn)對待測樣品中蠟樣芽孢桿菌的快速培養(yǎng)和檢測。

2.本發(fā)明所述的快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，與現(xiàn)有蠟樣芽孢桿菌測試片相比，菌落易于分辨，分布均勻，顯色清楚，避免了因擴散嚴重而導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果不準確，避免了人為操作不當引起的誤差。

3.本發(fā)明測試片，具有使用簡便，可以長期存放，應(yīng)用靈活的特點，省去了培養(yǎng)基配置、培養(yǎng)皿滅菌、清洗等處理的步驟，大大縮短了檢測時間，降低了勞動強度。同時，本發(fā)明測試片制備方法簡單、易行，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化生產(chǎn)，成本低廉，使用方便。

附圖說明

圖1為本發(fā)明測試片示意圖；

1，上層薄膜組件；2，珍珠紙；3，圓形凹槽；4，下層底板；5，測試片標簽。

圖2為本發(fā)明測試片檢測陽性蠟樣芽孢桿菌樣品的圓形凹槽內(nèi)的顯色圖。

具體實施方式

為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制，本發(fā)明試劑如無特別說明，均為常規(guī)試劑。

實施例1快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片的組成

一種快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，包括下層底板4，珍珠紙2，上層薄膜組件1，測試片標簽5及蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基。下層底板4，珍珠紙2及上層薄膜組件1為長方形，珍珠紙2中間有圓形凹槽3，圓形凹槽3內(nèi)均勻分布有蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基。每100mL蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、冷水可溶性膠、抑菌劑混合物、顯色酶解底物混合劑。酶解底物混合劑由5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽、4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-beta-D-葡糖苷酸環(huán)己胺鹽按重量比1:1:1:2混合組成。抑菌劑混合物由多粘菌素B、卡那霉素、頭孢克洛按重量比2:2:1組成。冷水可溶性凝膠為黃原膠和卡拉膠的混合物，重量比為1:1。

蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基的成分，100mL，見表1

表1蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基的成分，100mL

珍珠紙2，尺寸長寬厚為90×70×0.1mm，中間具有圓形凹槽3，中間圓形凹槽3的直徑為50～65mm。

上層薄膜組件1為透明bopp薄膜，材質(zhì)為bopp，尺寸長寬厚為90×70×0.1mm。

測試片標簽5為不干膠貼紙，材質(zhì)為bopp，尺寸長寬厚為70×15×0.1mm。

下層底板4為PVC底板，材質(zhì)為pvc，尺寸長寬厚為90×70×0.7mm，下層底板4上與圓形凹槽3對應(yīng)的部位為中空。

最下面為下層底板4，珍珠紙2緊貼下層底板4，中間具有圓形凹槽3，上層薄膜組件1貼在珍珠紙2上，測試片標簽5貼在上層薄膜組件1上，相互之間用不干膠粘合，如圖1所示，每份快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片檢測一個樣品。

實施例2快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片的制備

2.1蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基的制備

其中100mL蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基配制的方法：稱量胰蛋白胨1.2g、牛肉浸出粉0.15g、氯化鈉0.3g、磷酸二氫鉀0.25g、磷酸氫二鉀0.25g、冷水可溶性膠0.9g，于燒杯加蒸餾水100mL攪拌溶解，在121℃高壓滅菌鍋條件下滅菌15min，冷卻至室溫后，依次加入經(jīng)過濾滅菌的抑菌劑混合物20000IU及顯色酶解底物混合劑0.020g，得到蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基，在0～4℃下冷藏備用。

2.2測試片各組件前處理：

2.2.1上層薄膜組件1：在上層薄膜組件1的反面均勻敷上冷水可溶性凝膠，在正面貼上測試片標簽5，送輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

2.2.2下層底板4和珍珠紙2：下層底板4與珍珠紙2采用不干膠粘貼貼合在一起后，送

輻照處理，輻照劑量為2KGy，使用前紫外滅菌30min；

2.2.3蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基添加：將步驟2.2.2中經(jīng)紫外滅菌后的下層底板4和珍珠紙2結(jié)合部件水平放置在水平臺面上，珍珠紙2中間圓形凹槽3開口向上，吸取1～3mL蠟樣芽孢桿菌特征顯色液體培養(yǎng)基添加于圓形凹槽3內(nèi)，使培養(yǎng)基均勻分布，無菌條件下35～85℃烘干4h后，置于0～4℃的無菌冷藏箱內(nèi)，備用；

