本發(fā)明涉及利用微生物獲取目標(biāo)產(chǎn)物的微生物技術(shù)，尤其涉及白黃小薄孔菌獲取漆酶的培養(yǎng)基以及利用該菌獲取漆酶溶液的方法。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，與植物的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白均屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族。其在自然界中廣泛分布于植物、真菌、少數(shù)昆蟲(chóng)和細(xì)菌中，一些動(dòng)物腎臟(如豬腎)和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶。研究證明，在降解木質(zhì)纖維素的過(guò)程中只有漆酶不需要過(guò)氧化氫，同時(shí)將氧分子還原成水，對(duì)木質(zhì)素及其前體類(lèi)似物和與其結(jié)構(gòu)相似的多種環(huán)境污染物具有廣譜的適用性，表現(xiàn)出獨(dú)特的降解機(jī)理，因此漆酶在紙漿造紙、能源開(kāi)發(fā)、食品加工、環(huán)境污染物去毒與降解、生物合成、改善纖維素性能和生物檢測(cè)等領(lǐng)域具有較高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。
白黃小薄孔菌生長(zhǎng)于闊葉樹(shù)倒木上，是一種新發(fā)現(xiàn)的多孔菌。若能利用白黃小薄孔菌獲取漆酶未嘗不是為漆酶的獲取和利用提供更多可選性，基于如此精神，本發(fā)明公開(kāi)一種適用于適于白黃小薄孔菌獲取漆酶的培養(yǎng)基以及該菌生產(chǎn)漆酶溶液的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一在于提供一種適于白黃小薄孔菌獲取漆酶的培養(yǎng)基。為了達(dá)成該目的，本發(fā)明對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案如下：
適于白黃小薄孔菌獲取漆酶的培養(yǎng)基，由葡萄糖、酵母浸粉或蛋白胨、維生素B1或維生素B2、磷酸二氫鉀組成。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，各組份由左至右按重量份的配比為(2000～4000):(200～1400):(1～4):(100～400)。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)的初始pH值為4.5～5.2。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，酵母浸粉或蛋白胨中優(yōu)選酵母浸粉。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，維生素B1或維生素B2中優(yōu)選維生素B1。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之一，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，該培養(yǎng)基的初始pH值優(yōu)選為4.8。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種用白黃小薄孔菌生產(chǎn)漆酶溶液的方法。為了達(dá)成該目的，本發(fā)明對(duì)應(yīng)的技術(shù)方案如下：
一種用白黃小薄孔菌生產(chǎn)漆酶溶液的方法，按如下步驟進(jìn)行：a.將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化；b.將步驟a的培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液；c.采用達(dá)成本發(fā)明目的之一的技術(shù)方案中的培養(yǎng)基培養(yǎng)種子發(fā)酵懸液，培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得所述漆酶溶液。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之二，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，離心所得漆酶溶液的上清液是粗酶溶液。
為了達(dá)成本發(fā)明的上述目的之二，在基于上述初始的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，在某些實(shí)施例中，步驟b中采用內(nèi)切式勻漿機(jī)制得種子發(fā)酵懸液。
本發(fā)明培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法能夠使白黃小薄孔菌高產(chǎn)漆酶，為漆酶的獲取和利用提供了以白黃小薄孔菌為線索的新選擇。
本發(fā)明人已經(jīng)在此發(fā)明內(nèi)容章節(jié)總地描述了本發(fā)明的精神；以下實(shí)施例的舉例是為了方便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)一步了解本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程所進(jìn)行的描述，不能理解為對(duì)本發(fā)明精神具體化的限制。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例所用的菌株為白黃小薄孔菌(Antrodiella albocinnamomea)菌株Si 29，采自河南省焦作市云臺(tái)山自然保護(hù)區(qū)，寄主為闊葉樹(shù)樹(shù)樁。
以下實(shí)施例采用的漆酶活性的定義為：漆酶活性(U/mL)＝(A×V)/(t×ε×v×L)；其中：
A為樣品的吸光值；
V為反應(yīng)體系體積(mL)；
t為反應(yīng)時(shí)間(min)；
ε為摩爾消光系數(shù)，已知420nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420nm＝0.036LμM-1cm-1；
v為樣品量(mL)；
L為比色杯光徑(cm)；
即一個(gè)酶活力單位(U)被定義為28℃下1min內(nèi)催化氧化1μmol ABTS所需的酶量。
以下實(shí)施例采用的漆酶活性的測(cè)試方法為：檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)、粗酶溶液、1.0mmol/L ABTS【中文：2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽；英文：2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)】按照體積比39:1:20配比成反應(yīng)體系。在28℃下反應(yīng)3min后，于420nm處測(cè)定吸光度。
實(shí)施例一
配置固體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B2、磷酸二氫鉀按照10:5:0.005:1配比而成，瓊脂粉適量，初始pH 5.0，121℃高壓滅菌30min。
配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B2、磷酸二氫鉀按照10:5:0.005:1配比而成，初始pH 5.2，121℃高壓滅菌30min。
將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化，本實(shí)施例中活化采用28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天備用。
取菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，本實(shí)施例中于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6天。再利用內(nèi)切式勻漿機(jī)以5000r/min、1min將培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液，充分振蕩備用。
將種子發(fā)酵懸液以5.0％(v/v)的接種量加入100mL液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)即制得含漆酶的溶液。
取含漆酶的溶液在4℃、12000r/min下離心15min，所得上清液即為粗酶溶液。
取制得的粗酶溶液測(cè)定漆酶活性，得本實(shí)施例的漆酶活性為102.22U/L。
實(shí)施例二
配置固體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B1、磷酸二氫鉀按照20:1:0.01:1.5配比而成，瓊脂粉適量，初始pH 5.2，121℃高壓滅菌30min。
配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸粉、維生素B2、磷酸二氫鉀按照20:1:0.01:1.5配比而成，初始pH 5.2，121℃高壓滅菌30min。
將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化，本實(shí)施例中活化采用28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天備用。
取菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，本實(shí)施例中于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6天。再利用內(nèi)切式勻漿機(jī)以5000r/min、1min將培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液，充分振蕩備用。
將種子發(fā)酵懸液以5.0％(v/v)的接種量加入100mL液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)即制得含漆酶的溶液。
取含漆酶的溶液在4℃、12000r/min下離心15min，所得上清液即為粗酶溶液。
取制得的粗酶溶液測(cè)定漆酶活性，得本實(shí)施例的漆酶活性為107.22U/L。
實(shí)施例三
配置固體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B1、磷酸二氫鉀按照20:3:0.005:2配比而成，瓊脂粉適量，初始pH 5.0，121℃高壓滅菌30min。
配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸粉、維生素B1、磷酸二氫鉀按照20:3:0.005:2配比而成，初始pH 5.0，121℃高壓滅菌30min。
將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化，本實(shí)施例中活化采用28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天備用。
取菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，本實(shí)施例中于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6天。再利用內(nèi)切式勻漿機(jī)以5000r/min、1min將培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液，充分振蕩備用。
將種子發(fā)酵懸液以5.0％(v/v)的接種量加入100mL液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)即制得含漆酶的溶液。
取含漆酶的溶液在4℃、12000r/min下離心15min，所得上清液即為粗酶溶液。
取制得的粗酶溶液測(cè)定漆酶活性，得本實(shí)施例的漆酶活性為110.67U/L。
實(shí)施例四
配置固體培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸粉、維生素B2、磷酸二氫鉀按照20:5:0.02:0.5配比而成，瓊脂粉適量，初始pH 4.5，121℃高壓滅菌30min。
配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、酵母浸粉、維生素B1、磷酸二氫鉀按照20:5:0.02:0.5配比而成，初始pH 4.8，121℃高壓滅菌30min。
將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化，本實(shí)施例中活化采用28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天備用。
取菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，本實(shí)施例中于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6天。再利用內(nèi)切式勻漿機(jī)以5000r/min、1min將培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液，充分振蕩備用。
將種子發(fā)酵懸液以5.0％(v/v)的接種量加入100mL液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)即制得含漆酶的溶液。
取含漆酶的溶液在4℃、12000r/min下離心15min，所得上清液即為粗酶溶液。
取制得的粗酶溶液測(cè)定漆酶活性，得本實(shí)施例的漆酶活性為149.11U/L。
實(shí)施例五
配置固體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B2、磷酸二氫鉀按照20:7:0.015:1配比而成，瓊脂粉適量，初始pH 4.5，121℃高壓滅菌30min。
配置液體培養(yǎng)基：葡萄糖、蛋白胨、維生素B1、磷酸二氫鉀按照20:7:0.015:1配比而成，初始pH 4.5，121℃高壓滅菌30min。
將白黃小薄孔菌于固體培養(yǎng)基上活化，本實(shí)施例中活化采用28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天備用。
取菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，本實(shí)施例中于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6天。再利用內(nèi)切式勻漿機(jī)以5000r/min、1min將培養(yǎng)物制成種子發(fā)酵懸液，充分振蕩備用。
將種子發(fā)酵懸液以5.0％(v/v)的接種量加入100mL液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)即制得含漆酶的溶液。
取含漆酶的溶液在4℃、12000r/min下離心15min，所得上清液即為粗酶溶液。
取制得的粗酶溶液測(cè)定漆酶活性，得本實(shí)施例的漆酶活性為109U/L。
通過(guò)以上實(shí)施舉例，本發(fā)明之精神對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言已經(jīng)能夠清楚地掌握，所以，在本發(fā)明中未明確給出的另外的特征、優(yōu)點(diǎn)和實(shí)施方案對(duì)于查看了本發(fā)明的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是清楚的，因此，應(yīng)該理解，吸取了本發(fā)明之后對(duì)本發(fā)明所作出的修飾和改進(jìn)都在本專(zhuān)利的保護(hù)范圍之內(nèi)，對(duì)于在本發(fā)明的基礎(chǔ)上作出的變劣性技術(shù)方案也屬于本專(zhuān)利的保護(hù)范圍內(nèi)。