本發(fā)明涉及將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用到體內(nèi)組織和器官的模擬與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控芯片的三維血腦屏障模型的建立方法。

背景技術(shù)：

自19世紀(jì)末，研究者認(rèn)識(shí)到在大腦和腦血管之間有屏障組織的存在，稱(chēng)為“血腦屏障”。血腦屏障主要是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞等細(xì)胞成分共同組成的功能性屏障，可調(diào)節(jié)細(xì)胞、分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等進(jìn)出大腦以維持整個(gè)腦微環(huán)境的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，很多腦部異常和腦部疾病都與血腦屏障的破壞有關(guān)，也有很多疾病隨著惡性程度的發(fā)展能夠破壞血腦屏障。但是，由于血腦屏障對(duì)屏障外分子的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)和屏障作用，很多藥物無(wú)法順利通過(guò)血腦屏障進(jìn)而無(wú)法對(duì)相應(yīng)腦部破壞和疾病進(jìn)行有效的控制和治療。因此，根據(jù)體內(nèi)血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能特性，體外建立穩(wěn)定有效的血腦屏障模型，對(duì)于進(jìn)一步研究血腦屏障的功能機(jī)制和原理、研究其對(duì)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力及對(duì)腦損傷的機(jī)制，對(duì)新藥的研究與開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。

血腦屏障體外模型的研究發(fā)展至今，主要依賴(lài)于商品化的Transwell小室，將內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞分別培養(yǎng)在聚碳酸酯膜的兩側(cè)以建立血腦屏障模型，研究二維層面的血腦屏障模型的結(jié)構(gòu)和功能。主要存在的問(wèn)題是Transwell小室構(gòu)建的血腦屏障模型無(wú)法實(shí)現(xiàn)體內(nèi)模型中血管和基質(zhì)交界處所形成的界面，也無(wú)法加諸流體條件以模擬體內(nèi)血腦屏障處的血流條件，不符合體內(nèi)血腦屏障的生理環(huán)境，且內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)，也不符合體內(nèi)血腦屏障真實(shí)的生理組成，因此難以成為功能完善的血腦屏障模型并進(jìn)行后續(xù)研究。

微流控芯片技術(shù)作為一門(mén)迅速發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣 泛的應(yīng)用，且因其與細(xì)胞尺寸相匹配、近生理的微環(huán)境以及時(shí)空可控性，易于通過(guò)靈活的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和多樣的制作方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的應(yīng)用而逐漸成為新型的細(xì)胞學(xué)研究的重要技術(shù)手段和平臺(tái)。目前，應(yīng)用微流控芯片為技術(shù)平臺(tái)建立血腦屏障模型，并進(jìn)一步應(yīng)用到藥物篩選研究中還處于起步階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控芯片的三維血腦屏障模型的建立方法，該方法能夠建立一種近生理的三維血腦屏障模型并應(yīng)用于針對(duì)腦腫瘤的藥物篩選。

該微流控芯片主要包括三層結(jié)構(gòu)：主通道層、膠原通道層和玻璃底層；主通道層包含細(xì)胞入口、主通道和廢液出口；細(xì)胞入口和廢液出口通過(guò)主通道連接，膠原通道層包含膠原入口、膠原液池和膠原通道，膠原入口和膠原液池通過(guò)膠原通道連接；同時(shí)主通道和膠原液池上下直接聯(lián)通。

所述微流控芯片的主通道層和膠原通道層為兩塊相同大小的PDMS聚合物，主通道層PDMS芯片厚度為0.8-2mm，主通道層中主通道寬度為1mm，膠原通道層PDMS芯片厚度為0.5-1mm，膠原液池的直徑為800μm，兩層PDMS芯片封接后，主通道可將膠原液池完全覆蓋；完全封接在一起的兩塊PDMS芯片再封接在潔凈玻璃上，構(gòu)成完整的芯片。

由于膠原通道層上的膠原入口與主通道層上的細(xì)胞入口和廢液出口互相聯(lián)通，因此膠原入口處同時(shí)可用于底層液體的收集。

所述整個(gè)芯片設(shè)計(jì)可并排封接在足夠大的潔凈玻璃底面以增加通量，個(gè)數(shù)可在1-100個(gè)之間。

一種基于微流控芯片的三維血腦屏障模型的建立方法，方法過(guò)程如下：

(1)膠原工作液的配制

將I型鼠尾膠原按照配方配制為終濃度為3～9mg/mL的工作液，用移液器將配制好的膠原工作液從膠原入口加入到膠原通道中，將整個(gè)芯片置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育30-45分鐘，促使膠原由粘稠狀液體變?yōu)楣麅鰻钅z。

(2)芯片內(nèi)細(xì)胞接種及血腦屏障模型的建立

分別將新生SD大鼠的原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，密度為5×10⁵-1×10⁶cells/mL。先從細(xì)胞入口向主通道中注入原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液，靜置8-10分鐘，再?gòu)募?xì)胞入口向主通道中注入原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液，靜置8-10分鐘后，將整個(gè)芯片置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-4天，每24小時(shí)換液一次。

