本發(fā)明屬于微流控芯片技術領域，具體涉及一種基于微流控芯片的多器官腫瘤靶向藥物測試平臺及其應用。

背景技術：

化學藥物治療是惡性腫瘤綜合治療的主要手段之一。藥物測試的傳統(tǒng)方法一般依靠生物毒性進行，未考慮藥物體內的代謝過程及生物選擇性，這樣測試得到的活性藥物在研發(fā)進入臨床后常因為毒性以及代謝問題而擱淺，成藥率極低。理想的靶向藥物測試平臺應該能對殺滅腫瘤細胞而不損傷正常組織細胞的藥物進行測試篩選，可以同時測試藥物對不同腫瘤以及正常組織的作用，也可以模擬口服藥物經肝代謝后活性增強或減弱的實際過程。構建這樣一個平臺能夠對于藥物研發(fā)及指導臨床用藥有著重要意義。

微流控芯片實驗室又稱芯片實驗室或微流控芯片，指的是把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測、細胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學或生物實驗室的各種功能的一種技術。微流控芯片技術作為一門迅速發(fā)展起來的科學技術，已經在生物醫(yī)學領域展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢，更因其同細胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設計實現(xiàn)多種細胞功能研究等特點而成為新一代生物仿生和細胞研究的重要平臺。目前，在新藥評價中，利用微流控芯片進行組織工程的模擬，尤其是構建多器官腫瘤靶向藥物測試平臺研究分析還處于空白階段。如能成功構建，在藥物研發(fā)中可以加速有效新藥的篩選具有重大的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控芯片的多器官腫瘤靶向藥物測試平臺及其應用，并應用于腫瘤靶向藥物的藥效學研究，特別針對模擬體內真實代謝條件下的藥物測試，可以同時觀察藥物經肝代謝后對不同細胞的作用。

本發(fā)明提供一種微流控芯片，主要由上層芯片、下層芯片和多孔濾膜組成，多孔濾膜上連上層芯片，多孔濾膜下連下層芯片，所述上層芯片結構為細胞培養(yǎng)室，下層芯片結構為獨立多通道，通道數(shù)量為1-9條

所述芯片材料為可透光透氣的PDMS聚合物，多孔濾膜材料為聚碳酸酯膜，孔徑為0.01um-4um。。

本發(fā)明提供的基于微流控芯片的多器官腫瘤靶向藥物測試平臺，按照以下方法的建立：

(1)芯片制作與修飾

設計制作上層芯片與下層芯片，多孔濾膜夾在中間進行封接，置于培養(yǎng)皿中，紫外滅菌過夜后，用移液器將配制好的膠原工作液加入上層芯片細胞培養(yǎng)室及下層芯片各通道，將固定芯片的培養(yǎng)皿常溫靜置過夜，12-36小時之內移除膠原工作液，細胞培養(yǎng)液沖洗通道2-4次，對底面進行修飾，促進細胞更好地貼壁；

(2)上層芯片內細胞的接種與培養(yǎng)

肝細胞消化后，調整至合適的細胞密度，加入到上層芯片細胞培養(yǎng)室中，在膠原的修飾作用下，細胞迅速貼壁并均勻鋪展于細胞培養(yǎng)室底面，當在光學顯微鏡下觀察到細胞在細胞培養(yǎng)室中均勻分布時，立即將芯片移入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

(3)下層芯片內細胞的接種與培養(yǎng)

待肝細胞經過增殖鋪滿細胞培養(yǎng)室60％時，不同的腫瘤細胞與正常組織細胞分別接種培養(yǎng)于下層芯片各通道中，12小時后，向上層芯片加入含藥液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。

一種基于微流控芯片的多器官腫瘤靶向藥物測試平臺的應用，用于腫瘤靶向藥物篩選平臺的芯片內細胞活性考察，其方法過程如下：

(1)使用CCK-8試劑盒進行細胞活性的檢測，CCK-8試劑：細胞培養(yǎng)基＝1:9混合均勻成檢測工作液，加入下層芯片通道，置培養(yǎng)箱中3小時后，轉入96孔板中，酶標儀測定450nm處吸光度。