2.3組裝測試片：將經(jīng)上述步驟2.2.3后得到的測試片組件上貼上經(jīng)步驟2.2.1處理后的上層薄膜組件1，具有測試片標簽5的一面向上，分裝于自封袋，置于鋁箔袋中，抽真空包裝，即得到快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片，制備好的快速檢測蠟樣芽孢桿菌的測試片置于2～8℃環(huán)境下，保存期限1年。

實施例3待檢樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢測

使用本發(fā)明快速檢測蠟樣芽孢桿菌測試片檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌時，主要有以下幾個步驟：

首先樣品處理：取樣品25mL(g)放入含有225mL滅菌稀釋液(滅菌磷酸鹽緩沖液或生理鹽水)的取樣器或均質(zhì)杯內(nèi)，制成1:10的樣品勻液，用1mL的滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL滅菌稀釋液的試管內(nèi)，搖勻后得到1:100的樣品稀釋液，按照上述操作步驟依次往下稀釋，制備10倍遞增系列的樣品稀釋勻液。一般樣品選2～3個稀釋度進行檢測，含菌量少的液體樣品(如飲用純水和礦泉水等)可直接吸取原液進行檢測。

其次接菌培養(yǎng)：將測試片置于平坦臺面，打開測試片上層薄膜組件，用滅菌槍頭或滴管吸取1mL樣品勻液加到測試片中間凹槽位置，緩慢蓋上上層薄膜組件，避免有氣泡產(chǎn)生，使樣品勻液浸潤整個培養(yǎng)基區(qū)域，即可培養(yǎng)。每個稀釋度接種兩片，同時取1mL無菌生理鹽水接種另一測試片作空白對照。將接種好的測試片放置于37±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

上述磷酸鹽緩沖液的配制：稱取34.0g的分析純磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用175mL的1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，用蒸餾水稀釋至1000mL后，取1.25mL,用蒸餾水繼續(xù)稀釋至1000mL，分裝于干凈的適量容器中，121℃高壓滅菌15min。

上述生理鹽水的配制：取8.5g分析純氯化鈉溶解到1000mL蒸餾水或純凈水中，充分混勻溶解，分裝到適量容器后，121℃高壓滅菌15min。

最后分析檢測結(jié)果：

1.培養(yǎng)后培養(yǎng)基區(qū)域上呈現(xiàn)白點藍圈菌落的計為蠟樣芽孢桿菌陽性，蠟樣芽孢桿菌陰性顯藍色。

2.計數(shù)

上述經(jīng)培養(yǎng)后的測試片(選取10～150CFU數(shù)值之間的測試片進行計數(shù))，蠟樣芽孢桿菌在測試片上呈現(xiàn)白點藍圈菌落。

1)若兩個稀釋度的菌落數(shù)均在10～150CFU之間，則取其平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

2)若所有測試片上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算；若所有測試片均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如果為原液，則以小于1計數(shù)。

3)若所有測試片上菌落數(shù)均大于150CFU，則對稀釋度最高的測試片進行計數(shù)，其他測試片可記錄為多不可計，結(jié)果按其平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)。單位CFU/mL或CFU/g。

為了更好的體現(xiàn)本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人用本發(fā)明測試片法、國家標準檢測法對樣品中的蠟樣芽孢桿菌進行檢測：

將處理好的腐乳樣品，用滅菌生理鹽水將其稀釋至10^-2、10^-3、10^-4三個梯度。用滅菌槍頭或滴管吸取1mL待測樣品稀釋液均勻涂布在國標法推薦的平板上和本發(fā)明的測試片上，以1mL滅菌生理鹽水作為空白對照，在37±1℃條件下，培養(yǎng)24h后，記錄觀察結(jié)果如下表2：

表2樣品檢測結(jié)果比對表1(培養(yǎng)時間24h，培養(yǎng)溫度37±1℃)

檢測結(jié)果標明本發(fā)明與國標有很好的符合度。

對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。