所述步驟(1)中，鼠尾膠原的工作液濃度優(yōu)選6mg/mL。

所述步驟(2)中，所用的大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞均為未經(jīng)傳代培養(yǎng)的原代細(xì)胞。

本發(fā)明在微流控芯片上構(gòu)建三維血腦屏障模型，并可對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的表征，為后續(xù)研究和應(yīng)用提供平臺(tái)。本發(fā)明與現(xiàn)有血腦屏障模型相比，解決了細(xì)胞間非接觸式共培養(yǎng)和耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，更接近體內(nèi)真實(shí)的生理環(huán)境，顯著降低了細(xì)胞和試劑的消耗量，提高實(shí)驗(yàn)效率。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明所提供的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；(a)為主通道層結(jié)構(gòu)示意圖，(b)為膠原通道層結(jié)構(gòu)示意圖，(c)玻璃底層結(jié)構(gòu)示意圖；

其中，1主通道層、2細(xì)胞入口、3主通道、4廢液出口、5膠原通道層、6膠原入口、7膠原液池、8膠原通道、9玻璃底層。

圖2膠原加入芯片后，在膠原液池形成的清晰界面及三維基質(zhì)均勻膠絲；

圖3芯片上先后接種腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞并連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，上層腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖表征(bright)以及活性表征(vWF)；

圖4芯片上血腦屏障中緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)情況，(1)、(2)、(3)分別表示三個(gè)膠原液池平行孔中的ZO-1的表達(dá)情況；

圖5芯片上血腦屏障中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白Glut-1的表達(dá)情況，其中Glut-1為蛋白表征，DAPI為細(xì)胞核表征，Merge為二者的疊加；

圖6芯片上血腦屏障中極性轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白P-glycoprotein的表達(dá)情況，其中P-glycoprotein為蛋白表征，DAPI為細(xì)胞核表征，Merge為二者的疊加。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。

本發(fā)明的微流控芯片，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該微流控芯片主要包括三層結(jié)構(gòu)：主通道層1、膠原通道層5和玻璃底層8；主通道層1包含細(xì)胞入口2、主通道3和廢液出口4，細(xì)胞入口2和廢液出口4通過(guò)主通道3連接；膠原通道層5包含膠原入口6、膠原液池7和膠原通道8，膠原入口6和膠原液池7通過(guò)膠原通道8連接；同時(shí)主通道3和膠原液池7上下直接聯(lián)通。

主通道層PDMS厚度為1mm，主通道寬度為1mm；膠原通道層、PDMS厚度為0.5mm，膠原液池直徑為800μm。兩層PDMS芯片封接后，主通道可將膠原液池完全覆蓋；完全封接在一起的兩塊PDMS芯片再封接在潔凈玻璃上，構(gòu)成完整的芯片。

實(shí)施例1

原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)在三維膠原表面的生長(zhǎng)和增殖表征

配制濃度為6mg/mL的膠原工作液，從膠原入口加入到膠原通道中直至注滿(mǎn) 膠原液池，37℃凝膠30min，形成的膠絲分布如圖2所示。從細(xì)胞入口向主通道中加入消化為單細(xì)胞懸液的新生SD大鼠的腦星形膠質(zhì)細(xì)胞到主通道中，細(xì)胞懸液密度為5×10^6-1×10⁷cells/mL，靜置5min，使膠質(zhì)細(xì)胞充分貼附在膠原表面，再?gòu)募?xì)胞入口向主通道中加入消化為單細(xì)胞懸液的新生SD大鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞到加入到主通道中，細(xì)胞懸液密度為5×10^6-1×10⁷cells/mL，靜置5min，使內(nèi)皮細(xì)胞充分貼附在膠質(zhì)細(xì)胞層的表面，隨后將整個(gè)芯片置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，每隔24h換液一次，并拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖融合的情況，如圖3所示。48小時(shí)后，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，監(jiān)測(cè)蛋白為內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物vWF，方法如下：4％多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；0.1％triton X-100致孔劑作用10min，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；山羊封閉血清作用1小時(shí)，一抗(兔抗大鼠vWF)1:100稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；二抗(TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG)1:100稀釋?zhuān)胤跤?小時(shí)，PBS緩沖液沖洗三次，每次10min；沖洗完畢后熒光顯微鏡下拍照，記錄vWF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例2

芯片上血腦屏障功能性蛋白的表征

利用實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)制作的微流控芯片，結(jié)構(gòu)如圖1所示。當(dāng)經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，血腦屏障形成后，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光染色，監(jiān)測(cè)蛋白為內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白Glut-1和極性轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白P-glycoprotein，方法如實(shí)施例1所述。最后采用熒光顯微鏡拍照，結(jié)果如圖4、圖5、圖6所示。