(2)將下層芯片與封有上層芯片的多孔濾膜分離，可對下層芯片的細胞進行顯微觀察，常規(guī)免疫熒光染色法表征。

一種基于微流控芯片的多器官腫瘤靶向藥物測試平臺的應用，用于腫瘤靶向藥物篩選平臺的芯片內應用于藥物代謝過程研究的方法，該方法過程如下：

收集上層培養(yǎng)液及下層培養(yǎng)液，可以分別進行質譜分析，可以檢測藥物原型及代謝物的含量。

本發(fā)明涉及將微流控芯片技術應用于構建模擬體內真實代謝條件下的藥物測試平臺的技術領域，可以同時觀察藥物經肝代謝后對不同細胞的作用，并應用于腫瘤靶向藥物的測試篩選，可以大大提高篩選藥物的成藥率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明微流控芯片示意圖，a為實物示意圖；b為微流控芯片截面示意圖，其中1上層芯片、2下層芯片、3多孔濾膜、4細胞培養(yǎng)室、5為1#通道、6為2#通道、7為3#通道。

圖2為細胞熒光圖，其中a為本發(fā)明微流控芯片上層芯片培養(yǎng)室內細胞熒光圖；上層芯片細胞；b為本發(fā)明微流控芯片下層芯片通道內細胞熒光圖；c本 發(fā)明為微流控芯片上層芯片培養(yǎng)室內細胞熒光圖與下層芯片通道內細胞熒光圖合并圖。

圖3：a卡培他濱作用于不同細胞的顯微明場圖及死/活染色熒光圖；b卡培他濱對不同細胞的細胞活力影響。

圖4：a為不同劑量卡培他濱作用于乳腺癌細胞的顯微明場圖及死/活染色熒光圖；b為不同劑量卡培他濱對乳腺癌細胞的抑制率。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實施例1

多器官腫瘤靶向藥物測試平臺芯片的建立

設計制作芯片，上層芯片1是一個細胞培養(yǎng)室4，下層芯片2是三個平行獨立的通道，結構如圖1b所示。多孔濾膜3置于玻片上紫外活化1小時，硅烷化處理30分鐘，與上層芯片1一同進行氧等離子封接，置80度烘箱，30分鐘。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻片上甩10um-50um厚，下層芯片2上表面蘸取薄PDMS后，與封接有上層芯片的多孔濾膜3對齊粘合，80度，30分鐘固化完全。結果如圖1a所示。

實施例2

多器官腫瘤靶向藥物測試平臺的表征

用實驗室自行設計制作的微流控芯片，結構如圖1b所示。Hepg2細胞使用綠色細胞膜染料處理30min后，接入上層芯片細胞培養(yǎng)室4。MDA-MB-231細胞、A549細胞、GES-1細胞使用紅色細胞膜染料處理30min后，分別接入下層芯片三個通道1#通道5、2#通道6、3#通道7。使用熒光顯微鏡拍攝上層芯片細胞培養(yǎng)室4的細胞，結果如圖2a所示，使用熒光顯微鏡拍攝下層芯片通道1# 通道5、2#通道6、3#通道7的細胞，結果如圖2b所示。將上層芯片培養(yǎng)室內細胞熒光圖與下層芯片通道內細胞熒光圖合并，結果如圖2c所示。

實施例3

使用多器官腫瘤靶向藥物測試平臺測試卡培他濱對不同細胞的作用

利用實驗室自行設計制作的微流控芯片，結構如圖1b所示。配制濃度為100μg/mL的Ⅰ型鼠尾膠原工作液，經由細胞入口池注入芯片內，常溫靜置過夜，24小時后移除膠原工作液，細胞培養(yǎng)液沖洗通道3次。在上層芯片接種/未接種Hepg2細胞時，在下層芯片3個單元分別接種MDA-MB-231、U87、GES-1細胞，含80μM卡培他濱的H-DMEM培養(yǎng)基加入上層培養(yǎng)室。48小時后，通過死/活染色試劑盒以及CCK8試劑盒檢測藥物對不同細胞的毒性作用。結果如圖3a和圖3b所示，80uM濃度的卡培他濱在未經肝代謝時，48小時的處理對各細胞毒性均較??；而經肝代謝后，48小時的處理對正常組織細胞GES-1殺傷作用較弱，而對MB231和U87有明顯的殺傷作用，且藥物對MB231的殺傷作用更強。

實施例4

使用多器官腫瘤靶向藥物測試平臺測試不同濃度卡培他濱對乳腺癌的作用

利用實驗室自行設計制作的微流控芯片，結構如圖1b所示。芯片修飾后，采用與實施例1相同的細胞接種和培養(yǎng)方式建立糖尿病血管病變模型。在上層芯片接種/未接種Hepg2細胞，下層芯片單元均接種MDA-MB-231細胞，含不同濃度卡培他濱的H-DMEM培養(yǎng)基加入上層培養(yǎng)室。48小時候，通過死/活染色試劑盒以及CCK8試劑盒檢測藥物對不同細胞的毒性作用。結果如圖4a和圖4b所示，MB231細胞活力隨著卡培他濱濃度的增加而降低。